Анализ динамических белковых комплексов монтируется на и освобождены от Biolayer интерферометрии биосенсора с использованием масс-спектрометрии и электронной микроскопии

Резюме

Здесь мы представляем протокол осуществлять монтаж и демонтаж токсинов сибирской язвы, с помощью biolayer интерферометрии (BLI). После сборки/разборки на поверхности биосенсор крупных белковых комплексов освобождаются от поверхности для визуализации и идентификации компонентов комплексов с помощью электронной микроскопии и масс-спектрометрии, соответственно.

Аннотация

В естественных условиях, белки часто являются частью больших макромолекулярных комплексов, где привязка специфичность и динамика в конечном итоге диктовать функциональных мероприятий. В этой работе pre-от англ сибирской язвы токсин является собраны и перешли в от комплекса англ. Во-первых N-концевой домен хвоща мутант смертоносных фактора (_NLF) прилагается к biolayer интерферометрии (BLI) биосенсор через дисульфида, муфты в оптимальной ориентации, позволяя защитные антигена (PA) prepore для привязки (K_d 1 Нм). Оптимально ориентированы LF_N-PA_prepore комплекс затем связывает растворимых капиллярного морфообразующих гена-2 (CMG2) клеток поверхности рецептор (K_d 170 м), что привело в комплексе представитель сибирской pre-от англ, стабильной при pH 7.5. Затем этот собранный комплекс подвергается подкисления (рН 5,0) представитель позднего endosome среды перехода ПА_prepore в состояние поры мембраны вставлены. Это ПА_поры состояние приводит к ослабленной привязку между CMG2 рецептор и LF_N-PA,_поры и существенной диссоциации CMG2 от перехода поры. Тио вложение LF_N биосенсор поверхность легко обратить вспять Дитиотреитол. Сокращение на поверхности биосенсор BLI выпускает LF_N-PA_prepore-CMG2 троичного комплекс или кислоты перешли LF_N-PA_поры комплексов в микролитр томов. Выпущенные комплексы затем визуализируется и определены с помощью электронной микроскопии и масс-спектрометрии. Эти эксперименты демонстрируют, как кинетические сборки/разборки конкретных белковых комплексов с помощью метки бесплатно BLI методологий мониторинга и оценки структуры и личность этих BLI собрал комплексов электронной микроскопии и масса спектрометрия, соответственно, с помощью легко реплицировать последовательных процедур.

Введение

Выявление и понимание специфики регулирующих белка комплекс Ассамблеи в естественных условиях имеет крайнюю заинтересованность для биохимических исследователей. Большие гетерогенных белков сборки являются скорее нормой, чем исключением. Это понятие поддерживается спектральные наблюдения в vivo Ассамблеи, изолируя комплексов с использованием мягче клеточные нарушения технологии, оценки продуктов из методов на основе сродства очищения и визуализации их с высоким разрешением криогенных электронной микроскопии (крио EM). Чтобы понять управления Ассамблея специфичности в ячейке, исследователи должны регулярно изолировать, идентифицировать и в конечном итоге характеризуют эти динамические структуры, монтаж/демонтаж. Наиболее активно используемых молекулярной инструмент для идентификации компонентов этих собраний часто требует на основе антитело иммунопреципитации, которая опирается на поддержании комплекс стабильности во время разрушения клеток. Различные сочетании аналитических методов недавно были разработаны для захвата комплексы из образцов клеток, используя microfluidic на основе подходов, таких как поверхностного плазмон резонанс (СРП). После удаления с поверхностей СРП эти образцы были проанализированы при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF)^1,2. Продвижение этой методологии с использованием легче протоколов позволит исследователям для визуализации и проверки прогнозируемых комплексы, которые происходят в клеточной среде. Так как СРП на основе микрофлюидика системы, от совокупного образования часто возникают проблемы. Обход этой проблемы требует разбавления образца, которая в свою очередь, может уменьшить целостности концентрация ответственности биологических комплексов.

