Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Resumen

Proteínas in vivo, a menudo forman parte de grandes complejos macromoleculares donde dinámica y especificidad de unión al final dicta salidas funcionales. En este trabajo, la toxina del ántrax pre-endosomal es montada y la transición en el complejo endosomal. En primer lugar, el dominio N-terminal de un factor letal mutante de cisteína (LF_N) se une a un biosensor de interferometría (BLI) de biocapa por disulfuro de acoplamiento en una orientación óptima, permitiendo prepore antígeno protector (PA) enlazar (K_d 1 nM). La LF_N-PA óptimo orientado_prepore complejo entonces se une a soluble capilar morfogénico Gen-2 (CMG2) receptor de superficie celular (K_d 170 pM), resultando en un complejo de pre-endosomal ántrax representativo, estable a pH 7,5. Este complejo montado después es sometida a representante de acidificación (pH 5.0) del último endosome entorno a la PA_prepore la transición en el estado de poro de membrana insertada. Este estado de_poro PA da lugar a un enlace débil entre el receptor CMG2 y la LF_N-PA el_poro y una considerable disociación de CMG2 desde el poro de transición. El tio-accesorio de LF_N a la superficie del biosensor se invierte fácilmente por Ditiotreitol. Reducción en la superficie del biosensor BLI libera el LF_N-PA_prepore-complejo ternario CMG2 o el ácido transición complejos de_poro LF_N-PA en volúmenes de microlitros. Complejos liberados son luego visualizaron e identificaron con microscopía electrónica y espectrometría de masas. Estos experimentos demuestran cómo supervisar el montaje y desmontaje cinético de complejos de proteínas específicas con metodologías BLI libre de etiqueta y evaluar la estructura y la identidad de estos BLI montado complejos por microscopia electrónica y masa espectrometría, respectivamente, mediante los procedimientos secuenciales de fácil de replicar.

Introducción

Identificar y comprender la especificidad proteína complejo montaje en vivo es de extremo interés para los investigadores bioquímicos. Montajes de grandes proteínas heterogéneas son la norma más que la excepción. Esta noción es apoyada por monitoreo espectroscópicas en vivo Asamblea, aislar complejos usando suaves técnicas de interrupción de la célula, evaluar los productos de los métodos de purificación basada en afinidad y visualizarlos con alta resolución microscopia electrónica criogénica (cryo-EM). Para entender el control de la especificidad de la Asamblea dentro de la célula, los investigadores deben habitualmente aislar, identificar y finalmente caracterizar estas estructuras dinámicas de montaje/desmontaje. La herramienta molecular más utilizada para identificar los componentes de estos conjuntos con frecuencia requiere inmunoprecipitación basados en anticuerpos, que se basa en mantener la estabilidad de complejo durante la interrupción de la célula. Varias técnicas analíticas acopladas fueron desarrolladas recientemente para capturar complejos de muestras de células utilizan enfoques de microfluídica basada, como resonancia de plasmón superficial (SPR). Después del retiro de las superficies de la SPR, estas muestras fueron analizadas por el tiempo de desorción/ionización láser asistida por matriz de vuelo (MALDI-TOF)^1,2. Promover esta metodología utilizando protocolos más fácil permitirá a los investigadores visualizar y validar complejos previstos que ocurren en el medio celular. Ya que la SPR es un sistema de microfluidos, a menudo surgen problemas de la formación de agregados. Eludir este problema requiere dilución de la muestra, que a su vez, puede disminuir la integridad de los complejos biológicos responsables de la concentración.

Un avance relativamente reciente en tecnologías libre de etiqueta es el desarrollo de la biocapa interferometría (BLI) sistema³. Estos reflectancia luz particular emulan sistemas de replicación, o mejor, Unión de SPR y cinéticos resultados a una fracción del costo^3,4 sobre todo si se usan unidades de canal único. BLI mide los cambios en los patrones de interferencia de la luz reflejada entre una capa de referencia (control) y la superficie de la biocapa (experimental). El cambio resultante en la fase se mide en tiempo real como una lectura cinética y cuantitativos⁵. La superficie del biosensor, que contiene químicos de inmovilización específica, se traslada físicamente entre soluciones, frente a cambios de tampón por enfoques de microfluidos en SPR, para medición a través de desviaciones de fase de longitud de onda. Se evitan los efectos de transferencia de masa por agitar la solución. A diferencia de la SPR, estos sistemas son muy útiles en la evaluación de complejos de muestras biológicas crudas. El parámetro físico medido durante experimentos BLI principalmente depende de un cambio de masa o espesor en la superficie del biosensor que resulta de la proteína complejo ensamblaje o desensamblaje.

