Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwerfen und fertigen eine zebrafischembryo Vorlage, gefolgt von ein detailliertes Verfahren für die Verwendung dieser Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos Anordnung in einer 96-Well-Platte anordnen.

Zusammenfassung

Der Zebrabärbling ist ein weltweit anerkannter Süßwasser Organismus häufig in Entwicklungsbiologie, Umwelttoxikologie und Krankheit beim Menschen verwandten Forschungsgebieten. Dank seiner einzigartigen Eigenschaften, einschließlich große Fruchtbarkeit, Embryo Transluzenz, schnelle und gleichzeitige Entwicklung, etc.Zebrafisch-Embryonen werden häufig verwendet für groß angelegte Toxizität Bewertung von Chemikalien und Drogen/Compound Screening. Eine typische Screening-Verfahren beinhaltet Erwachsenen Zebrafisch laichen, Embryonen Auswahl und Anordnung der Embryonen in Multi-well-Platten. Von dort aus Embryonen sind Belichtung und die Toxizität von Chemikalien ausgesetzt, oder die Wirksamkeit der Medikamente/Verbindungen kann relativ schnell anhand der phänotypischen Beobachtungen ausgewertet werden. Zwischen diesen Prozessen ist Embryonen anordnen eine zeitraubende und arbeitsintensive Schritte, die den Durchsatz begrenzt. In diesem Protokoll präsentieren wir ein innovatives Konzept, das macht die Verwendung einer 3D-gedruckten arraying Vorlage in Verbindung mit-Manipulation Vakuum um diesen mühsamen Schritt zu beschleunigen. Das Protokoll hierin beschreibt das Gesamtdesign der arraying Vorlage, eine detaillierte Versuchsaufbau und Schritt für Schritt Verfahren, gefolgt von repräsentative Ergebnisse. Bei der Implementierung sollte dieser Ansatz in einer Vielzahl von Anwendungen in der Forschung mit Zebrafisch-Embryonen als Tests Themen vorteilhaft.

Einleitung

Als beliebter Modellorganismus ist in den Bereichen Medizin und Toxikologie^1,2,3,4Zebrafisch verbreitet. Im Vergleich zu in-vitro- Plattformen, Zebrafisch bieten viel höherer biologischen Komplexität, dass ein oder zwei Zelltypen nicht bieten konnte. Abgesehen davon, dass ein Organismus, Modell, dem Zebrafisch-große Fruchtbarkeit, schnelle und gleichzeitige Embryonalentwicklung und hohen Orgel Transluzenz haben gegeben, dieses Modell einzigartige Vorteile für groß angelegte Toxizität oder Drogen/Verbund screening-⁵verwendet werden. Die Hunderte von Embryonen, die jede Woche von ein paar Erwachsene Zebrafisch produziert haben übertreffen alle anderen ganz Tiermodellen und es für Hochdurchsatz-Screening geeignet.

Eine typische Screening-Verfahren mit Zebrafisch beinhaltet eine erhebliche Menge an Handarbeit, wie Erwachsene Zebrafisch laichen, Embryo Auswahl und Anordnung von Embryonen in geeigneten Behältern, wo sie auf die Exposition durch Eintauchen in Wasser ausgesetzt sind. Die Entwicklung der Embryonen wird überwacht und beobachtbaren Endpunkte wie Sterblichkeit, Schlupfrate und Anomalie sind oft manuell ausgewertet und als vorläufige Identifikationen der Toxizität von Chemikalien oder Hinweise auf die Wirksamkeit der Drogen oder Verbindungen. Um die Screening-Verfahren zu beschleunigen, wurden zuvor Ansätze wie automatisierte Imaging- und computergestützte Bildanalyse untersucht. Beispielsweise wurden Mikroskope mit hohem Gehalt imaging-Funktionen führen Sie automatisierte Hellfeld oder Fluoreszenz-Bildgebung auf Zebrafish Embryos in verschiedenen Entwicklungsstadien von 96/384-well-Platten⁶angepasst. Mikrofluidische Geräte gepaart mit Mikroskopen dienten zebrafischlarven durch aktuellen Bearbeitung für die Bildgebung des Gehirns Neuronen⁷positionieren. Diese Ansätze könnten die Effizienz der Bild Akquisitionen im Vergleich zum traditionellen manuellen Betrieb erheblich verbessern. Darüber hinaus wurden mit großen Anzahl von Bildern erzeugt werden, Bild-Analyse-Tools auch entwickelt, um die Verarbeitung der Daten zu beschleunigen wie Liu Et Al. und Tu Et Al. zeigen ^{8 , 9}.