Относительно недавнее продвижение в лейбл свободной технологии является развитие системы интерферометрии (BLI) biolayer³. Эти конкретного отражения на основе света которые системы репликации, или лучший подражать, SPR привязки и кинетические результаты на долю стоимости^3,4 особенно если один канал единицы используются. BLI измеряет изменения в структурах отражение световых помех между эталонный слой (контроль) и biolayer поверхности (экспериментальная). Результирующее изменение фазы измеряется в режиме реального времени как кинетическая и количественной индикации⁵. Биосенсор поверхности, содержащий конкретные иммобилизации химия, физически переносится между решениями, в отличие от изменения буфера microfluidic подходы в СРП, для измерения через волны фазы прогибов. Эффекты массообмена предотвращаются путем агитировать решение. В отличие от СРП эти системы являются весьма полезными в оценке комплексов из сырой биологических образцов. Физический параметр измеряется в ходе экспериментов BLI главным образом зависит от изменения в масса или толщина на поверхности биосенсор, которая является результатом сложных Ассамблеи белка или разборки.

Эти волокна оптические биодатчики, удобный и сравнительно недорогой. Один из новых полезных аспектов BLI является поверхностным удаление вновь собрал белковых комплексов от поверхности. Недавнее применение этого метода позволило нашей лаборатории наблюдать реального времени кинетика больших масштабах рН индуцированной перегруппировки структуры белка компонента защитные антигена (PA) токсинов сибирской язвы, как prepore (_preporeПА) перешли к его поры (ПА_поры) формы. Этот переход на кончик биосенсор была проверена с помощью электронной микроскопии (EM)⁶. Удаление комплексов от биосенсор поверхностей позволяет избежать большего объема разрежения эффекты часто встречающихся при освобождении комплексы от чип поверхностей при использовании микрофлюидика систем.

В текущей работе сибирской язвы токсин комплексы собираются и разобраны на поверхности биосенсор и затем выпустили в микролитр томов. Результате сложных компонентов проверяются ортогонально с помощью EM и масс-спектрометрия (МС).

протокол

1. Ассамблея определенных макромолекулярных комплексов на поверхностях биосенсор Biolayer интерферометрии (BLI)

