Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Resumo

In vivo de proteínas são muitas vezes parte de grandes complexos macromoleculares onde especificidade de ligação e dinâmica dita saídas funcionais. Neste trabalho, a toxina de antraz pre-CDDP é montada e tornou-se o complexo de CDDP. Em primeiro lugar, o domínio N-terminal de um fator mutante letal cisteína (se_N) é anexado a um biossensor de interferometria (BLI) biolayer através de bissulfeto de acoplamento em uma orientação ideal, permitindo prepore antígeno protetor (PA) vincular (K_d 1 nM). Então o ideal orientado se_N-PA_prepore complexo vincula solúvel capilar morphogenic gene receptor-2 (CMG2) célula superfície (K_d 170 pM), resultando em um complexo de pre-CDDP representativa de antraz, estável em pH 7,5. Este complexo montado é sujeito a representante de acidificação (pH 5.0) do ambiente endossomo atrasado para o PA_prepore de transição para o estado de poros de membrana inserido. Este estado de PA_pore resulta em uma ligação enfraquecida entre o receptor CMG2 e o se_N-PA_pore e uma dissociação substancial do CMG2 partir do poro de transição. O thio-acessório de se_N à superfície biosensor é facilmente revertido por ditiotreitol. Redução da superfície de biosensor BLI libera o se_N-PA_prepore-CMG2 complexo Ternário ou o ácido transitou complexos de_poros se_N-PA em volumes microlitro. Lançado complexos são então visualizadas e identificaram usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa. Estes experimentos demonstram como a cinética de montagem/desmontagem de complexos de proteínas específicas usando metodologias BLI rótulo livre de monitorar e avaliar a estrutura e identidade destes BLI montado complexos por microscopia eletrônica de varredura e massa espectrometria de, respectivamente, usando procedimentos sequenciais de fácil-para-replicar.

Introdução

Identificar e compreender a especificidade que regem a proteína montagem complexa na vivo são de extremo interesse para pesquisadores bioquímicos. Grande proteína heterogêneos assemblies são a norma e não a excepção. Esta noção é suportada pelo monitoramento espectroscópico na vivo assembly, isolando complexos utilizando técnicas de interrupção de célula mais suaves, avaliando produtos a partir de métodos de purificação baseada na afinidade e visualizando-os usando alta resolução microscopia de elétron criogênica (cryo-EM). Para entender o controle de especificidade de montagem dentro da célula, pesquisadores devem rotineiramente isolar, identificar e caracterizar em última análise, estas estruturas dinâmicas de montagem/desmontagem. A ferramenta molecular mais utilizada para identificar os componentes destes conjuntos frequentemente requer imunoprecipitação baseados em anticorpos, que se baseia na manutenção da estabilidade dos complexa durante o rompimento da pilha. Diversas técnicas analíticas acopladas recentemente foram desenvolvidas para capturar complexos de amostras de células usando microfluidic com base em abordagens, tais como ressonância de plasmon de superfície (SPR). Após a remoção das superfícies SPR, estas amostras foram analisadas pelo tempo de dessorção/ionização do laser assistida por matriz de voo (MALDI-TOF)^1,2. Avançando nesta metodologia usando protocolos mais fácil permitirá que pesquisadores Visualizar e validar previstos complexos que ocorrem no ambiente celular. Desde SPR é um sistema baseado em microfluídica, surgem muitas vezes problemas da formação de agregados. Contornar este problema requer diluição da amostra, que por sua vez, pode diminuir a integridade dos complexos biológicos susceptíveis de concentração.

Um avanço relativamente recente em tecnologias de etiqueta-livre é o desenvolvimento do sistema interferometria (BLI) biolayer³. Estes particular à base de luz de reflectância emulam sistemas replicar, ou melhores, vinculação de SPR e cinéticos resultados em uma fração do custo^3,4 particularmente se são usadas unidades de canal único. BLI mede alterações em padrões de interferência de luz refletida entre uma camada de referência (controle) e a superfície biolayer (experimental). A mudança resultante na fase é medida em tempo real como uma leitura cinética e quantitativo⁵. A superfície de biosensor, contendo produtos químicos específicos de imobilização, fisicamente é transferida entre soluções, em vez de alterações de reserva por abordagens microfluidic em SPR, para medição através de desvios de fase de comprimento de onda. Efeitos de transferência de massa são impedidos por agitar a solução. Ao contrário da SPR, estes sistemas são bastante úteis na avaliação de complexos de amostras biológicas brutos. O parâmetro físico medido durante BLI experiências principalmente depende de uma mudança em massa ou espessura da superfície de biosensor que resulta da proteína complexa montagem ou desmontagem.