Estos biosensores ópticos de fibra son relativamente barato y fácil de usar. Uno de los aspectos útiles emergentes de BLI es la fácil eliminación de complejos de la proteína recién montado desde la superficie. Una reciente aplicación de este método permitida a nuestro laboratorio para observar la cinética en tiempo real de gran escala pH inducido por el cambio de estructura de la proteína del componente de antígeno protector (PA) de toxina de ántrax como prepore (PA_prepore) la transición a su forma de poro (PA_{los poros}). Esta transición en la punta del biosensor se verificó mediante microscopia electrónica (EM)⁶. Eliminación de complejos de superficies biosensores evita efectos de dilución de volumen más grandes frecuentemente encontrados al liberar complejos de superficies de chip al utilizar sistemas de microfluidos.

En el presente trabajo, complejos de toxina de ántrax son montados y desmontados en la superficie del biosensor y luego liberados en volúmenes de microlitros. Los componentes complejos resultantes se validan ortogonalmente utilizando EM y espectrometría de masas (MS).

Protocolo

1. montaje de complejos macromoleculares definidos en las superficies de Biosensor de biocapa interferometría (BLI)

1. Asamblea de toxina de ántrax prepore compleja en una superficie de biosensor reactivos amina PDEA-modificado
   1. Hidratar una amina reactiva segunda generación (AR2G) BLI biosensor punta 250 μl de agua durante diez minutos.
   2. Programar tiempos de paso, enumerados en la tabla 1, en el software de control de la unidad BLI (véase Tabla de materiales).
   3. Iniciar el BLI por sumergir la punta del biosensor en 250 μl de agua de 30 s para medir una línea de base inicial de biosensor de espesor y densidad.
   4. Activar el biosensor sumergiendo la punta en 250 μl NHS (N-hydroxysuccinimide) de 50 mM y 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) durante 7 minutos.
   5. Sumerja el biosensor activado en 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) disuelto en tampón de borato de 0,1 M (pH 8,5) durante 5 minutos para generar una superficie reactiva tiol activada.
   6. Sumerja el biosensor tiol-reactiva activado en 250 μl de solución que contiene 100 nM E126C LF_N de 10 mM sodio acetato pH 5.0, 100 mM NaCl, buffer por 5 minutos.
   7. Sumerja la punta LF_N en 50 mM de L-cisteína, 1 M NaCl, acetato de sodio de 0.1 M, pH 5,0, durante 4 minutos, para calmar cualquier grupos tiol-reactivo libres reactivos restantes.
   8. Sumerja la punta LF_N apagada en 50 mM Tris, 50 mM NaCl durante 2 minutos para establecer línea de base buffer.
   9. Sumerja la punta de LF_N apagada en prepore de antígeno protector de 0.5 μm (PA_prepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl durante 5 minutos para crear el LF_N-PA_prepore complejo.
   10. Una vez PA_prepore se asocia, retire la punta de la solución del_prepore PA y sumerja la punta en 50 mM Tris, 50 mM NaCl durante 30 segundos para eliminar cualquier no específicamente PA_prepore.
   11. Sumerja la LF_N-PA_prepore complejo en receptor CMG2 de 0.5 μm (sin el dominio de transmembrana), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, durante 5 minutos.
   12. Sumergir_NLF -PA_{prepore -}CMG2 complejo en 50 mM Tris, 50 mM NaCl durante 30 segundos para lavar lejos cualquier CMG2 forma complejo de pre-endosomal.
   13. Para el análisis de la EM, suelte el LF_N-PA_prepore-CMG2 complejo desde la punta de biosensor sumergiendo la punta en 5 μl de 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, dentro de un tubo PCR.
   14. Para el análisis de los péptidos del complejo en tándem MS, suelte el LF_N-PA_prepore-CMG2 complejo desde la punta de biosensor sumergiendo el biosensor en 5 μl 50 mM DTT, 6 M GuHCl (libre de queratina), pH de bicarbonato de amonio 25 mM 8.0 dentro de una polimerización en cadena tubo . Esto se realiza en un biosensor diferente a la usada para el análisis de la EM.
2. Asamblea de toxina de ántrax poro compleja en la superficie de biosensor reactivos amina PDEA-modificado
   1. Para ver el complejo después de la transición de pH, realizar pasos 1.1.1-1.1.12 en la sección anterior para generar el_N-PA LF_prepore-CMG2 complejo.
   2. Sumerja la punta del biosensor en un 10 mM de acetato pH 5.0 durante 5 minutos para iniciar la transición de PA_prepore transición_poro PA. Esta transición se indica mediante el aumento de amplitud (aproximadamente 0.2 nm) seguido por un descenso de amplitud más grande que se presume que la disociación del receptor completa o sustancial debido a disminuida afinidad.
   3. Sumerja la punta de_{los poros} de LF_N-PA en 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, durante 30 segundos para lavar tampón ácido.
   4. Para la muestra de análisis de EM, sumerja la punta del biosensor en una solución que contiene micelas de 1,25 mM (2,5 mM MSP1D1, 25 mM de Na-Colato, 162,5 POPC) durante 5 minutos para evitar la agregación en solución después de que lanzamiento de disulfuro.
   5. Para el análisis de la EM, suelte el LF_N-PA_{poro -}micelas complejas de la extremidad del biosensor sumergiendo la punta en 5 μl de 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl dentro de un tubo PCR.
   6. Para análisis de MS tandem de los péptidos del complejo, suelte el LF_N-PA_poore complejo (no micelar) de biosensor punta sumergiendo el biosensor en 5 μl 50 mM DTT, 6 M GuHCl (libre de queratina), pH de bicarbonato de amonio 25 mM 8.0 dentro de una polimerización en cadena tubo. Esto se realiza en un biosensor diferente a la usada para el análisis de la EM.

