Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Özet

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Özet

İçinde vivo proteinler çoğu kez büyük makromoleküllerin kompleksleri nerede bağlama özgüllük ve dinamikleri sonuçta fonksiyonel çıkışlarını dikte parçası. Bu çalışmada, pre-endosomal şarbon toksin toplandı ve karmaşık endosomal geçiş. İlk olarak, bir sistein mutant öldürücü faktör (Eğer_N) N-terminal etki alanı biolayer Interferometry (BLI) biyoalgılayıcı (K_d 1 nM) bağlamak koruyucu antijen (PA) prepore sağlayan en iyi bir yönde kaplin disülfür aracılığıyla bağlı olduğu. En iyi şekilde odaklı Eğer_N-PA_prepore karmaşık ardından çözünür kapiller morphogenic Gen-2 (CMG2) hücre yüzey reseptör için bağlar (K_d 170 pM), elde edilen pH 7.5 istikrarlı bir temsilcisi şarbon pre-endosomal kompleks içinde. Bu montajı karmaşık sonra PA_prepore eklenen membran gözenek durumuna geçiş için geç endosome çevre temsilcisi asitleştirme (pH 5,0) tabi tutulur. Bir zayıf arasındaki bağı CMG2 reseptör ve eğer_N-PA_gözenek CMG2 önemli bir ayrılma üzerinden geçiş gözenek_gözenek bu PA devlet sonuçlanır. Eğer_N biyoalgılayıcı yüzeye thio-eki kolayca dithiothreitol tarafından tersine çevrilir. Azaltma BLI biyoalgılayıcı yüzeyinde bültenleri Eğer_N-PA_prepore-CMG2 Üçlü karmaşık veya asit geçiş Eğer_N-PA komplekslerinin_gözenek microliter birime. Yayımlanan kompleksleri vardır o zaman görüntülenir ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi kullanılarak teşhis etti. Bu deneyler nasıl kinetik montaj/demontaj etiket içermeyen BLI yöntemlerini kullanarak belirli protein kompleksleri, izleme ve değerlendirme yapısı göstermektedir ve bu BLI kimlik kompleksler elektron mikroskobu ve kitle tarafından monte spektrometresi, sırasıyla, çoğaltma kolay sıralı yordamları kullanarak.

Giriş

Belirlenmesi ve protein kompleksi derleme içinde vivo yöneten özgüllük anlama biyokimyasal araştırmacılar için aşırı ilgi var. Büyük heterojen protein derlemeler norm istisna vardır. Bu kavramı spektroskopik nazik hücre bozulma teknikleri kullanarak, benzeşme tabanlı arıtma yöntemleri urun değerlendirmek ve onları görselleştirme kompleksleri izole içinde vivo Meclisi izleme tarafından desteklenen yüksek çözünürlüklü kullanarak Kriyojenik elektron mikroskobu (cryo-EM). Hücre içinde derleme özgüllük kontrolünü anlamak için araştırmacılar gerekir düzenli olarak ayırma, tanımlamak ve sonuçta bu dinamik montaj/demontaj yapılar karakterize. Sık sık bu derlemeler bileşenlerini belirlemek için en yoğun olarak kullanılan moleküler aracın hücre kesintileri sırasında karmaşık istikrarı korumak üzerinde dayanır antikor tabanlı immunoprecipitation gerektirir. Çeşitli eşleşmiş analitik teknikler son zamanlarda kompleksleri mikrosıvısal dayalı yaklaşımlar, yüzey plasmon rezonans (SPR) gibi kullanarak hücre örnekleri üzerinden yakalamak için geliştirilmiştir. SPR yüzeylerden kaldırma uçuş (MALDI-TOF)^1,2matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma zamanla bu örnekleri analiz edildi. Daha kolay iletişim kurallarını kullanarak bu metodoloji ilerleyen araştırmacılar görselleştirmek ve hücresel ortamda gerçekleşmesi öngörülen kompleksleri doğrulamak izin verir. SPR Havacilik tabanlı bir sistem olduğu için sorunlar kez toplama oluşumu ortaya çıkar. Bu sorun engellemeyi sırayla, konsantrasyon sorumlu biyolojik kompleksleri bütünlüğünü düşürebilir numune dilüsyonu gerektirir.