Estes biossensores de fibra óptica são relativamente baratos e fáceis de usar. Um aspectos úteis do BLI emergentes é a fácil remoção de complexos de proteína recém montado da superfície. Uma recente aplicação deste método permitida o nosso laboratório para observar a cinética de tempo real de pH em grande escala induzidas pelo rearranjo de estrutura da proteína do componente antígeno protetor (PA) toxina antraz como o prepore (PA_prepore) a transição para sua formulário de poros (PA_pore). Verificou-se esta transição na ponta biosensor usando microscopia de elétron (EM)⁶. Remoção de complexos de superfícies biosensor evita maiores efeitos de diluição de volume frequentemente encontrados ao liberar complexos de superfícies da microplaqueta ao usar sistemas de microfluídica.

No trabalho atual, complexos de toxina antraz são montados e desmontados na superfície biosensor e em seguida lançados em volumes microlitro. Os componentes complexos resultantes são validados usando ortogonalmente EM e espectrometria de massa (MS).

Protocolo

1. montagem de complexos macromoleculares definidos em superfícies de Biosensor Biolayer interferometria (BLI)

1. Montagem de toxina antraz prepore complexa sobre uma superfície de biosensor reativa amina PDEA-modificado
   1. Hidratar uma amina reativa segunda dica de biosensor BLI geração (AR2G) em 250 µ l de água por dez minutos.
   2. Programa vezes passo, listados na tabela 1, sobre o software que controla a unidade BLI (ver Tabela de materiais).
   3. Começar a BLI executar imergindo a ponta de biosensor em 250 µ l água por 30 s para medir uma base inicial de espessura biosensor e densidade.
   4. Ativar o biosensor imergindo a ponta em 250 µ l NHS (N-Hidroxisuccinimida) de 50 mM e 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) por 7 minutos.
   5. Mergulhe o biosensor registrado em 50 milímetros PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) dissolvido em tampão de borato 0,1 M (pH 8,5) por 5 minutos para gerar uma superfície thiol-reativos registrada.
   6. Mergulhe o biosensor thiol-reativos registrado em 250 µ l de solução contendo 100 nM E126C se_N em 10mm de sódio acetato de pH 5,0, 100 mM de NaCl, buffer por 5 minutos.
   7. Mergulhe a ponta se_N em 50 mM L-cisteína, 1 M NaCl, acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0, durante 4 minutos, para saciar qualquer restantes grupos tiol-reativa livre reativos.
   8. Mergulhe a ponta se_N extinta em 50 mM Tris, 50mm NaCl por 2 minutos para estabelecer base de reserva.
   9. Mergulhe a ponta se_N extinta prepore de antígeno protetor 0,5 µM (PA_prepore), 50 mM Tris, 50mm NaCl por 5 minutos para criar o se_N-PA_prepore complexo.
   10. Uma vez PA_prepore está associado, remova a ponta da solução PA_prepore e mergulhar a ponta 50 mM Tris, 50mm NaCl por 30 segundos para lavar qualquer limite não especìfica PA_prepore.
   11. Imergir o se_N-PA_prepore complexo receptor de CMG2 0,5 µM (sem o domínio transmembrana), 50 mM Tris, 50 mM de NaCl, por 5 minutos.
   12. Imergir o se_N-PA_{prepore -}CMG2 complexo 50 mM Tris, 50mm NaCl por 30 segundos para lavar qualquer CMG2 não acoplado ao formulário pre-CDDP complexo.
   13. Para a análise EM liberar o se_N-PA_prepore-CMG2 complexo da ponta biosensor imergindo a ponta em 5 µ l de 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50mm NaCl, dentro de um tubo PCR.
   14. Para análise de MS em tandem dos peptides do complexo, liberar o se_N-PA_prepore-tubo de GuHCl (queratina-livre), pH de 25mm bicarbonato de amónio 8.0 dentro um PCR CMG2 complexo da ponta biosensor imergindo o biosensor em 5 µ l 50 mM DTT, 6m . Isto é realizado em um biossensor diferente daquele usado para análise de EM.
2. Montagem de toxina antraz de poro complexa na superfície de PDEA-modificado amina reativos biosensor
   1. Para visualizar o complexo após transição pH, executar etapas 1.1.1-1.1.12 na seção anterior para gerar o se_N-PA_prepore-CMG2 complexo.
   2. Mergulhe a ponta biosensor em um pH de acetato de 10mm 5.0 por 5 minutos para iniciar a transição da PA_prepore a transição de PA_pore . Esta transição é indicada pelo aumento da amplitude (aproximadamente 0.2 nm) seguido por um declínio de amplitude maior que é a hipótese de ser a dissociação do receptor substancial ou total devido à diminuída afinidade de ligação.
   3. Mergulhe a ponta de_pore se_N-PA em 50 mM Tris, 50mm NaCl, pH 8.0, por 30 segundos para lavar tampão ácida.
   4. No exemplo EM análise, mergulhe a ponta biosensor em uma solução contendo micelas 1.25 mM (2,5 mM MSP1D1, 25mm nd-colato, 162,5 mM POPC) por 5 minutos para evitar a agregação em solução após a liberação do bissulfeto.
   5. Para análise EM, liberar o se_N-PA_{poro -}complexo da ponta biosensor Micelle imergindo a ponta em 5 µ l de 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50mm NaCl dentro de um tubo PCR.
   6. Por análise de MS em tandem dos peptides do complexo, divulgar se o_N-PA_poore complexo (não micelle) do biosensor dica imergindo o biosensor em 5 µ l 50 mM DTT, 6 M GuHCl (queratina-livre), pH de 25mm bicarbonato de amónio 8.0 dentro uma PCR tubo. Isto é realizado em um biossensor diferente daquele usado para análise de EM.