2. visualizar y validar lanzaron asambleas macromoleculares de biosensores BLI por microscopía Tinción negativa

1. Resplandor descarga de una red de 300 Cu recubiertas de carbón. Brillo típico descarga ajustes son 0,38 mBar presión de atmósfera estable, negativa 15 mAmps, 20 segundos, luego ventilar con el aire.
2. Red segura entre un par de pinzas limpias.
3. Pipetear 4 μL de la muestra complejo lanzado en tubo PCR en la red y permiten la adsorción de los años 60.
4. Distancia restante líquido con una cuña de papel de filtro del fieltro.
5. Mancha de la rejilla por pipeteo 5 μl de formato de uranilo de 0,75% 0,02 micrones filtra y absorbe la mancha exceso lejos después de 5 segundos. Permita que la rejilla secar a temperatura ambiente.
6. Ver muestra teñida rejillas usando un microscopio electrónico de transmisión.

3. identificación del complejo completo Pre-endosomal de ántrax toxina (LF_N-Pa_prepore-CMG2) y la transición compleja (LF_N-Pa_poro sin CMG2) utilizando espectrometría de masas.

1. Diluir muestras lanzadas a 20 μl e incubar durante 1 hora.
2. Añadir 2 μl de Yodoacetamida 55 mM, bicarbonato de amonio 25 mM, pH 8.0 e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad (cubierta con papel de aluminio).
3. Diluir la muestra con 100 μl de 25 mM de bicarbonato de amonio, pH 8.0, para reducir la concentración de clorhidrato de guanidina por debajo de 1 M.
4. Añadir 5 μl de la secuenciación modificado grado de tripsina en 20 ng/μl e incubar a 37 ° C durante la noche.
5. Agregar ácido acético glacial a una concentración final de 5% para reducir el pH a < 3, entonces reducir el volumen a 10 μL en concentrador de vacío.
6. Transferir la solución del péptido a la placa de la muestra en los muestreadores de la nLC 1200 uHPLC.
7. 5 μl de la solución del péptido en una columna de fase reversa de uHPLC montada en la etapa de ionización de la MS de la carga.
8. Lavar la columna con 15 μl de 0,1% de ácido fórmico en una velocidad máxima de 5 μL/min y presión máxima de 800 psi.
9. Eluir los péptidos de la columna de fase inversa C18 con un caudal de 350 nL/min durante un período de 90 minutos utilizando un gradiente lineal de 5% a 40% de disolvente B en A + B (solvente A: 0,1% fórmico ácido; solvente B: 95% acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico).
10. Análisis de péptidos liberador en línea usando tándem MS.
    1. Establecer la fuente de ionización a 2500 voltios y la temperatura de transferencia de iones a 250 ° C.
    2. Operar el espectrómetro de masas bajo control automático a realizar continuamente un análisis MS seguido por tantos tándem MSM como sea posible en un período de 3 s, con CID y una energía de colisión normalizada de 35.
11. Identificar los componentes péptidos y proteínas mediante métodos estándar. Para este trabajo, se realizaron dos series de análisis de péptidos y proteínas.