Etiket içermeyen teknolojileri görece yeni bir gelişme biolayer Interferometry (BLI) sistem³gelişmedir. Bu belirli ışık tabanlı yansıma sistemleri Çoğalt veya en iyi taklit, SPR bağlama ve kinetik sonuçları bir kısmını özellikle tek kanal birimleri kullanıldığında maliyet^3,4 . Saçınıza bir referans katman (kontrol) ve biolayer yüzey (deneysel) arasında yansıyan ışık girişim şekillerindeki değişiklikleri ölçer. Aşamasında ortaya çıkan değişim gerçek zamanlı olarak kinetik ve nicel okuma⁵olarak ölçülür. Belirli immobilizasyon kimyaları, içeren biyoalgılayıcı yüzey fiziksel olarak mikrosıvısal yaklaşımlar SPR, dalga boyu faz deplasmanlar üzerinden ölçüm için arabellek değişiklikleri karşı çözüm arasında transfer edilir. Kütle aktarım etkileri çözüm Tantanacı tarafından engellenir. SPR, bu sistemlerin kompleksleri ham biyolojik örneklerinden değerlendirilmesinde de oldukça yararlıdır. Öncelikle BLI deneyler sırasında ölçülen fiziksel parametre kitle veya kalınlığı protein kompleksi derleme veya sökme sonuçları biyoalgılayıcı yüzeyde bir değişiklik bağlıdır.

Bu fiber optik biyosensörler kolay ve nispeten ucuz. Yeni birleştirilmiş protein kompleksleri yüzeyden facile kaldırılması BLI gelişmekte olan yararlı yönleri biridir. Gerçek zamanlı kinetik büyük ölçekli pH gözlemlemek için son bir uygulama bizim laboratuvar izin bu yöntemin indüklenen protein yapısı yeniden şarbon toksin koruyucu antijen (PA) bileşeni için prepore (PA_prepore) geçiş gibi gözenek_gözenek(PA) form. Bu geçiş biyoalgılayıcı ucunda elektron mikroskobu (EM)⁶kullanılarak doğrulandı. Biyoalgılayıcı yüzeylerden kompleksleri kaldırılması kompleksleri çip yüzeylerden Havacilik sistemleri kullanırken serbest sık karşılaşılan büyük birim seyreltme etkileri önler.

Geçerli çalışma, şarbon toksin kompleksleri monte ve demonte biyoalgılayıcı yüzeyde ve microliter birime serbest bırakmak. Sonuçta ortaya çıkan karmaşık bileşenleri uygun EM ve kütle spektrometresi (MS) kullanılarak doğrulanır.

Protokol

1. montaj Biolayer Interferometry (BLI) biyoalgılayıcı yüzeylerde tanımlanmış makromoleküllerin kompleksleri