2. Visualizar e validar lançaram Macromolecular Assemblies de biosensores BLI por microscopia electrónica de mancha negativa

1. Brilho de descarga uma grade de Cu 300 carbono revestido. Configurações de descarga típico brilho são 0,38 mBar atmosfera estável pressão, negativos 15 mAmps, 20 segundos, em seguida, ventilação com ar.
2. Grade segura entre um par de pinças limpos.
3. Pipete 4 µ l de amostra complexa lançada no tubo do PCR para o grid e permitir a adsorção para 60 anos.
4. Pavio-distância restante líquido com uma rodela de papel de filtro.
5. Manche a grade por pipetagem 5 µ l de 0,75% 0,02 mícron filtrada formiato de uranilo e wicking mancha excesso fora depois de 5 segundos. Permitir que a grade secar à temperatura ambiente.
6. Ver os grades manchada de amostra usando um microscópio eletrônico de transmissão.

3. identificação de completa pré-CDDP Anthrax toxina complexo (se_N-Pa_prepore-CMG2) e espectrometria de massa usando uma transição complexa (se_N-Pa_pore sem CMG2).

1. Diluir as amostras lançadas a 20 µ l e incubar durante 1 hora.
2. Adicionar 2 µ l de iodoacetamide de 55mm, 25mm bicarbonato de amônio, pH 8.0 e incubar durante 1 hora em temperatura ambiente no escuro (coberto com papel alumínio).
3. Dilua a amostra com 100 µ l de bicarbonato de amónio de 25 mM, pH 8.0, para reduzir a concentração de cloridrato de guanidina abaixo de 1 M.
4. Adicionar 5 µ l de sequenciamento tripsina grau modificado em 20 ng / µ l e incubar a 37 ° C durante a noite.
5. Adicionar o ácido acético glacial para uma concentração final de 5% para reduzir o pH a < 3, então, reduzir o volume de 10 µ l em vácuo concentrador.
6. Transferi a solução de peptídeo para a placa da amostra sobre o mostruário do nLC 1200 uHPLC.
7. Carrega 5 µ l da solução de peptídeo sobre uma coluna de fase reversa de uHPLC montada no palco da ionização do MS.
8. Lave a coluna com 15 µ l de 0,1% de ácido fórmico a uma taxa máxima de 5 µL/min e/ou pressão máxima de 800 psi.
9. Eluir peptídeos da coluna fase reversa C18 com um caudal de 350 nL/min durante um período de 90 min usando um gradiente linear de 5% a 40% do solvente B em A + B (solvente a: 0,1% de ácido fórmico; solvente b: 95% acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico).
10. Analise a eluição peptídeos em linha usando em tandem MS.
    1. Defina a origem de ionização de 2500 volts e temperatura de transferência de iões para 250 ° C.
    2. Operar o espectrômetro de massa sob controlo automático para realizar continuamente uma verificação de MS, seguida por tantos em tandem MSMS quanto possível em um período de 3 s, usando o CID e uma energia de colisão normalizado de 35.
11. Identifica componentes de peptídeos e proteínas usando métodos padrão. Para este trabalho, foram realizados dois conjuntos de análise de peptídeos e proteínas.