1. Ассамблея prepore сибирской токсина комплекс на поверхности реактивной биосенсор модифицированного PDEA Амин
   1. Гидрат Амин реактивной второго поколения (AR2G) BLI биосенсор кончиком в 250 мкл воды за 10 минут.
   2. Программа раз шаг, перечисленные в таблице 1, на программное обеспечение, управление блоком BLI (см. Таблицу материалы).
   3. Запустите BLI, запуск, погружая кончик биосенсор в 250 мкл воды для 30 s для измерения первоначальные базовые биосенсор толщины и плотности.
   4. Активируйте биосенсор, погружая кончик в 250 мкл 50 мм NHS (N-оксисукцинимидного) и 200 мм EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) за 7 минут.
   5. Погружать активированные биосенсор в 50 мм PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine), растворенных в 0,1 М Борат буфере (рН 8,5) за 5 минут, чтобы создать активированные тиоловых реактивной поверхности.
   6. Погрузите активированные тиоловых реактивной биосенсор в 250 мкл раствора, содержащего 100 Нм E126C LF_N 10 мм натрия ацетата рН 5,0, 100 мм NaCl, буфер на 5 минут.
   7. Погрузите кончик LF_N в 50 мм L-цистеина, 1 M NaCl, ацетат натрия 0,1 М, pH 5,0, 4 минут, чтобы утолить любые оставшиеся реактивных свободных тиоловых реактивной групп.
   8. Погрузите кончик закаленном LF_N в 50 мм трис, 50 NaCl для 2 минут для создания базового буфера.
   9. Погрузите кончик закаленном LF_N в 0,5 мкм защитные антигена prepore (ПА-_prepore), 50 мм трис, 50 NaCl на 5 минут для создания LF_N-PA_prepore комплекс.
   10. Однажды связан ПА_prepore , удалите наконечник из ПА_prepore решения и погрузите кончик в 50 мм трис, 50 NaCl на 30 секунд смыть любых-специфически связанные ПА_prepore.
   11. Погрузите LF_N-PA_prepore в 0,5 мкм CMG2 рецептор (без трансмембранных доменов), 50 мм трис, 50 NaCl, за 5 минут.
   12. Погрузите LF_N-PA_{prepore -}CMG2 комплекс в 50 мм трис, 50 мм NaCl на 30 секунд чтобы смыть любых несвязанных CMG2 комплекс формы pre-от англ.
   13. Для анализа EM, выпуска LF_N-PA_prepore-CMG2 комплекс от кончика биосенсор, погружая кончик в 5 мкл 50 мм DTT, 50 Tris, 50 мм NaCl, внутри ПЦР-пробирку.
   14. Для анализа MS в тандеме пептидов из комплекса, выпуска LF_N-PA_prepore-CMG2 комплекс от кончика биосенсор, погружая биосенсор в 5 мкл 50 мм DTT, 6 M GuHCl (кератин бесплатно), 25 мм бикарбонат аммония рН 8,0 внутри PCR трубки . Это выполняется на различных биосенсор чем той, которая используется для анализа EM.
2. Ассамблея поры сибирской токсина комплекс на PDEA-модифицированные Амин реактивной биосенсор поверхности
   1. Чтобы просмотреть комплекс после перехода рН, выполните шаги 1.1.1-1.1.12 в предыдущем разделе для создания LF_N-PA_prepore-CMG2 комплекс.
   2. Погрузите кончик биосенсор в 10 мм ацетат pH 5,0 за 5 минут, чтобы начать переход ПА_prepore ПА_поры перехода. Этот переход обозначается увеличения амплитуды (примерно 0,2 Нм) следуют большие амплитуды спад, что предположил быть существенной или полной рецептор диссоциации из-за уменьшилась сродство.
   3. Погружайте LF_N-PA_поры кончиком в 50 мм трис, 50 мм NaCl, рН 8,0, 30 секунд смыть кислой буфера.
   4. Для анализа образца EM погрузиться кончик биосенсор раствор, содержащий мицеллы 1,25 мм (2,5 мм MSP1D1, 25 мм Na холат, 162.5 POPC) на 5 минут для предотвращения агрегации в растворе после выхода дисульфида.
   5. Для анализа EM отпустите LF_N-PA_{поры -}комплекс от кончика биосенсор мицеллы, погружая кончик в 5 мкл 50 мм DTT, 50 Tris, 50 мм NaCl внутри ПЦР-пробирку.
   6. Для анализа MS тандем пептидов из комплекса, выпуска LF_N-PA_poore комплекс (не мицеллы) от биосенсор наконечник, погружая биосенсор в 5 мкл 50 мм DTT, 6 M GuHCl (кератин бесплатно), 25 мм бикарбонат аммония рН 8,0 внутри PCR трубка. Это выполняется на различных биосенсор чем той, которая используется для анализа EM.

2. Визуализация и проверка выпустила макромолекулярных сборки от BLI биодатчики, негативные пятно электронной микроскопии

1. Тлеющим разрядом углерода покрытием сетки Cu 300. Типичный свечение разряда параметры являются 0.38 мбар стабильной атмосферы давления, негативные 15 мА, 20 секунд, затем продувки воздухом.
2. Закрепите сетку между чистые пинцет.
3. Пипетка 4 мкл выпустила сложных образца в ПЦР-пробирку на сетке и позволяют адсорбции для 60-х годов.
4. Фитиль прочь оставшихся жидкость с клином фильтровальной бумаги.
5. Пятно сетки путем дозирования 5 мкл 0,75% 0,02 мкм фильтруют уранила Формиат и влагу от избыточного пятно через 5 секунд. Разрешить сетке высохнуть при комнатной температуре.
6. Просмотр цветного образца сеток с использованием просвечивающий электронный микроскоп.

3. определение комплекса полной Pre-от англ сибирской токсин (LF_N-Pa_prepore-CMG2) и перешли комплекс (LF_N-Pa_поры без CMG2) с помощью масс-спектрометрии.

