Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Zusammenfassung

In-vivo, Proteine sind häufig Teil der großen makromolekularen komplexe wo Bindung Spezifität und Dynamik letztlich funktionalen Ausgänge diktieren. In dieser Arbeit wird das Pre-Endosomal-Milzbrand-Toxin montiert und umgestellt in komplexen Endosomal. Erstens ist die N-terminale Domäne Cystein mutierte tödliche Faktor (LF_N) ein Biolayer Interferometrie (BLI) Biosensor durch Disulfid Kupplung in eine optimale Orientierung, so dass schützendes Antigen (PA) Prepore (K_d 1 nM) binden beigefügt. Die optimal ausgerichteten LF_N-PA_Prepore komplexe dann bindet an löslichen Kapillare morphogenen Gen-2 (CMG2) Zelle Oberfläche Rezeptor (K_d 170 pM), was zu einem repräsentativen Milzbrand Pre-Endosomal Komplex, stabil bei pH 7,5. Montierten Anlage unterliegt dann Säuerung (pH 5,0) Vertreter der späten Endosom Umwelt PA_Prepore in der Membran eingefügt Pore Zustand Übergang. Diese PA_pore Zustand führt in einer geschwächten Bindung zwischen den CMG2-Rezeptor und der LF_N-PA_pore und eine erhebliche Dissoziation des CMG2 aus den Übergang Pore. Die Thio-Befestigung der LF_N der Biosensor-Oberfläche ist leicht durch Dithiothreitol rückgängig gemacht. Reduktion auf der BLI Biosensor Oberfläche löst die LF_N-PA-_Prepore-CMG2 ternäre Komplex oder die Säure umgestellt LF_N-PA-_pore -komplexe in Mikroliter Volumen. Freigegebene Anlagen sind dann visualisiert und durch Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie identifiziert. Diese Experimente zeigen, wie die kinetische Montage/Demontage von bestimmten Proteinkomplexen markierungsfreie BLI Methoden zu überwachen und bewerten die Struktur und Identität der diese BLI komplexe durch Elektronenmikroskopie und Masse montiert Spektrometrie, bzw. einfach replizieren sequentielle Verfahren verwenden.

Einleitung

Identifizieren und verstehen die Spezifität für Protein komplexen Baugruppe in Vivo ist extrem interessant für Biochemische Forscher. Großen heterogenen Protein Baugruppen sind eher die Regel als die Ausnahme. Dieser Begriff wird unterstützt durch spektroskopische Überwachung von in Vivo Montage, Isolierung mittels sanftere Zelle Störung Techniken, Produkte aus Affinität-basierte Reinigungsverfahren auswerten und visualisieren sie komplexe mit hoher Auflösung Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM). Um die Kontrolle der Montage Besonderheiten innerhalb der Zelle zu verstehen, müssen Forscher routinemäßig zu isolieren, zu identifizieren und letztlich charakterisieren diese dynamischen Montage/Demontage Strukturen. Die am stärksten genutzten Molekulare Werkzeug, um die Komponenten dieser Versammlungen häufig identifizieren erfordert Antikörper-basierten Immunopräzipitation, die auf komplexe Stabilität während Zellaufschluss beruht. Verschiedenen gekoppelte analytische Techniken wurden vor kurzem entwickelt, um komplexe aus Zellproben mit mikrofluidischen basierten Ansätzen, wie z. B. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) zu erfassen. Nach Entnahme aus der SPR-Oberflächen wurden diese Proben von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Zeit des Fluges (MALDI-TOF)^1,2analysiert. Weiterentwicklung dieser Methode unter Verwendung einfacher Protokolle erlauben Forschern zu visualisieren und zu validieren vorhergesagten komplexe, die in dem zellulären Milieu auftreten. Da SPR ein Mikrofluidik-basiertes System ist, ergeben sich Probleme oft aus Aggregatbildung. Umgehung dieses Problems erfordert Probenverdünnung, die wiederum die Integrität der Konzentration haftet biologische komplexe verringern kann.

Ein relativ neuer Fortschritt in markierungsfreie Technologien ist die Entwicklung der Biolayer Interferometrie (BLI) System³. Diese besondere Licht-basierte Reflexion, die Systeme replizieren, oder am besten zu emulieren, SPR Bindung und kinetische Ergebnisse zu einem Bruchteil der Kosten^3,4 besonders wenn Einkanal-Einheiten verwendet werden. BLI misst Änderungen im reflektierten Licht Interferenzmuster zwischen einem Referenz-Layer (Kontrolle) und der Biolayer Oberfläche (experimentell). Die daraus resultierende Veränderung in Phase wird als kinetische und quantitative Ablesung⁵in Echtzeit gemessen. Die Biosensor-Oberfläche, mit spezifischen Immobilisierung Chemikalien, ist physisch zwischen Lösungen, im Gegensatz zu Puffer Änderungen von mikrofluidischen Ansätze in SPR, für Messungen über Wellenlänge Phase Durchbiegungen übertragen. Stoffaustausch Effekte werden durch Rühren der Lösung verhindert. Im Gegensatz zu SPR sind diese Systeme sehr nützlich bei der Bewertung von komplexen aus groben biologischen Proben. Die physikalische Parameter gemessen während BLI Experimente in erster Linie richtet sich nach einer Änderung der Masse oder Dicke an der Biosensor-Oberfläche, die aus Protein komplexe Montage bzw. Demontage ergibt.