1. Prepore şarbon toksin karmaşık bir PDEA-modified Amin reaktif biyoalgılayıcı yüzeye montajı
   1. Bir amin reaktif hidrat ikinci nesil (AR2G) BLI biyoalgılayıcı ipucu 250 µL su on dakika içinde.
   2. Program adım kez, Tablo 1' de listelenen alma birimi kontrol yazılımı ( Tablo malzemelerigörmek).
   3. Biyoalgılayıcı ipucu için 30 250 µL suda çeker tarafından çalıştırmak BLI başlatmak bir ilk temel biyoalgılayıcı kalınlığı ve yoğunluğu ölçmek için s.
   4. Biyoalgılayıcı 250 µL 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) ve 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)). 7 dakika içine belgili tanımlık uç çeker tarafından etkinleştirmek
   5. 50 mM PDEA (0.1 M bor arabelleği (pH 8,5) 5 dakika aktif bir thiol reaktif yüzey oluşturmak çözünmüş 2-(2-pyridinyldithio)ethanamine). aktif biyoalgılayıcı bırakın
   6. Aktif thiol reaktif biyoalgılayıcı 100 içeren çözüm 250 µL sokmak nM E126C Eğer_N 10 mM sodyum asetat pH 5,0, 100 mM NaCl, arabellek için 5 dakika.
   7. 50 mM L-sistein, 1 Eğer_N ipucunda bırakın M kalan herhangi bir reaktif ücretsiz thiol reaktif grup gidermek için NaCl, 0.1 M sodyum asetat, faz 5.0, 4 dakikadır.
   8. 50 mM Tris, 50 mM NaCl 2 dakika arabellek taban çizgisi oluşturun çeliklerini Eğer_N ipucunda bırakın.
   9. Çeliklerini Eğer_N ipucu 0.5 µM koruyucu antijen prepore (PA_prepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl Eğer_N-PA_prepore karmaşık oluşturmak için 5 dakika bırakın.
   10. Bir kere PA_prepore ilişkilidir, ucu PA_prepore çözümden kaldırmak ve 50 mM Tris, 50 mM NaCl olmayan özellikle ilişkili herhangi bir PA_preporesilsin 30 saniye içine belgili tanımlık uç bırakın.
   11. Eğer_N-PA_prepore karmaşık 0.5 µM CMG2 reseptör (transmembran etki alanı olmadan), içine 5 dakika için 50 mM Tris, 50 mM NaCl, bırakın.
   12. Eğer_N-PA_{prepore -}CMG2 karmaşık form pre-endosomal kompleksi için ilişkisiz herhangi bir CMG2 silsin için 50 mM Tris, 30 saniye için 50 mM NaCl içine bırakın.
   13. Eğer_N-PA_preporeEM analizi için yayın-CMG2 50 mm DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, PCR tüp içinde 5 µL içine belgili tanımlık uç çeker tarafından biyoalgılayıcı ucundan karmaşık.
   14. Tandem MS analiz peptidler karmaşık gelen için Eğer_N-PA_preporeserbest-CMG2 biyoalgılayıcı 5 µL 50 mM DTT, 6 M çeker tarafından biyoalgılayıcı ucundan karmaşık GuHCl (keratin-free), 25 mM Amonyum Bikarbonat pH 8.0 bir PCR içinde tüp . Bu EM analiz için kullanılandan farklı bir biyoalgılayıcı gerçekleştirilir.
2. Gözenek şarbon toksin PDEA-modified Amin reaktif biyoalgılayıcı yüzeyinde karmaşık Meclisi
   1. Kompleks pH geçişten sonra görüntülemek için önceki bölümde Eğer_N-PA_preporeoluşturmak için adımları 1.1.1-1.1.12 gerçekleştirmek-CMG2 kompleksi.
   2. Biyoalgılayıcı İpucu 10 mM asetat pH 5,0 5 dakika PA_gözenek geçiş için PA_prepore geçiş başlatmak içine bırakın. Bu geçiş genlik artırarak belirtilir (yaklaşık 0.2 nm) olan bir büyük genlik düşüş tarafından takip nedeniyle önemli ölçüde veya tam reseptör ayrılma olmak bağlama ilgi azaldı.
   3. Eğer_N-PA_gözenek ipucunda 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, asidik tampon yıkamak 30 saniye için bırakın.
   4. EM analiz örnek için biyoalgılayıcı ipucu disülfür yayımlandıktan sonra çözüm toplamada önlemek için 5 dakika için 1,25 mM micelles (2.5 mM MSP1D1, 25 mM Na-cholate, 162.5 mM POPC) içeren bir çözüm bırakın.
   5. EM analizi için Eğer_N-PA_{gözenek -}Micelle biyoalgılayıcı ucundan karmaşık 50 mm DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl PCR tüp içinde 5 µL içine belgili tanımlık uç çeker tarafından serbest bırak.
   6. Tandem MS Analizi peptidler karmaşık üzerinden yayın için Eğer_N-PA_poore karmaşık (micelle) biyoalgılayıcı dan İpucu 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratin-free), 25 mM Amonyum Bikarbonat pH 8.0 Inside bir PCR içine biyoalgılayıcı çeker Tüp. Bu EM analiz için kullanılandan farklı bir biyoalgılayıcı gerçekleştirilir.