Resultados

A capacidade de monitorar e validar a montagem de grandes complexos macromoleculares é um passo crucial para compreender a especificidade e a funcionalidade dos grandes biomolecular assemblies. Os resultados dos métodos aqui apresentados demonstram a facilidade com a quais grandes complexos de proteínas (> 150 kDa em massa) pode ser montado usando interferometria de biolayer, ao mesmo tempo monitorando a cinética e a amplitude do assembly. A natureza única compacta da superfície biosensor permite a análise de montagem ser estendido liberando complexos montados na pequena microvolumes. Estes microvolumes pode ser usados para visualizar a estrutura física inicial dos complexos usando EM e para verificar a identidade dos componentes do complexos usando MS. Uma visão esquemática de todo esse processo é mostrada na Figura 1.

Um elemento-chave para o sucesso conjunto e verificação do complexo macromolecular na superfície biosensor envolve a orientação adequada da proteína semente inicial. Isso garante que os sites de interação da proteína-proteína são acessíveis, não estericamente bloqueada e idealmente posicionado longe da superfície biosensor. Como mostrado na Figura 2, a orientação adequada da toxina antraz complexa é conseguida usando um fragmento N-terminal projetado especificamente do factor letal (se_N) para o sítio de ligação do_prepore se_N-PA está sempre posicionado oposto do biosensor ligação covalente local^6,7. O acúmulo subsequente do complexo com vinculação de PA para o biosensor se_N BLI seguido solúvel CMG2 ligação para PA, finalmente, cria uma toxina antraz competente de translocação complexa.

O rastreamento de sensogram BLI é uma leitura em tempo real sem as alterações de amplitude devido a adição específica dos componentes toxina antraz como eles são adicionados para o biosensor. A Figura 3 mostra com que um traço representativo emparelhado um modelo do complexo previu a forma em que etapa do processo. A primeira ascensão é se_N carregando a ponta. Após têmpera e linha de base, PA_prepore em seguida, vincula se_N seguido pela adição de solúvel do receptor de CMG2 resultando no complexo montado pre-CDDP de se_N-PA_prepore-CMG2. Para o progresso em direção o tarde endossomo ambiente, todo o complexo é submetido a um pulso de baixo pH (pH 5.0) que enfraquece o receptor da ligação, permitindo que o prepore fazer a transição para a sua conformação de poros de membrana estendida inserida. ⁶ Sensogram traços da etapa de acidificação são mostrados na Figura 4. O aumento inicial ou 'pico' na amplitude é provável que a extensão dos poros⁶ que deve ocorrer antes da diminuição da ligação ao receptor CMG2. O declínio de amplitude maior é mais provável receptor substancial ou total dissociação, devido à afinidade de ligação diminuída. Trabalhos anteriores neste laboratório indicam CMG2 ligação para o totalmente estendida PA_pore é insignificante em comparação com a interação de_prepore CMG2-PA⁶. Além disso, o rastreamento de cinética de sensogram, observada em todos os sensograms de se_N-PA_prepore-CMG2 transições para se_N-PA_pore com uma queda de pH, é reproduzível por várias execuções.