Resultados

La capacidad de supervisar y validar la Asamblea de grandes complejos macromoleculares es un paso crucial hacia la comprensión de la especificidad y función de biomoléculas grandes asambleas. Los resultados de los métodos presentados en este documento demuestran la facilidad con la que grandes complejos (> 150 kDa masa) se puede montar mediante interferometría de biocapa, todo mientras la cinética y la amplitud de la Asamblea. La única naturaleza compacta de la superficie del biosensor permite el análisis de la Asamblea que se extenderá por liberación de complejos montados en microvolúmenes pequeño. Estos microvolúmenes pueden utilizarse para visualizar la estructura física inicial de los complejos utilizando EM y para verificar la identidad de los componentes complejos utilizando MS. Un Resumen esquemático de todo este proceso se muestra en la figura 1.

Un elemento clave para la exitosa asamblea y verificación del complejo macromolecular en la superficie del biosensor consiste en la orientación correcta de la proteína de la semilla inicial. Esto asegura que los sitios de interacción proteína-proteína son accesibles, no sterically bloqueado y óptimamente situado lejos de la superficie del biosensor. Como se muestra en la figura 2, la orientación correcta de la toxina del ántrax complejo se logra utilizando un fragmento N-terminal específicamente diseñado del factor letal (LF_N) para el sitio de unión del_prepore LF_N-PA esté siempre contrario del biosensor accesorio covalente sitio^6,7. La subsecuente acumulación del complejo con el atascamiento del PA para el biosensor de LF_N BLI seguido soluble CMG2 atando a PA en última instancia crea una toxina ántrax competente de translocación compleja.

El rastro de sensogram BLI es una lectura en tiempo real de los cambios de amplitud debido a la adición específica de los componentes de la toxina del ántrax, medida que se agregan en el biosensor. Figura 3 muestra con que una traza representante junto un modelo del complejo predijo a la forma en paso en el proceso. La primera ascensión es LF_N carga en la punta. Después de Temple y línea de base, PA_prepore se une entonces a LF_N seguido de la adición del receptor soluble de CMG2 dando como resultado el complejo montado pre-endosomal de LF_N-PA_prepore-CMG2. Para avanzar hacia el último entorno de endosome, todo el conjunto se somete a un pulso de pH bajo (pH 5.0) que debilita el receptor vinculante, permitiendo prepore transición a su conformación de poro de membrana extendida insertada. ⁶ Sensogram huellas del paso de acidificación se muestran en la figura 4. El aumento inicial o 'espiga' en amplitud es probable que la extensión de poro⁶ que deben ocurrir antes de la disminución en el atascamiento del receptor CMG2. La disminución de la amplitud más grande es más probable disociación del receptor completa o sustancial debido a la disminución de la afinidad. Trabajo previo en este laboratorio indicó CMG2 vinculante a la totalmente extendida PA el_poro es insignificante en comparación con el PA CMG2_prepore interacción⁶. Además, el rastro cinética sensogram, observado en todos sensograms de LF_N-PA_prepore-CMG2 transiciones a LF_N-PA_{los poros} con una disminución del pH, es reproducible tramos múltiples.