2. görselleştirme ve doğrulama makromoleküllerin derlemelerden BLI biyosensörler negatif leke elektron mikroskobu tarafından yayımlanan

1. Kızdırma bir karbon kaplı Cu 300 ızgara taburcu et. Tipik kızdırma deşarj 0,38 mBar kararlı atmosfer basıncı, negatif mAmps 15, 20 saniye, havayla havalandırma ayarlarıdır.
2. Güvenli kılavuz temiz cımbız bir çift arasında.
3. 4 µL PCR tüp ızgara üzerine serbest bırakılan karmaşık örnek pipet ve Adsorpsiyon 60s için izin verir.
4. Uzak bir filtre kağıdı kama ile sıvı kalan fitil.
5. Kılavuz tarafından %0,75 0,02 mikron filtre uranyl format ve esneklik uzak aşırı leke pipetting 5 µL 5 saniye sonra leke. Oda sıcaklığında kuru ızgaraya olanak sağlar.
6. Lekeli örnek ızgaralar transmisyon elektron mikroskop kullanarak görüntüleyin.

3. kimliği tam Pre-endosomal şarbon toksin karmaşık (Eğer_N-Pa_prepore-CMG2) ve geçiş karmaşık (Eğer_N-Pa_gözenek CMG2 olmadan) kullanarak kütle spektrometresi.

1. 20 µL için serbest bırakılmış örnekleri sulandırmak ve 1 saat kuluçkaya.
2. 55 mM iodoacetamide, 25 mM Amonyum Bikarbonat, pH 8.0 2 µL ekleyin ve 1 saat içinde (alüminyum folyo ile kaplı) karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
3. Örnek ile 100 µL 25 mM amonyum guanidin hidroklorür konsantrasyonu 1 M aşağıda azaltmak için bikarbonat, pH 8.0, seyreltik.
4. Değiştirilen notu tripsin 20 ng/µL, sıralama, 5 µL ekleyin ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
5. Buzul asetik asit pH için azaltmak için % 5'lik son bir konsantrasyon ekleyin < 3, daha sonra 10 µL vakum yoğunlaştırıcı için birim azaltır.
6. Peptid çözüm örnek plakasına nLC 1200 uHPLC Otomatik Örnekleyici aktarın.
7. 5 µL peptid çözüm uHPLC ters faz sütuna MS iyonlaşma sahnede monte yükleyin.
8. %0,1 formik asit en fazla saniyede 5 µL/dk, 15 µL olan sütun ve/veya en fazla 800 PSI baskısı yıkayın.
9. Peptidler 350 nL/dk akış hızında ters faz C18 sütundan çizgisel degrade çözücü B % %5 40, A + B (çözelti c: %0,1 formik asit; %0,1 formik asit ile solvent B: %95 Asetonitril) kullanarak bir 90 dakika süre içinde elute.
10. Tandem MS kullanarak satırındaki eluting peptidler analiz.
    1. İyonizasyon kaynağı 2500 volt ve iyon transferi sıcaklığı ile 250 ° c olarak ayarlayın
    2. Kütle Spektrometre 3 s dönemde, mümkün olduğunca çok sayıda tandem MSMS tarafından takip sürekli bir MS tarama gerçekleştirmek için otomatik kontrol altında faaliyet CID ve 35 normalleştirilmiş çarpışma enerjisini kullanarak.
11. Peptid ve protein bileşenleri standart yöntemleri kullanarak tanımlayın. Bu iş için iki peptid ve protein analizi yapıldı.