Antes e após a acidificação, os complexos de biosensor anexado são facilmente liberados para visualização pela mancha negativa EM e identificação pelo MS (Figura 5). Complexos representativos dos resultados EM são mostrados na Figura 6. Grades de amostra pré-CDDP, mostrar as densidades consistente com intactos complexos ternários composto se_N-PA_prepore-CMG2. Redes complexas pós-acidificação, mostrar PA uma transição para pore e solubilizado pela inclusão de micela com nenhuma densidade CMG2 óbvia.

As identidades do pré- e pós-acidificação complexos foram verificados pelo MS. Um banco de dados onde as sequências de PA, P13423; Se_N, P15917; e CMG2, P58335 foram incluídos em um plano de fundo de um banco de dados de proteínas do mouse derivado do repositório NCBInr. Só as proteínas de interesse foram obtidas a partir desta primeira pesquisa de banco de dados, com a seguinte cobertura de aminoácidos para os complexos ternários e binários: 54% e 22% para PA, 36% e 6% para se e 43% para CMG2, respectivamente (CMG2 não foi detectada no complexo binário). A fim de maximizar a cobertura de aminoácido de proteína, uma segunda identificação de peptídeos/proteínas foi realizada usando um banco de dados de proteínas contendo apenas as três proteínas de interesse. Pré-CDDP MS amostras continham peptídeos de todos os componentes de toxina três com 60.46%, 67.97% e 54.15% de cobertura para se_N, PA e CMG2, respectivamente (Figura 7). Resultados de post-CDDP, mostrados na Figura 8, continham apenas peptídeos de se_N e PA (cobertura 57.41% e 67.79%, respectivamente). A falta de CMG2 nas amostras post-CDDP são consistentes com a diminuição de nm BLI observada durante a formação de poros.

Figura 1. Visão geral esquemática para análise de complexos de proteína montada sobre e isolado do biosensor BLI usando EM e MS. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Ativação de biosensor: primeiro passo no conjunto específico de orientação na biosensor BLI. O domínio N-terminal do E126C Factor letal, (se_N) está ligado através de um enlace thio-criando a interface de ligação_prepore PA devidamente orientada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Monitoramento de antraz toxina montagem e desmontagem com BLI: O sensogram mostra mudanças de amplitude em função do tempo devido a adição específica do antraz toxina componentes como eles são adicionados para o biosensor começando com o carregamento se_N (etapa 4 A tabela 1). PA_prepore é então carregado para a superfície, seguida pela adição de solúvel do receptor de CMG2. O complexo pré-CDDP montado consiste de um se-PA_prepore- CMG2. Para o progresso em direção o tarde endossomo ambiente, toda a montar antraz funcional toxina é submetida a um pulso de baixo pH (pH 5.0) que enfraquece o receptor da ligação, permitindo que o prepore fazer a transição para a sua conformação de poros de membrana estendida inserida. Exposição da membrana abrangendo poro é confirmada e solubilizada pela adição de micelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Sensogram BLI de lançamento CMG2: vestígios da etapa de acidificação mostram um aumento inicial ou 'spike' amplitude seguido por um declínio de amplitude maior que provavelmente pore formação e dissociação do receptor, respectivamente. Verticais pontilhadas linhas vermelhas denotam o início de uma nova etapa. Sensograms estão alinhados no em negrito pontilhado linha vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Analisar os complexos da proteína montada sobre e isolado do biosensor BLI usando EM e MS: Biosensor anexados complexos são facilmente liberados no 5 µ l de tampão contendo TDT para identificação pelo MS. e visualização pela mancha negativa EM clique aqui para Ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Visualização dos complexos de proteínas com EM: pré-CDDP grades de amostra, mostrar as densidades consistente com intactos complexos ternários composto se_N-PA_prepore-CMG2. Post-CDDP redes complexas, mostrar PA uma transição para pore e solubilizado por micela com nenhuma densidade CMG2 óbvia. Modelos de complexos previstos (lado esquerdo) estão na mesma escala como partículas individuais mostradas. As partículas coloridas com proteína predita (baseada no tamanho de densidade EM) são mostradas abaixo de cada partícula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Verificação de complexos de proteínas com MS: MS Pre-CDDP amostras continham peptídeos de todos os componentes de toxina três com 60.46%, 67.97% e 54.15% de cobertura para se_N, PA e CMG2, respectivamente. Peptídeos detectados em uma taxa falsa da descoberta (FDR) igual ou superior a 5% mostrados em amarelo, FDR igual ou superior a 1%, mostrado em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Verificação de complexos de proteínas com MS: Post-CDDP peptídeos de amostras contidas se_N e PA (cobertura 57.41% e 67.79%, respectivamente), mas não CMG2. FDR, igual ou superior a 5% mostrados em amarelo, FDR igual ou superior a 1%, mostrado em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Passo	Tempo (s)	Descrição
1	30	Linha de base inicial
2	420	Ativação
3	300	Ativação
4	300	Carregamento deN se
5	240	Retardamento de cisteína
6	120	Linha de base
7	300	Associação deprepore PA
8	30	Linha de base
9	300	Associação CMG2
10	30	Linha de base
11	300	Transição de ácido
12	30	Linha de base
13	300	Associação de micela