Antes y después de la acidificación, los complejos de biosensor conectado se liberan fácilmente para visualización por tinción negativa EM e identificación por MS (figura 5). Complejos representativos de los resultados de EM se muestran en la figura 6. Rejillas de la muestra del pre-endosomal, Mostrar densidades compatibles con complejos ternarios intactos de LF_N-PA_prepore-CMG2. Redes complejas post acidificación, show PA la transición para los poros y solubilizado por la inclusión de la micela no densidad CMG2 obvio.

La identidades de los pre- y post acidificación complejos fueron verificados por MS. Una base de datos donde las secuencias de PA, P13423; LF_N, P15917; y CMG2, P58335 se incluyeron en un fondo de una base de datos de proteínas de ratón derivada el repositorio NCBInr. Sólo las proteínas de interés se obtuvieron de esta primera búsqueda de base de datos, con la siguiente cobertura de aminoácidos para los complejos ternarios y binarios: el 54% y 22% para PA, 36% y 6% para LF y 43% para CMG2, respectivamente (CMG2 no fue detectada en el complejo binario). Para maximizar la cobertura de aminoácidos de la proteína, una segunda identificación del péptido de la proteína se realizó mediante una base de datos de proteínas que contiene sólo las tres proteínas de interés. Pre-endosomal MS muestras contenían péptidos de todos los componentes de tres toxinas 60.46% 67.97% y cobertura del 54.15% LF_N, PA y CMG2, respectivamente (figura 7). Resultados post-endosomal, se muestra en la figura 8, sólo contenían péptidos de LF_N y PA (57.41% y 67.79% de cobertura, respectivamente). La falta de CMG2 en las muestras post-endosomal son consistente con la disminución de nm BLI observada durante la formación del poro.

Figura 1. Descripción esquemática para el análisis de complejos de proteína ensamblada en y aislada de biosensor BLI utilizando EM y MS. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Activación del biosensor: primer paso en Asamblea específica orientación en biosensores BLI. El dominio N-terminal del Factor letal E126C, (LF_N) está vinculado a través de un acoplamiento de tio creando la interfaz de enlace_prepore PA correctamente orientada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Control de ántrax toxina montaje y desmontaje con BLI: la sensogram muestra cambios de amplitud en función del tiempo debido a la adición específica de lo ántrax toxina componentes se añaden en el biosensor a partir de la carga LF_N (paso 4 en Tabla 1). PA_prepore se carga entonces sobre la superficie, seguida por la adición de receptor soluble CMG2. El complejo de pre-endosomal ensamblado consta de un LF-PA_prepore- CMG2. Para avanzar hacia el último entorno de endosome, todo el ensamble funcional ántrax toxina se somete a un pulso de pH bajo (pH 5.0) que debilita el receptor vinculante, permitiendo prepore transición a su conformación de poro de membrana extendida insertada. Exposición de la membrana que atraviesan poro es confirmada y solubilizada por la adición de micelas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Sensogram BLI de liberación CMG2: rastros del paso de acidificación muestran un incremento inicial o 'spike' amplitud seguida de una disminución de amplitud más grande que los poros formación y disociación del receptor, respectivamente. Líneas rojas punteadas verticales denotan el comienzo de un nuevo paso. Sensograms están alineados en la negrita línea roja de puntos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Análisis complejos de la proteína ensamblada en y aislada de biosensor BLI con EM y MS: Biosensor complejos conectados se liberan fácilmente en 5 μl de tampón que contiene TDT para visualización por tinción negativa EM e identificación por MS. por favor haga clic aquí para Vea una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Visualización de complejos de proteínas con EM: rejillas de muestra Pre-endosomal, Mostrar densidades compatibles con complejos ternarios intactos de LF_N-PA_prepore-CMG2. Redes complejas post-endosomal, show PA la transición para los poros y solubilizados por micela con ninguna densidad CMG2 obvio. Modelos complejos previstos (lado izquierdo) están en la misma escala como partículas individuales que se muestra. Partículas coloreadas con la proteína prevista (basada en tamaño de densidad EM) se muestran debajo de cada partícula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Verificación de complejos de proteínas con MS: MS Pre-endosomal muestras contenían péptidos de todos los componentes de tres toxinas 60.46% 67.97% y cobertura del 54.15% LF_N, PA y CMG2, respectivamente. Péptidos en una tarifa falsa del descubrimiento (FDR) igual o superior al 5% se muestra en amarillo, FDR igual o superior al 1% se muestra en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Verificación de complejos de proteínas con MS: péptidos de muestras contenidas Post-endosomal de LF_N y PA (57.41% y 67.79% de cobertura, respectivamente), pero no CMG2. FDR igual o superior al 5% se muestra en amarillo, FDR igual o superior al 1% se muestra en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso	Tiempo (s)	Descripción
1	30	Línea de base inicial
2	420	Activación
3	300	Activación
4	300	N carga de LF
5	240	Temple de cisteína
6	120	Línea de base
7	300	Asociación deprepore PA
8	30	Línea de base
9	300	Asociación CMG2
10	30	Línea de base
11	300	Transición de ácido
12	30	Línea de base
13	300	Asociación micelar