Sonuçlar

Yeteneği izlemek ve büyük makromoleküllerin kompleksleri Meclisi doğrulamak özgüllük ve büyük biyomoleküler derlemeler işlevselliğini anlama yolunda önemli bir adım olduğunu. Burada sunulan yöntemleri sonuçlarını hangi büyük protein kompleksleri kolaylıkla göstermek (> 150 kDa kitle) biolayer Interferometry, süre tüm izleme kinetik ve genlik derleme kullanarak monte edilebilir. Biyoalgılayıcı yüzey benzersiz kompakt yapısı montajı kompleksleri küçük microvolumes serbest bırakarak genişletilmesi derleme çözümleme sağlar. Bu microvolumes EM kullanarak kompleksleri başlangıç fiziksel yapısını görselleştirmek için ve karmaşık bileşenleri MS kullanarak kimliğini doğrulamak için kullanılabilir. Bu sürecin şematik bir bakış Şekil 1' de gösterilen.

Bir anahtar başarılı derleme ve biyoalgılayıcı yüzeyinde makromoleküllerin kompleks doğrulama için uygun yönlendirmeyi ilk tohum protein oluşturur. Bu protein-protein etkileşim siteleri erişilebilir, sterically bloke ve en iyi şekilde konumlandırılmış biyoalgılayıcı yüzey uzak olmasını sağlar. Şekil 2' de gösterildiği gibi şarbon toksini karmaşık uygun yönlendirmeyi öldürücü faktörü (Eğer_N) özel olarak tasarlanmış bir N-terminal parçası kullanarak elde edilir eğer_N-PA_prepore bağlama site her zaman yer alıyor bu yüzden tam tersi biyoalgılayıcı kovalent ek site^6,7. Karmaşık sonraki birikimi ile bağlama PA PA için çözünür CMG2 bağlama tarafından takip eğer_N BLI biyoalgılayıcı sonuçta translocation yetkili şarbon toksin karmaşık oluşturur.

Biyoalgılayıcı eklendikçe BLI sensogram genlik değişiklikler belirli ilavesi anthrax toksin bileşenleri nedeniyle dışarı gerçek zamanlı okuma izidir. Şekil 3 gösterir temsili bir izleme işlemi bu adımda adresindeki formu tahmin karmaşık bir modeli ile eşleştirilmiş. Eğer_N ucu yükleme ilk artıyor. Sonra temel Şoklama ve PA_prepore sonra Eğer_N-PA_preporemonte pre-endosomal kompleksi kaynaklanan çözünür CMG2 reseptör eklenmesiyle takip eğer_N bağlar-CMG2. Geç endosome ortamı doğru ilerlemeye, tüm karmaşık bağlama, prepore geçiş için onun genişletilmiş membran eklenen gözenek uyum sağlayan reseptör zayıflatır düşük pH nabız (pH 5,0) tabi tutulur. ⁶ asitleştirme adım izleri Sensogram Şekil 4' te gösterilmiştir. İlk artış veya genlik ' spike' CMG2 reseptör bağlama azalma önce yürütülmelidir gözenek uzantısı⁶ olasıdır. Daha büyük genlik düşüş nedeniyle azalmış bağlama benzeşme büyük olasılıkla önemli ölçüde veya tam reseptör ayrılma var. Önceki bu laboratuvar çalışmalarında tam olarak genişletilmiş PA_gözenek CMG2 bağlama için CMG2-PA_prepore etkileşim⁶karşılaştırıldığında önemsiz belirtilir. Buna ek olarak, Eğer_N-PA_preporetüm sensograms içinde gözlenen sensogram kinetik izleme-Eğer_N-PA_gözenek bir pH damla için CMG2 geçişler üzerinde birden çok çalıştırma tekrarlanabilir.