Tabela 1. Vezes de passo para single BLI executar a toxina antraz de montagem complexa. Observe que as linhas de base são usadas para lavar desvinculado de proteína da etapa anterior e/ou estabelecer uma nova base de reserva.

Discussão

Esta demonstração ilustra como a formação do complexo macromolecular pode ser facilmente controlada usando interferometria biolayer, visualizado usando EM e verificado com MS, todos com microvolumes em um curto espaço de tempo. Montagem estrutural e complexos observados seguem as previsões biologicamente relevantes, Validando ainda mais esta metodologia combinada. Como mencionado na seção de resultados, o elemento-chave para o sucesso de montagem requer mutagênese cisteína racionalmente projetados para garantir que as interfaces do complexo proteína-proteína são devidamente orientado para longe da superfície biosensor.

Sistemas anteriores usaram técnicas BLI e MS para avaliar a ligação às proteínas de dois e três sistemas de componentes, bem como a integridade da ligação ao receptor de proteína expressa, mas, em ambos os casos, os métodos não foram desenvolvidos para tirar proveito do tandem EM/MS abordagem de^8,9. Apenas outro interferometria sistema que combinava MS análise para ajudar a caracterizar as interações foi uma dupla-polarização interferometria¹⁰. Infelizmente, este sistema não está disponível para uso geral. Como mencionado na introdução, tem havido um número de estudos concluído onde amostras foram formadas em superfícies SPR-como biosensor e removidas da análise de MS. Nenhum destes exemplos resultou em complexos visualizados usando EM.

As limitações deste método sequencial podem ser numerosos, mas podem ser resolvidas. Para a imobilização inicial e, portanto, etapa de fundação da assembleia, a falta de conhecimento sobre as superfícies de interação estrutural certamente impediria associado com as fases de montagem inicial de monitoramento de progresso. A falta de estrutura de informação pode ser abordada através da concepção de uma Engenharia Fundação construir onde químicas de fixação (por exemplo, sulfidrila moiety para ligações de bissulfeto / His-tag posicionamento) pode ser movido para várias regiões dentro do núcleo sistema de montagem. No caso da toxina antraz complexa, foi uma sorte que a estrutura se_N vai PA_prepore é disponível¹¹. Colocação racional de cisteína a engenharia era localizada regiões longe do rosto de ligação_prepore PA. Com química de enlace de cisteína, é preferível que não outras cisteínas reativas estão presentes na superfície da proteína.

Existem vários químicos acessório que podem ser usados para engenheiro site de anexo específico sobre superfícies de uma proteína. Um dos mais populares acessórios específicos envolve posicionamento um moiety biotina em uma localização definida especificamente sobre a superfície da proteína¹². Infelizmente, ligação biotina para um streptavidin ou avidin revestido superfícies é bastante apertado. Reversão da interação ligação não é simples. A utilização de uma engenharia sua marca no N - ou C-terminal e a subsequente facilidade de fixação para superfícies Ni-NTA é uma aplicação mais universal de imobilização de afinidade. Claro, dentre os impedimentos para engenharia sites de acessório de montagem com sistemas com sua Tag é a exigência que o N e C-termini da proteína de Assembleia do núcleo permanecem expostos e separados para que o anexo é fácil. Como com todos os processos de montagem, a interface de interação da proteína de Assembleia do núcleo deve permanecer disponível no decorrer do montagem complexa.