Tabla 1. Tiempos de paso para solo BLI pase a complejo de la toxina del ántrax de Asamblea. Tenga en cuenta que las instantáneas se utilizan para lavar proteína de paso anterior y establecer una nueva línea de base buffer.

Discusión

Esta demostración ilustra cómo la formación de complejos macromolecular puede controlarse fácilmente mediante interferometría de biocapa, visualizado usando EM y se verificó con MS, con microvolúmenes en un corto plazo. Montaje estructural y complejos observados siguen las predicciones biológicamente relevantes, además validar esta metodología combinada. Como se mencionó en la sección de resultados, el elemento clave para el éxito de la Asamblea requiere cisteína racionalmente dirigido mutagénesis para asegurar que las interfaces complejas proteínas están correctamente orientadas lejos de la superficie del biosensor.

Los sistemas anteriores han utilizado técnicas BLI y MS para evaluar la Unión a proteínas de dos y tres sistemas de componentes, así como integridad de atascamiento del receptor de la proteína expresada, pero en ambos casos, los métodos no fueron desarrollados para aprovechar las ventajas del tándem EM/MS enfoque^8,9. Sólo otro interferometría sistema que combina el análisis por MS para ayudar a caracterizar las interacciones fue una polarización dual interferometría¹⁰. Desafortunadamente, este sistema ya no está disponible para uso general. Como se mencionó en la introducción, ha habido un número de estudios realizados donde las muestras fueron formadas en las superficies de biosensor de SPR-como y extraídas de análisis MS. Ninguno de esos ejemplos dio lugar a complejos visualizados usando EM.

Las limitaciones de este método secuencial pueden ser numerosos, pero son solubles. Para la inmovilización inicial y por lo tanto, paso de la Fundación de la Asamblea, la falta de conocimiento de las superficies de interacción estructural ciertamente impediría avances relacionados con la supervisión de las fases de montaje inicial. La falta de información de la estructura puede ser abordada mediante el diseño de una ingeniería Fundación construir donde químicos de fijación (e.g. sulfidrilo molécula por enlaces disulfuro / su etiquetado posicionamiento) se pueden mover a diversas regiones dentro de la base sistema de montaje. En el caso de la toxina del ántrax complejo, fue una suerte que la estructura del LF_N a PA_prepore está disponible¹¹. La colocación racional de la cisteína Ingeniería fue localizada a las regiones de la cara PA_prepore obligatoria. Con químicos de acoplamiento de cisteína, es preferible que no otras cisteínas reactivas están presentes en la superficie de la proteína.

Existen diversos químicos de accesorio que pueden utilizarse para diseñar el sitio de fijación específicos en las superficies de una proteína. Uno de los más populares accesorios específicos implica posicionar a una molécula de biotina a un lugar específicamente definido en la superficie de la proteína¹². Desafortunadamente, Unión de biotina avidina o estreptavidina cubrió superficies es muy apretada. Revocación de la interacción de enlace no es simple. El uso de una ingeniería su-etiqueta en la terminal N o C y la posterior facilidad de adhesión a superficies de Ni-NTA es una aplicación más universal de inmovilización de afinidad. Por supuesto, una de las salvedades para ingeniería sitios de accesorio de montaje con su etiquetado sistemas es el requisito que el termini N y C de la proteína de la Asamblea de base quedan expuestos y que la fijación es fácil. Como con todos los procesos de montaje, la interfaz de interacción de la proteína de la Asamblea de base deberá permanecer disponible conforme avanza la Asamblea compleja.