Öncesinde ve asitlenme sonra biyoalgılayıcı bağlı kompleksleri kolayca negatif leke EM tarafından görselleştirme ve MS (Şekil 5) tarafından kimlik için serbest bırakılır. EM sonuçlarından temsilcisi kompleksleri Şekil 6' da gösterilmiştir. Pre-endosomal örnek ızgaralar, yoğunlukları Eğer_N-PA_preporeoluşan sağlam Üçlü kompleksleri ile tutarlı göster-CMG2. Sonrası asitleştirme karmaşık ızgaralar, göstermek PA gözenek için geçiş ve micelle dahil hiçbir bariz CMG2 yoğunluğu ile tarafından çözündürüldükten.

Kimlikleri öncesi ve sonrası asitleştirme kompleksleri MS tarafından doğrulanmadı. Bir veritabanı nerede dizileri PA, P13423; Eğer_N, P15917; ve CMG2, P58335 NCBInr depodan türetilmiş bir fare proteinler veritabanının bir arka planda dahil edildi. Sadece protein ilgi bu ilk veritabanı arama, Üçlü ve ikili kompleksleri için aşağıdaki amino asit kapsama elde: % 54 ve PA için % 22, % 36 ve eğer için % 6 ve CMG2, %43 sırasıyla (ikili karmaşık CMG2 değil algılandı). Protein amino asit kapsama alanı en üst düzeye çıkarmak için ikinci bir peptit/protein kimlik ilgi sadece üç protein içeren bir protein veritabanı kullanılarak gerçekleştirildi. Pre-endosomal MS örnekleri bulunan peptidler %60,46, %67.97 ve 54.15 oranında sapma ile tüm üç toksin bileşenlerinden Eğer_N, PA ve CMG2, sırasıyla (Şekil 7). Post-endosomal sonuçları, Şekil 8' de gösterilen sadece peptidler Eğer_N ve PA yer (%57.41 ve %67.79 kapsama, sırasıyla). Post-endosomal örnekleri içinde CMG2 eksikliği gözenek oluşumu sırasında gözlenen BLI nm azalma ile tutarlı.

Şekil 1. Protein kompleksleri çözümlenmesi için şematik genel bakış monte ve EM ve MS. kullanarak saçınıza biyoalgılayıcı izole Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Biyoalgılayıcı harekete geçirmek: ilk adım yönlendirme belirli derlemede BLI biyoalgılayıcı üzerinde. E126C ölümcül faktör N-terminal etki alanı (Eğer_N) düzgün odaklı PA_prepore bağlama arabirimi yaratmak bir thio-bağlantı bağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Şarbon toksin montaj ve demontaj BLI ile izleme: Eğer_N yükleme (adım 4 ile başlayan biyoalgılayıcı üzerine eklendikçe sensogram genlik değişiklikleri zaman belirli şarbon ilavesi nedeniyle bir fonksiyonu olarak toksin bileşenleri gösterir Tablo 1). PA_prepore daha sonra buna ek olarak çözünür CMG2 reseptör tarafından takip yüzeyine yüklenir. Birleştirilmiş pre-endosomal karmaşık bir Eğer-PA_prepore- CMG2 oluşur. Geç endosome ortamı doğru ilerleme için tüm bir araya fonksiyonel şarbon toksin bağlayıcı, prepore geçiş için onun genişletilmiş membran eklenen gözenek uyum sağlayan reseptör zayıflatır düşük pH nabız (pH 5,0) için tabi. Pozlama gözenek kapsayan membran doğruladı ve buna ek olarak micelles tarafından çözündürüldükten. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Saçınıza sensogram CMG2 sürüm: asitleştirme adım göstermektedir ilk artış veya 'genlik içinde büyük olasılıkla daha büyük bir genlik düşüş takip spike' gözenek oluşumu ve reseptör ayrılma, anılan sıraya göre. Dikey noktalı kırmızı çizgiler yeni bir adım başlangıcını gösterir. Sensograms kırmızı çizgi noktalı kalın hizalanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5. Protein kompleksleri analiz monte ve EM ve MS kullanarak saçınıza biyoalgılayıcı izole: ekli kompleksleri kolayca içine 5 µL negatif leke EM tarafından görselleştirme ve MS. tarafından kimlik için için tıklayınız DTT içeren arabelleği serbest biyoalgılayıcı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek.