Diese Faser faseroptische Biosensoren sind einfach zu bedienen und relativ preiswert. Einer der aufstrebenden nützliche Aspekte von BLI ist die einfache Entfernung der neu zusammengestellten Proteinkomplexe von der Oberfläche. Eine neuere Anwendung dieser Methode erlaubt unser Labor zu beobachten, die Real-Time-Kinetik der großen Skala pH induzierte Protein Struktur Neuordnung der Milzbrand Toxin schützendes Antigen (PA) Komponente, wie die Prepore (PA_Prepore) umgestellt sein Pore (PA,_pore) Form. Dieser Übergang an der Spitze der Biosensor wurde überprüft mittels Elektronenmikroskopie (EM)⁶. Entfernung von komplexen von Biosensor Oberflächen vermeidet größere Verdünnung Mengeneffekte häufig anzutreffen, wenn komplexe aus Chip Oberflächen freigibt, wenn Mikrofluidik-Systeme im Einsatz.

Bei den laufenden Arbeiten sind Milzbrand-Toxin-komplexe montiert und auf der Oberfläche der Biosensor zerlegt und dann in Mikroliter Bände veröffentlicht. Die daraus resultierenden komplexen Bauteile sind orthogonal mit EM und Massenspektrometrie (MS) validiert.

Protokoll

1. Montage der definierten makromolekulare Komplexe auf Biolayer Interferometrie (BLI) Biosensor Oberflächen

1. Montage von prepore Milzbrand Toxin Komplex auf einer PDEA geändert Amine reaktive Biosensor Oberfläche
   1. Hydrat ein reaktives Amin zweiter Generation (AR2G) BLI Biosensor Tipp in 250 µL Wasser zehn Minuten lang.
   2. Programm Schritt Zeiten, auf die Software bedienen des Geräts BLI in Tabelle 1aufgeführt (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Starten Sie den BLI laufen durch Eintauchen der Biosensor-Spitze in 250 µL Wasser für 30 s, eine erste Grundlinie der Biosensor Dicke und Dichte zu messen.
   4. Aktivieren der Biosensor durch Eintauchen der Spitze in 250 µL 50 NHS (N-Hydroxysuccinimide) und 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) für 7 Minuten.
   5. Tauchen Sie die aktivierte Biosensor in 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) in 0,1 M Borat Puffer (pH 8,5) für 5 Minuten, eine aktivierte Thiol-reaktiven Oberfläche erzeugen aufgelöst.
   6. Tauchen Sie die aktivierte Thiol-reaktive Biosensor in 250 µL Lösung mit 100 nM E126C LF_N 10 mM Natrium Acetat pH 5,0, 100 mM NaCl, Puffer für 5 Minuten.
   7. Tauchen Sie die Spitze der LF_N in 50 mM L-Cystein, 1 M NaCl, 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0, 4 Minuten, um alle verbleibenden freien Thiol-reaktive reaktivgruppen zu stillen.
   8. Tauchen Sie die abgeschreckt LF_N Tipp in 50 mM Tris, 50 mM NaCl für 2 Minuten Puffer Grundlinie etablieren.
   9. Tauchen Sie abgeschreckt LF_N Tipp in 0,5 µM schützendes Antigen Prepore (PA_Prepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl 5 Minuten um die LF_N-PA_Prepore Komplex zu schaffen.
   10. PA_Prepore verbunden ist, entfernen Sie die Spitze von der PA-_Prepore -Lösung und Tauchen Sie die Spitze in 50 mM Tris, 50 mM NaCl für 30 Sekunden unspezifisch gebundenen PA_Preporeabzuwaschen.
   11. Tauchen Sie den LF_N-PA-_Prepore Komplex in 0,5 µM CMG2 Rezeptor (ohne die transmembrane Domäne), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, für 5 Minuten.
   12. Tauchen Sie die LF_N-PA_{Prepore -}CMG2 Komplex in 50 mM Tris, 50 mM NaCl für 30 Sekunden um alle ungebundenen CMG2 Form Pre-Endosomal Komplex abzuwaschen.
   13. Release für EM-Analyse, die LF_N-PA-_Prepore-CMG2 Komplex von der Biosensor-Spitze durch Eintauchen der Spitze in 5 µL 50 mM DVB-t, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, in einem PCR-Rohr.
   14. Release für Tandem-MS-Analyse der Peptide aus dem Komplex, der LF_N-PA-_Prepore-CMG2 Komplex von der Biosensor-Spitze durch Eintauchen der Biosensor in 5 µL 50 mM DVB-t, 6 M GuHCl (Keratin-frei), 25 mM Ammonium Bicarbonat pH 8.0 innerhalb einer PCR tube . Dies erfolgt auf verschiedenen Biosensor als jene für die EM-Analyse verwendet.
2. Montage der Pore Milzbrand Toxin Komplex auf PDEA geändert Amine reaktive Biosensor Oberfläche
   1. Um die Anlage nach dem pH-Wert Übergang anzuzeigen, führen Sie Schritte 1.1.1-1.1.12 im vorherigen Abschnitt, um die LF_N-PA_Preporegenerieren-CMG2-Komplex.
   2. Tauchen der Biosensor-Spitze in einer 10 mM Acetat pH 5.0 für 5 Minuten, um den Übergang von der PA_Prepore PA_pore Übergang zu initiieren. Dieser Übergang wird durch Erhöhung der Amplitude (ca. 0,2 nm) gefolgt von einem größeren Rückgang der Amplitude, die Hypothese ist zu erheblichen oder komplette Rezeptor Dissoziation Bindungsaffinität vermindert.
   3. Tauchen Sie LF_N-PA_pore Tipp in 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0, für 30 Sekunden, um sauren Puffer abwaschen.
   4. Für die EM-Analyse-Probe Tauchen der Biosensor-Spitze in eine Lösung mit 1,25 mM Micellen (2,5 mM MSP1D1, 25 mM Na-Cholate 162,5 mM POPC) für 5 Minuten, um zu verhindern, dass Aggregation in Lösung nach Disulfid-release.
   5. Für EM-Analyse release LF_N-PA_{Pore -}Micelle Komplex von der Biosensor-Spitze durch Eintauchen der Spitze in 5 µL 50 mM DVB-t, 50 mM Tris, 50 mM NaCl in einem PCR-Rohr.
   6. Für Tandem-MS-Analyse der Peptide aus dem Komplex-release die LF Tipp_N-PA_Poore Komplex (keine Micelle) aus der Biosensor durch Eintauchen der Biosensor in 5 µL 50 mM DVB-t, 6 M GuHCl (Keratin-frei), 25 mM Ammonium Bicarbonat pH 8.0 innerhalb einer PCR Rohr. Dies erfolgt auf verschiedenen Biosensor als jene für die EM-Analyse verwendet.