Der Durchsatz der Bildverarbeitung und Bildanalyse erhöht, wurde es klar, dass die Bandbreitenbegrenzung Schritt für das Screening liegt in den Prozess der Exposition, die in der Regel bedeutet, wobei sie in 96 oder 384-Well-Platten Zebrafish Embryos vorbereiten. Um diesen Engpass Schritt zu lösen, Vision-geführte Robotik von Mandrell Et Al. entwickelt wurden ¹⁰ und uns¹¹ zuvor, manuelle Handhabung aber die Instrumente zu ersetzen waren eher anspruchsvoll und es gibt eine Tiefe Lernkurve, solche Techniken umzusetzen. Daher bieten ein easy-to-Use-Ansatz ist ein wichtiger Faktor, der Durchsatz Zebrafisch-Screening weiter zu verbessern und das Hauptziel dieser Arbeit ist.

In dieser Arbeit wir konstruiert und gefertigt einen Embryo, die Vorlage von 3D-Druck anordnen. Eine arraying Vorlage wurde entwickelt, um Zebrafish Embryos in Vertiefungen, die mit einer standard 96-Well-Platte passen zu fangen. Anstelle von Embryonen auswählen und anordnen sie in einzelnen Brunnen eins nach dem anderen, könnte man Embryo Einschluss und Array alle 96 Embryonen in einem mehrlagigen Teller auf einmal durchführen. Mit dieser Vorlage und das folgende Protokoll, konnte man deutlich steigern die Effizienz der Embryonen in mehrlagigen Platten, die im Begriff Schub würde die Screening-Kapazität mindestens das Zehnfache, im Vergleich zu manuellen Betrieb anordnen. Die nachfolgend beschriebene Protokoll beinhaltet eine Gesamtkonzeption für die Anordnung der Vorlage, Zebrafisch laichen, Embryo-Sammlung und Anordnung. Abbildung 1 zeigt das gesamte Design der arraying Vorlage. Abbildung 2 zeigt eine Übersicht des Protokolls Schritt für Schritt über die Verwendung der Vorlage in den Teilen 3 und 4 beschrieben.

Protokoll

1. Design und Fertigung von einem Zebrafish Embryos anordnen Vorlage

1. Entwerfen Sie die arraying Vorlage mit einem 12 x 8, 96-Well-Layout, das eine standard 96-Well-Platte passt. Verwendung der Dimensionen in Figur 1A für die oberen Embryo Einklemmung Kammer aufgeführt (siehe auch die ergänzenden Datei).
   1. Verwenden Sie die Maße, die in Abbildung 1 b und 1D für die Verlockende Falle gut gezeigt.
   2. Verwenden Sie die Maße für die Vakuumkammer unten in Abbildung 1 .
   3. Verwenden Sie die Maße für die Luft im in Abbildung 1 b / Outlet.
2. Verwenden Sie einen 3D-Drucker (mit 0,1 mm Genauigkeit) die Vorlage drucken; siehe Tabelle der Materialien für empfohlene Harz für den Druck verwendet werden.
   Hinweis: 3D Drucker mit einer Genauigkeit von 0,1 mm werden für die Herstellung der arraying Vorlage empfohlen (siehe Tabelle der Materialien). Die empfohlene Farbe für die Fläche der Vorlage ist dunkelgrau oder schwarz.

(2) Zebrafischembryo Laichen

1. Legen Sie zwei Paare von männlichen und weiblichen Fische pro Paarung Box einen Tag vor der Laichzeit. Getrennten Männchen und Weibchen durch einen durchsichtigen Kunststoff Teiler.
2. Nehmen Sie den Teilern morgens, männliche und weibliche Fische zu mischen.
3. Entfernen Sie die männlichen und weiblichen Fische und sammeln Sie Zebrafisch-Embryonen mit einem feinmaschigen Sieb zu. Waschen Sie die Embryonen mit Ei 250 mL Wasser (siehe Tabelle der Materialien).
4. Übertragen Sie die gesammelten Embryonen auf Petrischalen (90 mm Durchmesser) mit Holtfreter Lösung (siehe Tabelle der Materialien) und Tote und unbefruchtete Embryonen mit einem Stereomikroskop zu entfernen.
5. Legen Sie die Embryonen in einem Inkubator 28,5 ° C. Um 4 Uhr post Düngung (hpf), beobachten die Embryonen und entfernen Sie alle Toten und ungesunden Embryonen. Die Embryonen sind nun bereit für den nächsten Schritt.