1. Разбавить выпустила образцов до 20 мкл и инкубировать 1 час.
2. 2 мкл 55 мм iodoacetamide, бикарбонат аммония 25 мм, pH 8.0 и инкубировать 1 час при комнатной температуре в темноте (покрытые алюминиевой фольги).
3. Разбавьте образца с 100 мкл 25 мм бикарбонат аммония, рН 8,0, чтобы уменьшить Гуанидин гидрохлорид концентрации ниже 1 М.
4. 5 мкл секвенирования трипсина изменен класс на 20 нг/мкл и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
5. Добавьте уксусной кислоты кристаллизированной до конечной концентрации 5% для снижения pH для < 3, затем уменьшить объем до 10 мкл в вакуумной концентратор.
6. Передаче раствор пептидов образца пластины на автоматический пробоотборник nLC 1200 uHPLC.
7. Загрузка 5 мкл, пептид раствор на столбец обратной фазы uHPLC монтируется на сцене ионизации MS.
8. Промойте колонку с 15 мкл 0,1% муравьиной кислоты с максимальной скоростью 5 мкгЛ/мин и/или максимальное давление 800 psi.
9. Элюировать пептиды из столбца C18 обратная фаза со скоростью потока 350 нл/мин в течение 90 минут, используя линейный градиент от 5% до 40% растворителя B в A + B (растворителей A: 0,1% муравьиной кислоты; растворителя B: 95% ацетонитриле с 0.1% муравьиной кислоты).
10. Анализируйте элюирующие пептидов на линии с помощью тандем МС.
    1. Задайте источник ионизации 2500 Вольт и ионного переноса температура до 250 ° C.
    2. Действуют масс-спектрометр под автоматического управления непрерывно один MS проверки следуют столько тандем MSMS максимально в течение 3 s, используя CID и энергию нормализованных столкновения, 35.
11. Идентифицировать пептида и белковые компоненты, с помощью стандартных методов. Для этой работы были выполнены два набора анализа пептидов и белков.

Результаты

Способность отслеживать и проверять Ассамблея крупных макромолекулярных комплексов является важным шагом на пути к пониманию специфики и функциональность биомолекулярных больших сборок. Результаты методов, представленных в настоящем документе продемонстрировать легкость, с которой крупных белковых комплексов (> 150 кДа массы) может быть смонтирован с помощью biolayer интерферометрии, все время мониторинга кинетики и амплитуда Ассамблеи. Уникальный компактный характер поверхности биосенсор позволяет Ассамблее анализ будет продлен, выпустив собрал комплексов в небольших микрообъемах. Эти микрообъемах может использоваться для визуализации начальной физической структуры комплексов, используя EM и проверить личность сложных компонентов, используя MS. Схематический обзор весь этот процесс показан на рисунке 1.

Ключевым элементом для успешной сборки и проверки макромолекулярных комплекса на поверхности биосенсор включает в себя правильную ориентацию начального белка. Это гарантирует, что сайты взаимодействия протеин протеина являются доступными, не труднодоступных заблокированных и оптимально позиционированные от поверхности биодатчик. Как показано на рисунке 2, правильной ориентации сибирской язвы токсин комплекс достигается с помощью специально инженерии N-терминальный фрагмент смертоносных фактор (_NLF) так всегда размещается сайт связывания_prepore LF_N-PA противоположностью биосенсор ковалентных вложения сайт^6,7. Последующее накопление комплекса с привязкой ПА для LF_N BLI биосенсор следуют растворимых CMG2 привязки ПА в конечном итоге создает токсин компетентным сибирской транслокации комплекса.

BLI sensogram след-реального времени читать из амплитуда изменения, обусловленные конкретными добавлением компонентов токсинов сибирской язвы, как они добавляются на биодатчик. Рисунок 3 показывает, представитель трассировки в паре с моделью комплекса предсказал форму на этом этапе в процессе. Первый подъем-LF_N загрузки на кончик. После закалки и базовых, ПА_prepore затем связывается с LF_N с последующим добавлением растворимых рецепторов CMG2 результате комплекс собран pre-от англ. LF_N-PA_prepore-CMG2. Чтобы продвинуться к конце endosome окружающей среды, весь комплекс подвергается низкого pH импульса (рН 5,0), что ослабляет рецептор привязки, позволяющие prepore переход к ее конформации поры расширенные мембраны вставлены. ⁶ Sensogram следы подкисления шага показаны на рисунке 4. Первоначальное увеличение или «Спайк» в амплитуде, вероятно, расширение пор⁶ , что должно произойти до снижения связывания рецептора CMG2. Больше снижение амплитуды является скорее рецептор существенной или полной диссоциации благодаря снижению сродство. Предыдущие работы в этой лаборатории сообщили, что CMG2 привязки в полностью выдвинутом ПА,_поры незначительна по сравнению с CMG2-ПА_prepore взаимодействия⁶. Кроме того, sensogram кинетическая трассировки, наблюдается в всех sensograms LF_N-PA_prepore-CMG2 переходы к LF_N-PA_поры с падение РН, воспроизводимых через несколько запусков.