2. Visualisierung und Validierung veröffentlicht Makromolekulare Versammlungen von BLI Biosensoren durch Negative Fleck-Elektronen-Mikroskopie

1. Glow discharge ein Kohlenstoff-beschichtete Cu 300 Raster. Typische glühen Einregulierung Entlastung 0,38 mBar stabile Atmosphärendruck, negative 15 mAmps 20 Sekunden, dann mit Luft entlüften.
2. Raster zwischen sauberen Pinzette zu sichern.
3. Pipette 4 µL veröffentlichten komplexe Probe im PCR-Rohr auf das Gitter und Adsorption für 60 s zu ermöglichen.
4. Docht entfernt verbleibende Flüssigkeit mit einem Filterpapier Keil.
5. Färben Sie das Raster durch pipettieren 5 µL von 0,75 % 0,02 Mikron gefiltert Uranyl Formiat und Feuchtigkeitstransport Weg überschüssige Fleck nach 5 Sekunden. Lassen Sie Raster bei Raumtemperatur trocknen.
6. Blick auf Probe Gitter mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop gebeizt.

3. Identifizierung der komplette Pre-Endosomal Anthrax Toxin Komplex (LF_N-Pa-_Prepore-CMG2) und Transitioned Komplex (LF_N-Pa_pore ohne CMG2) mittels Massenspektrometrie.

1. Verdünnen Sie veröffentlichte Proben 20 µL und inkubieren Sie für 1 Stunde.
2. Fügen Sie 2 µL 55 mM Iodoacetamide, 25 mM Ammonium Bicarbonat, pH 8.0 und inkubieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln (mit Alufolie abgedeckt).
3. Verdünnen Sie die Probe mit 100 µL 25 mM Ammonium Bicarbonat, pH 8.0, Guanidin-Hydrochlorid-Konzentration unterhalb von 1 M zu reduzieren.
4. 5 µL der Sequenzierung Grade modifiziert Trypsin auf 20 ng/µL hinzufügen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
5. Hinzufügen einer Endkonzentration von 5 % auf den pH-Wert zu senken, Eisessig < 3, dann reduzieren Sie die Lautstärke auf 10 µL im Vakuum Konzentrator.
6. Übertragen Sie die peptidlösung auf den Autosampler nLC 1200 uHPLC auf Probenteller.
7. Laden Sie 5 µL auf der Bühne der Ionisation der MS die peptidlösung auf einem uHPLC reversed-Phase Säule montiert.
8. Waschen Sie Spalte mit 15 µL 0.1 % Ameisensäure mit einer maximalen Rate von 5 µL/min / max. Druck von 800 Psi.
9. Eluieren Sie Peptide aus der rückgängig-Phase C18-Spalte mit einer Durchflussrate von 350 nL/min über einen Zeitraum von 90 min mit einem linearen Farbverlauf von 5 % bis 40 % des Lösungsmittels B in A + B (Lösungsmittel A: 0,1 % Ameisensäure; Lösungsmittel B: 95 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure).
10. Medikamentenfreisetzende Peptide auf Linie mit Tandem MS zu analysieren.
    1. Legen Sie die Ionisierung Quelle 2500 Volt und Ionen-Transfer Temperatur bis 250 ° C.
    2. Arbeiten mit dem Massenspektrometer unter Automatische Steuerung kontinuierlich eine MS gefolgt von so vielen Tandem MSM möglichst innerhalb von 3 s, Scannen mit CID und eine normalisierte Aufprallenergie von 35.
11. Peptid und Protein-Komponenten mit Standardmethoden zu identifizieren. Für diese Arbeit wurden zwei Sätze von Peptid und Protein-Analyse durchgeführt.