Şekil 6. Protein kompleksleri EM ile görselleştirme: Pre-endosomal örnek ızgaralar, yoğunlukları Eğer_N-PA_preporeoluşan sağlam Üçlü kompleksleri ile tutarlı göster-CMG2. Post-endosomal karmaşık ızgaralar, göstermek PA gözenek için geçiş ve hiçbir bariz CMG2 yoğunluğu ile micelle tarafından çözündürüldükten. Tahmin edilen kompleksler (sol tarafı) bireysel parçacıkların gösterilen aynı ölçekte modellerdir. Tahmin edilen protein (EM yoğunluğu boyutuna göre) ile renkli parçacıklar Her partikülün altında gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7. Protein kompleksleri doğrulanması ile Bayan: Pre-endosomal MS örnekleri bulunan peptidler %60,46, %67.97 ve 54.15 oranında sapma ile tüm üç toksin bileşenlerinden Eğer_N, PA ve CMG2, anılan sıraya göre. Peptidler bir oranda yanlış bulma (FDR) eşit veya sarı, FDR eşit veya daha yüksek yeşille gösterildiği % 1'den gösterilen % 5 daha yüksek tespit edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8. Protein kompleksleri doğrulanması ile Bayan: Post-endosomal örnekleri bulunan peptidler Eğer_N ve PA (%57.41 ve %67.79 kapsama, sırasıyla), değil CMG2 ama. FDR eşit veya %5 göstermek içinde sarı, FDR eşit veya daha yüksek yeşille gösterildiği % 1'den daha yüksek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adım	Zaman (s)	Açıklama
1	30	İlk satır taban çizgisi
2	420	Etkinleştirme
3	300	Etkinleştirme
4	300	EğerN yükleme
5	240	Sistein sertleştirme
6	120	Satır taban çizgisi
7	300	PAprepore Derneği
8	30	Satır taban çizgisi
9	300	CMG2 Derneği
10	30	Satır taban çizgisi
11	300	Asit geçiş
12	30	Satır taban çizgisi
13	300	Micelle Derneği

Tablo 1. Tek adım kez BLI çalıştırmak için derleme şarbon toksin karmaşık. Not temel önceki adımdaki ilişkisiz protein silsin ve/veya yeni bir arabellek taban çizgisi oluşturmak için kullanılır.

Tartışmalar

Bu gösteri gösterir nasıl makromoleküllerin karmaşık oluşumu kolayca biolayer Interferometry aracılığıyla izlenebilir, EM kullanarak görüntülenir ve tüm microvolumes kısa bir süre içinde ile MS ile doğrulandı. Yapısal derleme ve gözlenen kompleksleri daha fazla kombine Bu metodoloji doğrulama biyolojik ilgili tahminler izleyin. Sonuçları bölümünde belirtildiği gibi derleme başarı için anahtar öğesi karmaşık protein-protein arabirimleri uzak biyoalgılayıcı yüzeyi düzgün yönlendirilmiş olduğundan emin olmak için mantıklı bir şekilde tasarlanmış sistein mutagenesis gerektirir.