Talvez a preocupação mais comum do uso de produtos químicos de superfície biosensor é inespecificas. Streptavidin dicas são muitas vezes uma fonte de efeitos significativos inespecificas. Dissulfeto ligado biotina pode ser usada para liberar complexos muito específicos, deixando para trás a ligação S-biotina reduzida, rigidamente vinculada a estreptavidina imobilizada biosensores¹³. Existem outras químicas reversíveis tornando-se disponíveis, tais como iminoboronates e a uma menor extensão ketoamide¹⁴. Este campo é atualmente subdesenvolvido, mas há grande interesse em desenvolver protocolos covalentes reversíveis para evitar efeitos de toxicidade de drogas fora do alvo que comumente acompanham o uso do desenvolvimento de drogas específicas ligações covalentes.

Uma limitação do uso EM Visualizar complexos é interpretação, especialmente em casos onde as estruturas dos montados complexos não são conhecidas inicialmente. A localização espacial dos componentes dentro de um complexo macromolecular montado indefinido pode ser identificada usando antibodies monoclonal (mAb) como marcadores específicos cinéticos e estruturais. Por exemplo, uma vez que um complexo é formado, os anticorpos monoclonais podem ser adicionados que vincular a componentes específicos. Este método é frequentemente usado em identificar componentes específicos dentro de grandes módulos (assemblies)¹⁵. Outra limitação está relacionada ao tamanho do complexo, embora tenha havido casos onde assemblies simétricos definidos tão pequeno como 70 kDa (GroES heptamer) são facilmente resolvidos usando negativo mancha EM. Montado complexos que são analisados por EM são tipicamente na faixa de tamanho de ~ 100 Å de diâmetro ou acima. Recentemente, no entanto, tão pequenas quanto 20 kDa proteínas foram resolvidas e estruturas de baixa resolução foram obtidas ao usar superior coloração metodologias¹⁶.

Para análise de MS, o aumento da sensibilidade do atual MS instrumentação até o nível de femtomolar (attomoles) pode, em alguns casos, aumentar a sensibilidade da deteção do BLI. É altamente concebível que sinais de proteína que mostram um aumento mínimo mas repetível amplitudes resultará na identificação da proteína em questão. Além disso, sondar as interações da proteína-proteína com um dos parceiros anexados o biosensor e a outra em um milieu celular em vigor resultará em uma purificação e detecção posteriormente mais fácil do complexo recém-formado. Uma limitação que pode ser observada com os actuais sistemas altamente sensíveis do MS é que a proteína de interesse não pode ser no banco de dados, mas esta observação é rara (por exemplo, proteomes de espécies raras). Se as sequências das proteínas de interesse são conhecidas, este problema é facilmente resolvido, incluindo a sequência de aminoácidos somáticas em um plano de dados da proteína (conforme descrito neste trabalho na seção de protocolo). Outra limitação potencial da metodologia resultados de resistência de uma proteína para trypsinolysis. Digestão do trypsin normalmente é o método padrão para a parte inferior acima da identificação de proteínas. No entanto, proteínas podem ser resistentes à tripsina, se lhes falta Arg e Lys resíduos ou acesso a estes resíduos são restritos pela estrutura dobrada. Estas limitações são resolvidas, respectivamente, usando a alternativa ou uma combinação de proteases ou incluindo um reagente desdobramento (ureia ou guanidina HCl, como indicado no 1.1.14 e 1.2.6) antes da digestão enzimática.

Possíveis expansões desta metodologia incluem permitindo que o usuário siga e identificar complexos celulares montagem de lisado celular bruto. Afinal, testes para componentes de montagem em extratos concentrados de celulares é fácil de executar usando os procedimentos de interferometria de biolayer. Ao contrário de microfluidic mais comumente usados com base em metodologias que são propensos ao entupimento e sensível a agregação, a abordagem BLI pode ser usada para mergulhar diretamente dicas de sensor biolayer extratos crus potencialmente montar complexos específicos diretamente destas amostras impuras concentrada. Uma vez montado, é inteiramente possível usar sondas de anticorpos específicos em seguimento ao sistema BLI para mais identificar e dosar até componentes suspeitos em extratos celulares que foram identificados utilizando o método de microvolume MS. Novamente, a chave aqui é usar as proteínas do núcleo definido, devidamente orientado como sondas de afinidade específica.