Ergebnisse

Die Fähigkeit zu überwachen und zu validieren, die Versammlung der großen makromolekularen komplexe ist ein entscheidender Schritt zum Verständnis der Spezifität und Funktionalität des großen biomolekularen Baugruppen. Die Ergebnisse der hier vorgestellten Methoden zeigen die Leichtigkeit, mit welcher große Proteinkomplexe (> 150 kDa Masse) mit Biolayer Interferometrie, alle während der Überwachung der Kinetik und der Amplitude der Baugruppe montiert werden kann. Die einzigartige Kompaktheit der Biosensor Oberfläche ermöglicht eine Montage Analyse erweitert werden, durch Freisetzung von montierten Anlagen in kleine Microvolumes. Diese Microvolumes kann verwendet werden, um die erste physikalische Struktur der komplexe mit EM zu visualisieren und die Identität des komplexen Komponenten mit MS. Abbildung 1zeigt ein schematischer Überblick über diesen Gesamtprozess.

Ein Schlüsselelement für die erfolgreiche Montage und Überprüfung der Makromolekulare Komplex auf der Biosensor-Oberfläche beinhaltet die richtige Ausrichtung des Proteins Startwert. Dies sorgt dafür, dass die Protein-Protein Interaktion Websites zugänglich, nicht sterisch blockiert und Weg von der Biosensor-Oberfläche optimal positioniert sind. Wie in Abbildung 2dargestellt, wird die korrekte Ausrichtung des komplexen Milzbrand-Toxins erreicht, indem ein speziell entwickelte N-terminale Fragment des tödlichen Faktor (LF_N) sodass die LF_N-PA-_Prepore -Bindungsstelle immer positioniert wird Gegenteil der Biosensor kovalente Bindung Seite^6,7. Der nachfolgende Aufbau des Komplexes mit Bindung von PA an der LF_N BLI Biosensor gefolgt von löslichen CMG2 Bindung an PA schafft letztlich eine Translokation zuständigen Milzbrand Toxin Komplex.

BLI Sensogram Spur ist ein Echtzeit-Lesen aus der Amplitude Veränderungen durch bestimmte Zugabe der Milzbrand-Toxin-Komponenten auf der Biosensor hinzugefügt werden. Abbildung 3 zeigt ein Modell des Komplexes voraussichtlich Form bei diesem Schritt in diesem Prozess eine repräsentative Spur zugeordnet. Der erste Aufstieg ist LF_N Verladung auf die Spitze. Nach dem abschrecken und Grundlinie, PA_Prepore bindet dann an LF_N gefolgt von dem Zusatz von löslichen CMG2 Rezeptor, was zu den versammelten Pre-Endosomal-Komplex der LF_N-PA_Prepore-CMG2. Fortschritt gegenüber der späten Endosom Umwelt, unterliegt der gesamte Komplex einen niedrigen pH-Wert Puls (pH 5,0), die den Rezeptor binden, so dass die Prepore für den Übergang zu seiner erweiterten Membran eingefügt Pore Konformation schwächt. ⁶ Sensogram Spuren von der Versauerung Schritt sind in Abbildung 4dargestellt. Die anfängliche Zunahme oder "Stachel" Amplitude ist wahrscheinlich die Pore Verlängerung⁶ , der vor der Abnahme in der CMG2-Rezeptor-Bindung erfolgen muss. Der größere Amplitude Rückgang ist wahrscheinlich erhebliche oder komplette Rezeptor Dissoziation aufgrund verminderter Bindungsaffinität. Frühere Arbeiten in diesem Labor angegeben, dass CMG2 Bindung an die voll ausgefahrenen PA_pore vernachlässigbar im Vergleich zu den CMG2-PA_Prepore Interaktion⁶. Darüber hinaus beobachtet die kinetische Spur von Sensogram in allen Sensograms der LF_N-PA_Prepore-CMG2 Übergänge, LF_N-PA mit einem pH-Tropfen,_pore ist reproduzierbar über mehrere Durchläufe.

Vor und nach der Säuerung der Biosensor befestigt-komplexe leicht zur Visualisierung von negativen Fleck EM und Identifikation von MS (Abbildung 5) freigegeben. Repräsentative komplexe aus der EM-Ergebnisse sind in Abbildung 6dargestellt. Pre-Endosomal Probe Raster zeigen dichten Einklang mit intakten ternäre komplexe bestehend aus LF_N-PA-_Prepore-CMG2. Post-Versauerung komplexe Netze zeigen PA umgestellt um pore und solubilisiert durch Einbeziehung der Micelle mit keine offensichtliche CMG2 Dichte.