3. Vorbereitung der Vorlage anordnen

1. Waschen Sie die Vorlage 2 – 3 Mal mit 500 mL entionisiertem Wasser und steckte es in den Trockenofen (45 ° C) für 5 min.
2. Kleben Sie die untere Kammer mit einem Stück des Versiegelns Film (Bild 2Schritt 1).
3. Verbinden Sie eine Vakuum-Pumpe durch den Luftauslass an der Unterseite der Vorlage.
   Hinweis: Die empfohlene max. Vakuum für die Vakuumpumpe ist 0,1 Mpa. Beachten Sie die Stärke des Vakuums verwendet. Wenn der Unterdruck zu stark ist, schneiden Sie eine kreuzförmige Loch auf der Siegelfolie, den Druck zu senken.

4. Anordnung Zebrafish Embryos in einer 96-Well-Platte

1. Mit einer Kunststoff transferpipette, legen Sie ca. 150 Embryonen in die Vorlage, wie in Abbildung 2, Schritt2 gezeigt.
2. Verbinden Sie die Vakuumpumpe bis zum ausblas Unterdruck in der Kammer von der Siegelfolie in Schritt 3.3 versiegelt zu generieren.
3. Schütteln Sie die gesamte Vorlage horizontal, bis jeder auch ein Embryo gefangen (Abbildung 2, Schritt 3 hat).
   Hinweis: Wenn die Holtfreter Lösung trocknet, bevor die Embryonen in jedem Bohrloch gefangen sind, fügen Sie zusätzliche Holtfreter Lösung in der Einklemmung Kammer hinzu und wiederholen Sie diesen Schritt.
4. Entsorgen Sie zusätzliche Holtfreter Lösung und Embryonen, die nicht in den Brunnen (Abbildung 2, Schritt 4) eingeschlossen sind.
5. Schalten Sie aus und trennen Sie die Vakuumpumpe.
6. Legen Sie eine standard 96-Well-Platte umgedreht gegen die Vorlage (Abbildung 2, Schritt 5) und drehen Sie beide zur gleichen Zeit (Abbildung 2, Schritt 6).
7. Tippen Sie auf der Unterseite der Vorlage oder die Luft verbinden Steckdose, um ein komprimiertes Gas Abstauben kann um alle eingeschlossenen Embryonen aus der Vorlage auf die 96-Well-Platte (Abbildung 2, Schritt 6) übertragen.
8. Wiederholen Sie Schritt 4.1 bis 4,8, zusätzliche Multi-well-Platten vorzubereiten.
9. Der Siegelfolie entfernen und Waschen der Vorlage 3 Mal von oben bis unten mit 500 mL entionisiertem Wasser für eine spätere Verwendung.
   Hinweis: Verwenden Sie organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, nicht um die Vorlage zu reinigen.

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt eine typische 3D-gedruckten arraying Vorlage. Diese Vorlage verwendet lichtempfindliche Harz als Rohstoff und wurde von einem 3D-Drucker gemacht; eine Schicht aus schwarzem Lack wurde angewandt, um einen besseren Kontrast zur Farbe der Embryonen zur Verfügung zu stellen. Die Position von 96 Wells (12 x 8) wurde entwickelt, um mit einer standard 96-Well-Platte passen. Ebenso eine 384 (24 x 16) gut Vorlage könnte auch so konzipiert und herge...

Diskussion

Es gibt zwei wichtige Schritte in diesem Protokoll, die Aufmerksamkeit für eine erfolgreiche Umsetzung der 3D-Druck Vorlage erfordern für Anordnung Zebrafisch-Embryonen.

Der wichtigste Faktor auf die Gestaltung der arraying Vorlage ist die Einklemmung. Macht sicher gibt es nur einen Embryo in jedes gut gefangen, man sollte achten Sie besonders auf den Durchmesser und die Tiefe des Brunnens Verlockende Falle, und der Durchmesser der Durchgangsöffnung. Der empfohlene Durchmesser ist innerhalb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Facility	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
Mating box	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
Sodium chloride	Vetec	V900058-500G
Potassium Chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20011160
Sodium bicarbonate	Vetec	v900182-500G
Methylene Blue Hydrate	TCI	M0501
Hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011008
Sea Salts	Instant Ocean	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
Controlled Drop Pasteur Pipet	Fisherbrand	13-678-30
Microscope	OLYMPUS	SZ61
Biochemical incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	LRH-250
3D printer	UnionTech	Lite600
Photosensitive resin	UnionTech	UTR9000
Vacuum pump	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate Seals	Solarbio	YA0245
96 well plate	Costar	3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl	Eppendorf	3122000.051
Compressed Gas Duster	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI Water	Thermo	GenPure Pro UV/UF
Drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
System water			Water out of the facility’s water system
Egg water			Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solution			Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water