Quizás la preocupación más común de usar químicas superficie del biosensor es fijación no específica. Consejos de estreptavidina son a menudo una fuente de efectos significativos de fijación no específica. Disulfuro vinculado biotina se puede utilizar para liberar complejos muy específicos, dejando atrás el reducido acoplamiento S-biotina firmemente atado a estreptavidina inmovilizada biosensores¹³. Existen otros químicos reversibles convertirse en disponible como iminoboronates y a un menor grado ketoamide¹⁴. Este campo es actualmente subdesarrollado, pero existe gran interés en seguir desarrollando protocolos covalentes reversibles para evitar efectos de toxicidad de la droga fuera del objetivo que comúnmente acompañan el uso de desarrollo de fármacos específicos covalente.

Una limitación de utilizar EM para visualizar complejos es interpretación, especialmente en casos donde las estructuras de los complejos montados inicialmente no se conocen. La ubicación espacial de componentes dentro de un complejo macromolecular montado indefinido puede identificarse usando los anticuerpos monoclonales (mAb) como marcadores cinéticos y estructurales específicos. Por ejemplo, una vez que se forma un complejo, anticuerpos monoclonales puede añadirse que se unen a componentes específicos. Este método se utiliza con frecuencia en EM para identificar componentes específicos dentro de los grandes ensamblajes¹⁵. Otra limitación se relaciona con el tamaño del complejo, aunque ha habido casos donde asambleas simétricas definidas tan pequeñas como 70 kDa (heptamer GroES) son fácilmente resuelven utilizando negativos mancha EM. Complejos ensamblados que son analizados por EM son típicamente en la gama de tamaño de ~ 100 Å de diámetro o más. Recientemente sin embargo, tan pequeñas como 20 kDa proteínas han sido resueltas y estructuras de baja resolución se han obtenido cuando se utiliza a tinción metodologías¹⁶superior.

Para el análisis de MS, el aumento de la sensibilidad de la actual instrumentación de MS hasta el nivel femtomolar (attomoles) puede en algunos casos aumentar la sensibilidad de detección de BLI. Es muy concebible que las señales de la proteína que muestran una subida mínima pero repetible en amplitudes dará lugar a la identificación de la proteína en cuestión. Además, las interacciones proteína-proteína con uno de los socios en el biosensor y el otro en un medio celular de sondeo en efecto resultará en una purificación y posteriormente más fácil detección del complejo recién formado. Una limitación que puede observarse con los sistemas actuales de MS muy sensibles es que la proteína de interés no puede ser la base de datos, pero esta observación es poco frecuente (por ejemplo, proteomas de especies raras). Si se conocen las secuencias de las proteínas de interés, este problema se resuelve fácilmente mediante la inclusión de la secuencia de aminoácidos de la proteína en una base de proteína de fondo (como se describe en este trabajo en la sección de protocolo). Otra limitación potencial de los resultados de la metodología de la resistencia de una proteína a trypsinolysis. Digestión de la tripsina es normalmente el método predeterminado para la parte inferior hasta la identificación de proteínas. Sin embargo, las proteínas pueden ser resistentes a la tripsina si carecen de residuos de Arg y Lys o acceso a estos residuos están limitadas por la estructura plegada. Estas limitaciones son resueltos, respectivamente, por alternativa o una combinación de proteasas o incluyendo un despliegue reactivo (urea o guanidina HCl, como se indica en 1.1.14 y 1.2.6) antes de la digestión enzimática.

Posibles expansiones de esta metodología son que permite al usuario seguir e identificar complejos celulares Asamblea de crudo Lisados celulares. Resulta que la prueba para componentes en extractos concentrados celulares es fácil de realizar mediante los procedimientos de interferometría de la biocapa. A diferencia de microfluidos más comúnmente utilizados en metodologías que son propensos a la obstrucción y sensibles a la agregación, el enfoque BLI permite sumergir directamente consejos de sensor de biocapa en extractos crudos de montar potencialmente complejos específicos directamente de estas muestras impuras concentradas. Una vez montado, es perfectamente factible utilizar sondas de anticuerpo específico como seguimiento del sistema BLI para identificar y cuantificar aun los componentes sospechosos en extractos celulares que fueron identificados mediante el método de microvolume MS. Una vez más, la clave aquí es utilizar proteínas núcleo definido, adecuadamente orientado como sondas de afinidad específico.