Die Identitäten von der Pre- und Post-Übersäuerung-komplexe wurden durch MS überprüft. Eine Datenbank wo die Sequenzen von PA, P13423; LF_N, P15917; und CMG2, P58335 wurden in einem Hintergrund einer Maus-Proteine-Datenbank abgeleitet aus dem NCBInr-Repository aufgenommen. Nur der interessierenden Proteine stammen aus dieser ersten Datenbank-Suche, mit der folgenden Aminosäure-Abdeckung für die ternären und binären komplexe: 54 % und 22 % PA, 36 % und 6 % für LF und 43 % für CMG2, bzw. (CMG2 wurde auf die binäre Anlage nicht erkannt). Um die Protein-Aminosäure-Berichterstattung zu maximieren, erfolgte eine zweite Peptid/Proteinidentifizierung mittels einer Proteindatenbank enthält nur die drei Proteine des Interesses. Pre-Endosomal MS Proben enthalten Peptide aus allen drei Toxin-Komponenten mit 60,46 % und 67.97 % 54,15 % Abdeckung für LF_N, PA und CMG2, bzw. (Abbildung 7). In Abbildung 8dargestellten Ergebnisse Post-Endosomal enthielt nur Peptide aus LF_N und PA (57.41 % und 67,79 % Abdeckung, beziehungsweise). Der Mangel an CMG2 in den Post-Endosomal Proben stehen im Einklang mit der beobachteten BLI nm Abnahme während der Porenbildung.

Abbildung 1. Schematische Übersicht zur Analyse von Proteinkomplexen auf montiert und isoliert von BLI Biosensor mit EM und MS. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2. Biosensor-Aktivierung: der erste Schritt in bestimmten Assembly Ausrichtung auf BLI Biosensor. E126C Lethal Faktor N-terminale Domäne, (LF_N) ist durch eine Thio-Verknüpfung erstellen die richtig orientierte PA_Prepore verbindliche Schnittstelle verbunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Überwachung von Milzbrand-Toxin-Montage und Demontage mit BLI: der Sensogram zeigt Veränderungen der Amplitude als Funktion der Zeit durch spezifische Ergänzung der Anthrax Toxin-Komponenten auf der Biosensor, beginnend mit dem LF_N laden (Schritt 4 hinzugefügt werden ( Tabelle 1). PA_Prepore wird dann auf der Oberfläche, gefolgt von dem Zusatz von löslichen CMG2 Rezeptor geladen. Der montierte Pre-Endosomal-Komplex besteht aus einem LF-PA_Prepore- CMG2. Fortschritt gegenüber der späten Endosom Umwelt, montieren die gesamte funktionale Milzbrand Toxin unterliegt einem niedrigen pH-Wert Puls (pH 5,0), die den Rezeptor binden, so dass die Prepore für den Übergang zu seiner erweiterten Membran eingefügt Pore Konformation schwächt. Exposition der Membran überspannt Pore ist bestätigt und durch Zugabe von Micellen solubilisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. BLI Sensogram CMG2 Release: Spuren von der Versauerung Schritt zeigen eine erste Erhöhung oder "spike" in der Amplitude gefolgt von einem größeren Rückgang der Amplitude, die dürften pore Formation und Rezeptor Dissoziation. Vertikale gepunktete rote Linien bezeichnen Start eines neuen Schrittes. Sensograms sind in den fettgedruckten gepunktete rote Linie ausgerichtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5. Analyse von Protein-komplexe auf montiert und isoliert von BLI Biosensor mit EM und MS: Biosensor beigefügte Anlagen leicht in 5 µL Puffer mit DVB-t erscheinen für die Visualisierung von negativen Fleck EM und Identifikation von Frau , klicken Sie bitte hier eine größere Version dieser Figur sehen.

Abbildung 6. Visualisierung von Proteinkomplexen mit EM: Pre-Endosomal Probe Raster zeigen dichten Einklang mit intakten ternäre komplexe bestehend aus LF_N-PA-_Prepore-CMG2. Post-Endosomal komplexe Netze zeigen PA umgestellt um pore und solubilisiert von Micelle mit keine offensichtliche CMG2 Dichte. Modelle der vorhergesagten komplexe (linke Seite) sind in der gleichen Größenordnung wie einzelne Partikel angezeigt. Partikel mit prognostizierten Protein (basierend auf Größe des EM-Dichte) eingefärbt werden unterhalb jedes Partikel angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7. Überprüfung der Proteinkomplexe mit MS: Pre-Endosomal MS Proben enthalten Peptide aus allen drei Toxin-Komponenten mit 60,46 % und 67.97 % 54,15 % Abdeckung für LF_N, PA und CMG2, beziehungsweise. Peptide mit einer false Discovery Rate (FDR) gleich oder größer als 5 % in gelb angezeigt, FDR gleich oder größer als 1 % in grüner Schrift angezeigt erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8. Überprüfung der Proteinkomplexe mit MS: Post-Endosomal Proben enthalten Peptide aus LF_N und PA (57.41 % und 67,79 % Abdeckung, beziehungsweise), aber nicht CMG2. FDR gleich oder größer als 5 % in gelb angezeigt, FDR gleich oder größer als 1 % in grüner Schrift angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Schritt	Zeit (s)	Beschreibung
1	30	Anfängliche Basislinie
2	420	Aktivierung
3	300	Aktivierung
4	300	LFN be-
5	240	Cystein quench
6	120	Basislinie
7	300	PAPrepore Verein
8	30	Basislinie
9	300	CMG2 Verein
10	30	Basislinie
11	300	Saure Übergang
12	30	Basislinie
13	300	Micelle Verband