До и после подкисления придает биосенсор комплексы легко выпускаются для визуализации на негативные пятно EM и идентификации мс (рис. 5). Представитель комплексы от EM результаты показаны на рисунке 6. Pre-от англ образца сетках, показать плотность согласуется с нетронутыми тройных комплексов, состоящих из LF_N-PA_prepore-CMG2. После подкисления сложные сетки, показать ПА перешла на поры и солюбилизирован путем включения мицеллы с не очевидно плотность CMG2.

Тождества пред и после подкисления комплексы были проверены МС. База данных где последовательности ПА, P13423; LF_N, P15917; и CMG2, P58335 были включены в фоне белков мыши базы данных, полученных из репозитория NCBInr. От этой первой базы данных поиска, с охватом следующих аминокислоты для тройных и бинарные комплексов были получены только протеинов интереса: 54% и 22% для ПА, 36% и 6% для LF и 43% для CMG2, соответственно (CMG2 не был обнаружен на бинарные комплекс). В целях максимального охвата аминокислоты белка, второй идентификация пептидов/белков выполнялось с помощью белка базы данных, содержащей только три протеинов интереса. Pre-от англ MS образцы содержится пептидов из всех трех токсин компонентов с 60,46%, 67.97% и 54,15% покрытия для LF_N, ПА и CMG2, соответственно (рис. 7). Результаты пост-от англ, показанный на рисунке 8, содержал только пептидов из LF_N и ПА (57.41% и 67,79% охвата, соответственно). Отсутствие CMG2 в образцах пост-от англ, согласуются с Наблюдаемое уменьшение Нм BLI во время порообразования.

Рис. 1. Схематический обзор для анализа белковых комплексов собрал на и изолированы от BLI биосенсора с использованием EM и г-жа пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Биосенсор активации: первый шаг в Ассамблее конкретной ориентации на BLI биодатчик. Домен E126C смертельной фактор N-терминала, (_NLF) связан через Тио связь, создание должным образом ориентированные ПА_prepore привязки интерфейса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рис. 3. Мониторинг сибирской токсин сборки и разборки с BLI: sensogram показывает изменения амплитуды как функция времени из-за конкретных добавлением сибирской язвы токсин компоненты, как они добавляются на биосенсор, начиная с LF_N загрузки (шаг 4 в Таблица 1). ПА_prepore затем загружены на поверхности, с последующим добавлением растворимых рецепторов CMG2. Собрал pre-от англ. комплекс состоит из LF-PA_prepore- CMG2. Продвигаться к конце endosome среды, весь собрать функциональных сибирской токсин подвергается низкого pH импульса (рН 5,0), что ослабляет рецептор привязки, позволяющие prepore переход к ее конформации поры расширенные мембраны вставлены. Воздействия, охватывающих поры мембраны подтвердил и солюбилизирован путем добавления мицеллы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. BLI sensogram CMG2 выпуска: следы подкисления шаг показывают увеличение первоначального или «шип» в амплитуде следуют больше снижение амплитуды, которые скорее всего поры формирования и рецептор диссоциации, соответственно. Вертикальные пунктирные красные линии обозначают начало нового шага. Sensograms совмещаются на полужирный красный пунктир. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Анализ комплексов протеина собрал на и изолированы от BLI биосенсора с использованием EM и MS: биосенсор прилагаемый комплексы легко попадают в 5 мкл буфера, содержащий DTT визуализация негативные пятно EM и идентификации, г-жа пожалуйста, нажмите здесь для Увеличенная версия этой фигуры.