La capacidad para ver la prepore para proceso de transición cinéticamente con BLI del poro será muy útil en la identificación de potenciales inhibidores de molécula pequeña "antitoxina" de las transiciones de proteína que funcionan específicamente en tarde endosomal, pH bajo (5.0) condiciones. Este prepore pH inducido a transición del poro es inhibida en presencia de plegamiento estabilizador (osmolitos) como glicerol o sacarosa y así presta apoyo para el desarrollo de específicas estabilizadores plegables dirigidos que impiden PA formación_{del poro} . Este enfoque específico evita y reemplaza ensayos crudos de agregación donde pH gotas conducen a la precipitación de la proteína. Este método, aunque bueno para métodos de preselección primarios, a menudo conduce a resultados positivos falsos donde específicos compuestos inhiben la agregación en lugar de las transiciones moleculares reales.

Las observaciones posteriores de la estructura y la identificación de los componentes ensamblados dentro de microvolume pequeñas muestras también pueden ser útiles en la validación de potenciales compuestos de plomo. Esto puede aplicarse en casos donde estabilización de montaje específicos o desestabilización es el resultado objetivo. Este enfoque paralelo cinético/estructura/identificación es útil para confirmar directamente la validez de efectores compuesto sospechoso principal de Asamblea y sirve como un paso razonable inspección secundaria o enfoque de rendimiento medio.

Cryo-EM es una técnica útil para el estudio de los detalles atómicos de complejos de macromoléculas en varios Estados de la Asamblea. Antes de la preparación de muestras de cryo-EM, es importante primero verificar que una preparación contiene complejos razonablemente puros homogéneos con tinción negativa EM. El trabajo aquí presentado muestra ensamblaje de complejos de proteína en las superficies de biosensor BLI, liberación de estos complejos para la visualización de la EM y la identificación de estos componentes utilizando MS. Esta particular metodología de Asamblea controlada y liberación puede ser útil en la generación de protocolos muy específicos que mejoran la preparación de muestras secuenciales homogénea para mancha negativa EM, un paso necesario que debe demostrarse antes de avanzar a Cryo-EM. Para obtener la estructura 3D de baja resolución, se necesitarían sólo 30-50 partículas del complejo para realizar una serie de inclinación cónica (70 imagen 2D diferentes puntos de vista por partícula) siempre que haya diversidad de orientación (varias vistas diferentes).

Con respecto a la mejora de métodos de MS, avances en la sensibilidad y la reducción en volumen de la muestra seguirán mejorando. Ciclo de flujos de nano y cromatografía líquida de alta presión junto con el desarrollo de espectrómetros de masas con un servicio rápido, aumento de la sensibilidad y la energía de resolución. Reciente introducción del espectrómetro de masas orbitrap, en particular la última versión (orbitrap Lumos de fusión y su sucesor esperado el Orbitrap fusión Lumos 1M) así como algoritmos de búsqueda facilitan enormemente este proceso.

La metodología actual controla la cinética montaje y desmontaje de componentes de toxina de ántrax utilizando metodologías BLI libre de etiqueta y evalúa la estructura y la identidad de estos componentes usando EM y MS, respectivamente. El uso de un simple canal de sistema BLI junto con rutina negativa tinción análisis de EM y técnicas elementales de MS son más que suficiente para caracterizar un proceso de montaje.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 mL black microtubes	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å	ThermoFisher Scientific	164561
Acetic acid glacial	Fisher	A38SL-212
Acetonitrile	Fisher	A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips	Forte Bio	18-5092
Ammonium bicarbonate	Fisher	A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Boric acid	Fisher Scientific	10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2			Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid	Electron Microscopy Sciences	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Formic acids	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals,LLC	100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain			Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system	Ted Pella, Inc	91000
Protective Antigen prepore			Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles	Fisher Scientific	09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sequest HT search engine	ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	BP334-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Sodium cholate	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Uranyl formate (UF)	Electron Microscopy Sciences	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487