Tabelle 1. Schritt mal für Single BLI ausführen Montage Milzbrand-Toxin-Komplex. Beachten Sie, dass Basispläne verwendet werden, um wegspülen ungebundenen Protein aus vorherigen Schritt bzw. eine neue Puffer Basislinie einzurichten.

Diskussion

Diese Demo wird veranschaulicht, wie makromolekularen Komplexbildung leicht überwacht werden kann, mit Biolayer Interferometrie mit EM visualisiert, und überprüft mit MS, alle mit Microvolumes in einer kurzen Zeitspanne. Strukturelle Montage und beobachteten komplexe die biologisch relevanten Vorhersagen, weitere Validierung dieser kombinierten Methode zu folgen. Wie im Abschnitt "Ergebnisse" erwähnt, erfordert das Schlüsselelement für den Erfolg der Versammlung rational konstruiert Cystein Mutagenese um sicherzustellen, dass die Protein-Protein-komplexe Schnittstellen von der Biosensor-Oberfläche richtig ausgerichtet sind.

Bisherige Systemen habe BLI und MS Techniken, um Proteinbindung von zwei und drei-Komponenten-Systeme sowie Integrität der Rezeptorbindung exprimierten Proteins zu bewerten, aber in beiden Fällen die Methoden wurden nicht entwickelt, um das Tandem EM/MS nutzen ^8,9zu nähern. Die nur andere Interferometrie-System, das MS-Analyse helfen, Interaktionen prägen kombiniert wurde eine Dual-Polarisation Interferometrie¹⁰. Leider ist dieses System nicht mehr für den allgemeinen Gebrauch zur Verfügung. Wie in der Einleitung erwähnt, gab es eine Reihe von Studien abgeschlossen, wo Proben auf SPR-ähnliche Biosensor Oberflächen gebildet und MS-Analyse entnommen wurden. Keines dieser Beispiele führte in komplexen mit EM visualisiert.

Die Grenzen dieser sequenziellen Methode können zahlreiche sind aber lösbar. Für die anfängliche Ruhigstellung und daher Stiftung Schritt der Versammlung würde mangelnde Kenntnis der strukturellen Interaktion Oberflächen behindern sicherlich Fortschritte überwachen Erstmontage Phasen zugeordnet. Das Fehlen von Strukturinformationen angesprochen werden kann, indem Sie entwerfen ein veränderter Stiftung errichten wo Anlage Chemikalien (z. B. Sulfhydryl Glyko-Disulfid Verbindungen / His-Tag Positionierung) können in verschiedenen Regionen innerhalb des Kerns verschoben werden Montage-System. Im Falle der Milzbrand Giftstoff komplex war es ein Glück, dass die Struktur der LF_N PA_Prepore verpflichtet zur Verfügung¹¹ist. Rationelle Platzierung von veränderter Cystein wurde in Regionen abseits der PA_Prepore Bindung Gesicht lokalisiert. Mit Cystein Gestänge Chemikalien ist es vorzuziehen, dass keine andere reaktive Cysteine auf der Oberfläche Protein vorhanden sind.

Es gibt verschiedene Anlage-Chemikalien, die verwendet werden können, bestimmte Anlage Website auf ein Protein Oberflächen zu konstruieren. Eine der beliebtesten spezifische Anlagen beinhaltet Positionierung eine Biotin Glyko-an einer genau definierten Stelle auf der Oberfläche Protein-¹². Leider, Biotin-Bindung zu einem Streptavidin oder Avidin beschichtete Oberflächen ist ziemlich eng. Umkehrung der Bindung Interaktion ist nicht einfach. Die Verwendung von ein veränderter His-Tag an der N - oder C-Terminus und die spätere einfache Befestigung an Ni-NTA-Oberflächen ist ein universeller Anwendung der Affinität Immobilisierung. Die Vorbehalte für Montage Befestigung technikstandorte mit seinem getaggt Systeme gehört natürlich die Anforderung, die die N - und C-Termini der Core-Montage-Protein bleiben ausgesetzt und getrennt, so dass die Anlage einfach ist. Als muss die Interaktion-Schnittstelle des Core-Montage-Protein mit allen Montageprozesse, im Laufe des komplexen Baugruppe verfügbar bleiben.