Рисунок 6. Визуализация белковых комплексов с EM: Pre-от англ образца сетках, показать плотность согласуется с нетронутыми тройных комплексов, состоящих из LF_N-PA_prepore-CMG2. Пост-от англ. сложные сетки, показать ПА перешла на поры и солюбилизирован мицеллы с не очевидно плотность CMG2. Модели прогнозируемого комплексов (левой) находятся на той же шкале, как отдельные частицы показано. Частицы, раскрашенная с прогнозируемым белка (на основании размера EM плотности) показаны ниже каждой частицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7. Проверка белковых комплексов с MS: Pre-от англ MS образцы содержится пептидов из всех трех токсин компонентов с 60,46%, 67.97% и 54,15% покрытия для LF_N, ПА и CMG2, соответственно. Пептиды, обнаружены со скоростью ложных обнаружения (ФДР) равна или превышает 5%, показанными желтым, ФДР равна или превышает 1%, показано зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8. Проверка белковых комплексов с MS: пост-от англ содержатся образцы пептиды от LF_N и ПА (57.41% и 67,79% охвата, соответственно), но не CMG2. Рузвельт, равна или превышает 5%, показанными желтым, ФДР равна или превышает 1%, показано зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Шаг	Время (ов)	Описание
1	30	Первоначальные базовые
2	420	Активация
3	300	Активация
4	300	LFN загрузки
5	240	Закалочная хвоща
6	120	Базовый
7	300	ПАprepore Ассоциация
8	30	Базовый
9	300	CMG2 Ассоциация
10	30	Базовый
11	300	Кислотные переход
12	30	Базовый
13	300	Мицеллы Ассоциация

Таблица 1. Шаг раз для сингла BLI запустить для Ассамблеи сибирской токсин комплекс. Обратите внимание, что базовые показатели используются для смыть несвязанных белка из предыдущего шага и/или создание нового базового буфера.

Обсуждение

Эта демонстрация показывает как макромолекулярных комплекс формирования можно легко контролировать с помощью biolayer интерферометрии, визуализируется с помощью EM и проверены с МС, все с микрообъемах в короткий промежуток времени. Структурные Ассамблеи и наблюдаемых комплексы следуют биологически соответствующих прогнозов, дальнейшие проверки этот комбинированный методологии. Как уже упоминалось в разделе результаты, ключевым элементом для успеха Ассамблея требует рационально инженерии хвоща мутагенеза обеспечить должным образом ориентированной от поверхности биосенсор комплекс протеин интерфейсов.

Предыдущие системы использовали BLI и MS методы для оценки связывания белков двух и трех компонентов систем, а также целостности связывания рецептора выраженной белка, но в обоих случаях методы не были разработаны воспользоваться тандем EM/MS подход к^8,9. Только другие интерферометрии система, комбинированный анализ MS, чтобы помочь охарактеризовать взаимодействия был двойной поляризации интерферометрии¹⁰. К сожалению эта система больше не доступен для общего пользования. Как уже упоминалось во введении, были ряд исследований, где образцы были сформированы на поверхностях биосенсор SPR-как и удалены от MS анализа. Ни один из этих примеров в результате комплексы, визуализируется с помощью EM.

Ограничения этого последовательного метода может быть много, но разрешимы. Для первоначального иммобилизации и, следовательно, Фонд шаг Ассамблеи отсутствие знаний структурного взаимодействия поверхностей безусловно затруднит прогресс, связанные с наблюдением за первоначальной сборки фаз. Отсутствие информации структуры могут быть решены путем разработки инженерных фонд построить где вложение химия (например сульфгидрильных общие для дисульфидных связей / его меткой позиционирования) могут быть перемещены в различных регионах в рамках основной системы сборки. В случае сибирской язвы токсин комплекс отрадно, что структура LF_N привязан к ПА_prepore является наличие¹¹. Рациональное размещение инженерии цистеина локализована в регионы от лица привязки_prepore ПА. С цистеином связь химия желательно, что без других реактивных которым присутствуют на поверхности белка.