A habilidade de ver o prepore para o processo de transição cineticamente com BLI de poros será altamente útil na identificação de potenciais inibidores de pequena molécula "antídoto" das transições proteínas que funcionam especificamente sob tarde CDDP, baixo pH (5,0) condições. Este prepore de pH induzida de poro de transição é inibido na presença de dobramento estabilizador (osmólitos) tais como o glicerol ou sacarose e assim presta forte apoio para o desenvolvimento de específicas orientadas estabilizadores dobráveis que impedem PA formação_{de poros} . Esta abordagem específica evita e substitui brutos ensaios baseados em agregação, onde o pH cai chumbo à precipitação de proteínas. Este último método, embora bom para métodos prescreening primários, conduz frequentemente a resultados falso-positivos onde compostos específicos inibem a agregação, em vez das transições moleculares reais.

As observações a jusante da estrutura e identificação dos componentes individuais montados dentro microvolume pequenas amostras também podem ser útil na validação de potenciais compostos de chumbo. Isto pode ser aplicado em casos onde a estabilização assembly específico ou desestabilização é o resultado de destino. Esta abordagem paralela cinético/estrutura/identificação é útil para diretamente, confirmando a validade da suspeita de chumbo efetores composto do conjunto e serve como uma etapa de triagem secundária razoável ou abordagem de taxa de transferência média.

Cryo-EM é uma técnica útil para estudar os detalhes atômicos dos complexos da macromolécula, em vários Estados de montagem. Antes de preparar as amostras EM crio-, é importante verificar primeiro que uma preparação contém razoavelmente puros complexos homogéneos com mancha negativa EM. O trabalho apresentado neste documento demonstra a montagem de complexos de proteínas em superfícies de biosensor BLI, lançamento destes complexos para visualização EM e a identificação destes componentes usando MS. Esta metodologia específica do conjunto controlado e lançamento pode ser útil na geração de protocolos muito específicos que aprimoram a preparação da amostra de sequencial homogénea para mancha negativa EM, um passo necessário que deve ser demonstrada antes de avançar para Cryo-EM. Para obter a estrutura 3D de baixa resolução, apenas 30-50 partículas do complexo seria necessário para realizar uma série de inclinação cónico (70 visualizações de imagem 2D diferente por partícula), desde que haja diversidade de orientação (vários modos de exibição diferentes).

Com relação a melhorar os métodos de MS, avanços na sensibilidade e diminuição do volume de amostra continuam a melhorar. Ciclo de fluxos de nano e cromatografia líquida de ultra alta pressão junto com o desenvolvimento de espectrómetros de massa, com um serviço rápido, aumento da sensibilidade e poder de resolução. Recente introdução do espectrômetro de massa orbitrap, em particular a versão mais recente (orbitrap Lumos Fusion e seu sucessor esperado o Orbitrap Fusion Lumos 1M), bem como os algoritmos de busca facilitam muito esse processo.

A metodologia atual monitora a cinética montagem e desmontagem de componentes de toxina antraz utilizando metodologias BLI livre de rótulo e avalia a estrutura e a identidade desses componentes usando EM e MS, respectivamente. O uso de um único canal simples sistema BLI juntamente com negativa coloração análise EM rotina e técnicas elementares de MS são mais que suficiente para caracterizar um processo de montagem.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 mL black microtubes	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å	ThermoFisher Scientific	164561
Acetic acid glacial	Fisher	A38SL-212
Acetonitrile	Fisher	A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips	Forte Bio	18-5092
Ammonium bicarbonate	Fisher	A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Boric acid	Fisher Scientific	10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2			Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid	Electron Microscopy Sciences	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Formic acids	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals,LLC	100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain			Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system	Ted Pella, Inc	91000
Protective Antigen prepore			Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles	Fisher Scientific	09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sequest HT search engine	ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	BP334-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Sodium cholate	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Uranyl formate (UF)	Electron Microscopy Sciences	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487