Vielleicht ist das häufigste Anliegen der Biosensor Oberfläche Chemikalien mit unspezifischen Bindung. Streptavidin-Tipps sind oft eine Quelle der erheblichen unspezifischen Bindung Effekte. Disulfid verknüpft Biotin kann verwendet werden, um ganz bestimmte komplexe hinterließ die reduzierten S-Biotin-Verknüpfung fest gebunden an immobilisierte Streptavidin Biosensoren¹³freizugeben. Es gibt andere reversiblen Chemikalien immer zur Verfügung, wie z. B. Iminoboronates und zu einem geringeren Ausmaß Ketoamide¹⁴. Dieses Feld ist derzeit unterentwickelt, aber es gibt großes Interesse an der Weiterentwicklung von reversible kovalente Protokolle, um off-Target Drogenwirkungen Toxizität zu vermeiden, die häufig den Einsatz von kovalenten zielgerichtete Medikamentenentwicklung begleiten.

Eine Einschränkung der Verwendung von EM, um komplexe zu visualisieren ist Interpretation, vor allem in Fällen, wo die Strukturen der montierten Anlagen zunächst nicht bekannt sind. Die räumliche Lage von Komponenten in einem undefinierten montierten Makromolekulare Komplex kann unter Verwendung monoklonaler Antikörper (mAb) als spezifische kinetische und strukturelle Marker identifiziert werden. Zum Beispiel, sobald ein Komplex gebildet wird, können monoklonale Antikörper hinzugefügt werden, auf bestimmte Komponenten binden. Diese Methode wird häufig in EM verwendet, um bestimmte Komponenten innerhalb von großen Baugruppen¹⁵zu identifizieren. Eine weitere Einschränkung bezieht sich auf die Größe der Anlage, zwar gab es Fälle wo definierte symmetrische Querschnitte so klein wie 70 kDa (GroES Heptamer) sind leicht gelöst mit negative Fleck EM. Montierte Anlagen, die durch EM analysiert werden sind in der Regel in der Größenordnung von ~ 100 Å Durchmesser oder höher. Vor kurzem jedoch so klein wie 20 kDa Proteine aufgelöst wurden und niedriger Auflösung Strukturen bei Superior Färbung Methoden¹⁶gewonnen wurden.

Für MS-Analyse kann die erhöhte Empfindlichkeit der aktuellen MS Instrumentierung bis auf die Ebene der femtomolare (Attomoles) in einigen Fällen die Nachweisempfindlichkeit BLI erhöhen. Es ist sehr denkbar, dass Protein-Signale, die einen minimale aber wiederholbaren Anstieg der Amplituden zeigen Identifikation des betreffenden Proteins führt. Darüber hinaus führt sondieren Proteinprotein Interaktionen mit einem der Partner auf der Biosensor und andererseits in einem zellulären Milieu angebracht in der Tat eine Reinigung und anschließend leichter Erkennung des neu gebildeten Komplexes. Eine Einschränkung, die mit den aktuellen hochempfindlichen MS-Systemen zu beachten ist, dass das Protein des Interesses möglicherweise nicht in der Datenbank, aber diese Beobachtung selten ist (z. B. Proteome von seltenen Arten). Wenn die Sequenzen der interessierenden Proteine bekannt sind, ist dieses Problem leicht gelöst, durch die Aufnahme der Aminosäure-Sequenz benutzt in einer Hintergrund-Protein-Datenbank (wie in dieser Arbeit im Protokoll Abschnitt beschrieben). Eine weitere mögliche Einschränkung der Methodik resultieren aus den Widerstand eines Proteins an Trypsinolysis. Trypsin-Verdauung ist in der Regel die Standardmethode für Bottom-up Proteinidentifikation. Proteine können jedoch resistent gegen Trypsin sein, wenn sie nicht Arg und Lys Rückstände oder Zugriff auf diese Rückstände werden durch die gefaltete Struktur begrenzt. Diese Einschränkungen werden jeweils durch Alternative oder eine Kombination von Proteasen oder auch einer sich entfaltenden Reagenz (Harnstoff oder Guanidin HCl, gemäß 1.1.14 und 1.2.6) vor enzymatischen Verdauung aufgelöst.

Mögliche Erweiterungen dieser Methodik sind erlaubt dem Benutzer, zu folgen und zelluläre Montage komplexe aus Rohöl zellulären Lysates zu identifizieren. Wie sich herausstellt, Tests für Baugruppenkomponenten in konzentrierter Zellextrakten ist einfach durchzuführen, unter Verwendung der Biolayer Interferometrie Verfahren. Im Gegensatz zu den häufiger verwendeten mikrofluidischen basierte Methoden sind anfällig für Verstopfung und sensible Aggregation, BLI-Ansatz lässt sich direkt Biolayer Sensor Tipps in groben Extrakte zusammenzubauen möglicherweise bestimmte komplexe direkt eintauchen aus diesen konzentrierten unreinen Proben. Einmal montiert, ist es durchaus möglich mit spezifischer Antikörper Sonden im Nachgang zu der BLI-System weiter zu identifizieren und sogar quantitate Verdacht Komponenten in Zellextrakten, die identifiziert wurden mit der Microvolume MS-Methode. Wieder ist hier der Schlüssel zu definierten, richtig ausgerichtet Kern Proteine verwenden Sie als spezifische Affinität Sonden.