Существуют различные химия вложений, которые могут быть использованы для инженер-сайт конкретных вложений на поверхности белка. Один из самых популярных конкретных вложений включает позиционирование остаток биотина в конкретно определенное место на поверхности белка¹². К сожалению, биотин привязки к стрептавидина или авидин покрытием поверхности довольно туго. Реверсирование взаимодействия привязки не прост. Использование инженерных его тега на N - или C-го и последующих легкость привязанность к поверхности Ni-НТА является более универсальное применение сродства иммобилизации. Конечно один из предостережений для инженерных Ассамблеи вложение сайтов с его меткой систем является требование, что N - и C-Термини основного белка Ассамблеи оставаться подвергаются и разделены таким образом, что вложение легко. Как с всех процессов сборки, интерфейс взаимодействия основных Ассамблеи белка должно оставаться доступным как комплекс Ассамблеи прогрессирует.

Возможно наиболее общей задачей с помощью биосенсора поверхности химия является неспецифической привязки. Стрептавидина советы часто являются источником значительного неспецифической привязки эффектов. Дисульфида связаны биотина может использоваться для выпуска весьма специфические комплексы, оставив позади снижение связь S-биотин, тесно связана с иммобилизованными стрептавидина биодатчики¹³. Есть другие реверсивные химия, становятся доступны такие как iminoboronates и в меньшей степени ketoamide¹⁴. Это поле является в настоящее время слабо, но есть большой интерес в дальнейшем развитии реверсивные ковалентных протоколы избежать пробить наркотиков токсичности эффектов, которые обычно сопровождают использование ковалентных целевых наркотиков развития.

Ограничение использования EM для визуализации комплексов является толкование, особенно в тех случаях, где изначально не известны структуры собрал комплексов. Пространственное расположение компонентов в течение неопределенного собрал макромолекулярных комплекс могут быть идентифицированы с помощью моноклональных антител (МАБ) как конкретные кинетические и структурных маркеров. Например после того, как образуется комплекс, моноклональные антитела можно добавить, привязанная к конкретным компонентам. Этот метод часто используется в EM для выявления конкретных компонентов в течение¹⁵больших сборок. Другое ограничение связано с размером комплекса, хотя были случаи, где определенные симметричный сборок, как малые, как 70 кДа (гептамер GroES) легко решена с помощью негативные пятно EM. Собрал комплексы, которые анализируются EM, как правило, в диапазоне размеров от ~ 100 Å в диаметре или выше. Недавно однако, белки, как малые, как 20 кДа были решены и низким разрешением структуры были получены при использовании Улучшенный пятнать методологии¹⁶.

Для анализа MS повышенная чувствительность нынешнего инструментария MS вплоть до уровня femtomolar (attomoles) может в некоторых случаях увеличить чувствительность обнаружения BLI. Это весьма мыслимо, что белок сигналы, которые показывают минимальный, но повторяемые увеличение амплитуды приведет к идентификации белков в вопросе. Кроме того зондирование белок белковых взаимодействий с одним из партнеров, крепится на биосенсор и другой в клеточного окружения фактически приведет к очищения и впоследствии легче обнаружения новообразованной комплекса. Одно из ограничений, которые могут наблюдаться с текущей высокочувствительный MS систем, что протеина интереса не может быть в базе данных, но это наблюдение редких (например, протеомов от редких видов). Если последовательность протеинов интереса, как известно, эта проблема легко решается путем включая белки аминокислотной последовательности в базе данных белков фон (как описано в этой работе в разделе протокол). Другим потенциальным ограничением методологии результатов от сопротивления белка trypsinolysis. Пищеварение трипсина обычно является методом по умолчанию для снизу вверх идентификации белков. Однако белки могут быть устойчивы к трипсина, если им не хватает Arg и Lys остатков или доступ к эти остатки ограничены складчатые структуры. Соответственно, эти ограничения разрешаются с помощью альтернативных или сочетание протеазы или включая разворачивается реагента (мочевина или гуанидина HCl, как указано в 1.1.14 и 1.2.6) до ферментативного пищеварения.

Возможные расширения этой методологии включают в себя, позволяя пользователям следовать и выявления клеточных Ассамблеи комплексы из сырой сотовой лизатов. Оно turn out тестирования для компонентов сборки в концентрированных клеточных экстрактов легко выполнять с помощью процедуры biolayer интерферометрии. В отличие от более часто используемых microfluidic на основе методологии, которые подвержены засорению и чувствительны к агрегации BLI подход может использоваться погрузиться непосредственно biolayer датчика советы сырой экстракты потенциально собрать конкретные комплексы непосредственно из этих концентрированной нечистый образцов. После сборки, это вполне возможно использовать специфическое антитело зондов в последующей BLI системы для дальнейшего выявления и даже quantitate подозреваемых компоненты в клеточных экстрактов, которые были выявлены с помощью метода microvolume МС. Опять же ключевым здесь является использование определенных, правильно ориентированных основных белков, как конкретные сходства датчиков.

Возможность просмотра prepore до поры переходного процесса кинетически с BLI будет весьма полезной в выявлении потенциальных «анти токсин» малых молекул ингибиторов белка переходов, которые специально функционировать в конце от англ, низкого pH (5.0) условий. Этот рН индуцированных prepore до поры перехода ингибируется наличием складной стабилизатор (osmolytes) как глицерин или сахароза и таким образом оказывает решительную поддержку для разработки конкретных целевых складной стабилизаторы, которые мешают ПА_поры формирования. Этот подход позволяет избежать и заменяет сырой нефти на основе статистических анализов, где рН капель приведет к осадков белок. Этот последний метод, хотя хорошо для основных методов, биографии, часто приводит к ложных положительных результатов где конкретных соединений подавлять агрегации, вместо того, чтобы фактическое молекулярной переходы.

Течению замечания о структуре и идентификации отдельных сборных компонентов в малых microvolume образцы также могут быть полезны при проверке потенциальных соединений свинца. Это может применяться в случаях, когда конкретные Ассамблеи стабилизации или дестабилизации целевой результат. Такой параллельный подход кинетическая/структура/идентификации полезен для непосредственно подтверждающих действительность подозреваемых привести составные эффекторов Ассамблеи и служит разумной вторичного скрининга шаг или средней пропускной способности подход.

Крио-EM является полезным методом для изучения атомной детали макромолекулы комплексов в различных государствах Ассамблеи. До подготовки образцов крио EM, важно, чтобы сначала убедиться, что препарат содержит достаточно чистая однородных комплексы с отрицательным пятно EM. Работы, представленные в настоящем документе демонстрирует Ассамблеи белковых комплексов на BLI биосенсор поверхностях, освобождение этих комплексов для визуализации EM и идентификации этих компонентов с помощью MS. Это конкретной методологии управляемой сборки и выпуска может быть полезным в создании весьма специфические протоколы, которые улучшают однородных последовательных Пробоподготовка для отрицательных пятно EM, необходимый шаг, который должна быть продемонстрирована прежде чем перейти к крио EM. Чтобы получить низким разрешением 3D структура, только в 30-50 частицы комплекса необходимо будет выполнить ряд конических наклона (70 различных 2D изображения просмотров в частицы) условии ориентации разнообразия (несколько различных представлений).

Что касается совершенствования методов MS, достижения в чувствительности и сокращение объема образца продолжать совершенствовать. Nano потоки и жидкостной хроматографии высокого давления наряду с развитием масс-спектрометров с быстрым обязанность цикла, повышенная чувствительность и разрешающая способность. Недавнее введение в Орбитрэп масс-спектрометр, в частности на последней версии (Орбитрэп Fusion Lumos и его ожидаемый преемник Орбитрэп Fusion Lumos 1 М), а также алгоритмы поиска значительно облегчить этот процесс.

Нынешняя методология контролирует кинетическая сборка и разборка сибирской язвы токсин компонентов с помощью метки бесплатно BLI методологий и оценивает структуру и личность этих компонентов с помощью EM и МС, соответственно. Использование простой одного канала BLI системы в сочетании с обычной негативные окрашивания EM анализа и элементарные методы МС более чем достаточно характеризовать процесс сборки.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 mL black microtubes	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å	ThermoFisher Scientific	164561
Acetic acid glacial	Fisher	A38SL-212
Acetonitrile	Fisher	A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips	Forte Bio	18-5092
Ammonium bicarbonate	Fisher	A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Boric acid	Fisher Scientific	10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2			Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid	Electron Microscopy Sciences	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Formic acids	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals,LLC	100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain			Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system	Ted Pella, Inc	91000
Protective Antigen prepore			Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles	Fisher Scientific	09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sequest HT search engine	ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	BP334-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Sodium cholate	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Uranyl formate (UF)	Electron Microscopy Sciences	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487