Die Möglichkeit, die Prepore um Übergangsprozess kinetisch mit BLI pore anzeigen werden sehr nützlich bei der Identifizierung von potenziellen "Antitoxin" niedermolekularer Hemmer der Protein-Übergänge, die speziell unter späten Endosomal, niedrigen pH-Wert (5.0) Funktion Bedingungen. Dieser pH-Wert induzierte Prepore, Übergang pore gehemmt wird in Anwesenheit von Stabilisator (osmolyten) wie Glycerin oder Saccharose Falten und verleiht so starke Unterstützung für die Entwicklung von spezifischen gezielte klappbarer Stabilisatoren, die PA zu verhindern_pore Formation. Diese spezifischen Ansatz vermeidet und ersetzt grobe Aggregation basierende Assays wo pH führen zu Eiweiß Niederschlag fällt. Diese letztere Methode führt zwar gut für die Vorsortierung Hauptmethoden, häufig zu falsch positiven Ergebnissen wo hemmen bestimmte Verbindungen, die Aggregation, anstatt die tatsächlichen molekularen Übergänge.

Die nachgeschaltete Beobachtungen der Struktur und Identifikation der montierten Einzelkomponenten in kleinen Microvolume Proben können auch bei der Validierung von potenziellen Bleiverbindungen nützlich sein. Dies kann in Fällen angewendet werden, wo bestimmte Baugruppe Stabilisierung oder Destabilisierung das Zielergebnis ist. Diese kinetische/Struktur/Identifikation parallelen Ansatz eignet sich für die Gültigkeit dieser Verdacht Blei zusammengesetzte Effektoren der Versammlung direkt bestätigen und dient als eine vernünftige sekundäre Screening Schritt oder mittleren Durchsatz Ansatz.

Cryo-EM ist eine nützliche Technik, um die atomare Details der Makromolekül-komplexe in verschiedenen Stadien der Versammlung zu studieren. Vor der Vorbereitung Cryo-EM-Proben, ist es wichtig, zunächst zu überprüfen, ob ein Präparat einigermaßen reinem homogenen komplexe mit negativen Fleck EM enthält. Hierin die vorliegende Arbeit zeigt Montage von Proteinkomplexen auf BLI Biosensor Oberflächen, Veröffentlichung dieser komplexe für EM-Visualisierung und Kennzeichnung dieser Bauteile mit MS. Diese besondere Methode der kontrollierten Versammlung und Freigabe ist nützlich bei der Erzeugung sehr spezifische Protokolle, die homogene sequentielle Probenvorbereitung für negative Fleck EM, ein notwendiger Schritt zu, die nachgewiesen werden muss verbessern, bevor voran zu Cryo-EM. Um niedrige Auflösung 3D Struktur zu erhalten, bräuchte nur 30-50 Partikel des Komplexes eine konische Tilt-Serie (70 verschiedenen 2D-Bild Ansichten pro Partikel) durchführen, vorausgesetzt, es gibt Orientierung Vielfalt (mehrere verschiedene Ansichten).

Im Hinblick auf die Verbesserung der MS Methoden, weiter Fortschritte in der Empfindlichkeit und Verringerung des Volumens der Probe zu verbessern. Nano-Flows und Ultra-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zusammen mit der Entwicklung von Massenspektrometern mit einem schnellen Duty Zyklus, erhöhte Empfindlichkeit und Auflösung. Kürzlich erfolgten Einführung der Orbitrap-Massenspektrometer, erleichtert insbesondere die neueste Version (Orbitrap Fusion Lumos und seine erwartete Nachfolger Orbitrap Fusion Lumos 1 M) als auch die Suchalgorithmen stark dabei.

Die aktuelle Methodik kinetische Montage und Demontage von Milzbrand-Toxin-Komponenten mithilfe von markierungsfreie BLI Methoden überwacht und bewertet die Struktur und die Identität dieser Komponenten mit EM und MS, bzw.. Die Verwendung von einem einfachen Einkanal BLI System gekoppelt mit Routine negative Färbung EM Analyse und elementare Techniken der MS sind mehr als ausreichend, um eine Montage zu charakterisieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 mL black microtubes	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å	ThermoFisher Scientific	164561
Acetic acid glacial	Fisher	A38SL-212
Acetonitrile	Fisher	A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips	Forte Bio	18-5092
Ammonium bicarbonate	Fisher	A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Boric acid	Fisher Scientific	10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2			Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid	Electron Microscopy Sciences	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Formic acids	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals,LLC	100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain			Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system	Ted Pella, Inc	91000
Protective Antigen prepore			Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles	Fisher Scientific	09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sequest HT search engine	ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	BP334-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Sodium cholate	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Uranyl formate (UF)	Electron Microscopy Sciences	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487