Önceki sistemleri protein bağlayıcı iki ve üç bileşen sistemlerinin yanı sıra reseptör bağlama ifade protein bütünlüğünü değerlendirmek için alma ve MS teknikleri kullanılmış ama her iki durumda yöntemleri tandem EM/MS yararlanmak için geliştirilen değil ^8,9yaklaşım. MS Analizi etkileşimleri karakterize yardımcı olmak için kombine sadece diğer Interferometry sistemi çift polarizasyon Interferometry¹⁰idi. Ne yazık ki, bu sistem artık genel kullanıma açık değil. Giriş bölümünde de belirtildiği gibi nerede örnekleri SPR benzeri biyoalgılayıcı yüzeylerde oluşan ve MS analizinden çıkarıldı tamamlanan çalışmalar bir dizi olmuştur. Bu örneklerin hiçbiri EM kullanarak görüntülenir kompleksleri içinde sonuçlandı.

Bu sıralı yöntemi sınırlamaları çok sayıda olabilir ancak çözülebilir. İlk immobilizasyon ve temel adım derleme için bu nedenle, bir yapısal etkileşim yüzeylerin bilgi eksikliği kesinlikle ilk Montaj aşamaları izleme ile ilgili ilerleme engel olur. Yapı bilgi eksikliği bir mühendislik tasarımı tarafından ele alınması Vakfı oluşturmak nerede ek kimyaları (Örneğin sulfhydryl yan disülfür bağları için / onun öğesini konumlandırma) çekirdek içinde çeşitli bölgelere taşındı derleme sistemi. Şarbon toksin karmaşık olması durumunda, Eğer_N PA_prepore için bağlı yapısını kullanılabilir¹¹yaşında şanslıydı. Akılcı mühendislik sistein yerleşimini PA_prepore bağlama yüz uzak bölgelere lokalize. Sistein bağlantı kimyaları ile hiçbir reaktif diğer katıldı protein yüzeyinde mevcut tercih edilir.

Belirli ek site protein yüzeylerde mühendisi için kullanılan çeşitli ek kimyaları vardır. Biri en popüler belirli eklerin protein yüzey¹²özel olarak tanımlanmış bir yerde bir biotin yan konumlandırma gerektirir. Ne yazık ki, biotin bağlama streptavidin veya avidin kaplı yüzeyler oldukça sıkı. Ters bağlama etkileşimin basit değil. Bir mühendislik O'nun-etiket, N veya C-terminus kullanımı ve Ni-NTA yüzeyler için ek sonraki kolaylığı benzeşme immobilizasyon daha evrensel bir uygulamadır. Tabii ki, O'nun öğesini sistemleri ile Mühendislik derleme ek siteler için uyarılar N - ve C-termini çekirdek derleme protein maruz ve eki kolaydır böylece ayrılmış kalır gereksinimi biridir. Kadar tüm derleme işlemleri ile etkileşim arabirimi çekirdek derleme protein karmaşık derleme ilerledikçe kullanılabilir kalmalıdır.

Belki de biyoalgılayıcı yüzey kimyaları kullanmanın en yaygın endişe non-spesifik bağlamadır. Streptavidin ipuçları kez önemli non-spesifik bağlama etkileri bir kaynaktır. Bağlantılı disülfür biotin immobilize streptavidin biyosensörler¹³için sıkı bir şekilde bağlı azaltılmış S-biotin bağlantı geride bırakarak çok özel konut projeleri serbest bırakmak için kullanılabilir. İminoboronates gibi ve daha az bir ölçüde ketoamide¹⁴oluyor diğer tersinir kimyaları vardır. Bu alan şu anda az gelişmiş ama daha sık kovalent hedeflenen ilaç geliştirme kullanımını eşlik hedef kapalı ilaç toksisitesi etkilerinden korunmak için ters çevrilebilir kovalent protokolleri gelişmekte olan yüksek faiz bulunur.

EM kompleksleri görselleştirmek için kullanmanın bir yorumu, özellikle birleştirilmiş komplekslerinin yapılarının başlangıçta bilinmiyor nerede durumlarda kısıtlamadır. Bileşenlerin tanımsız bir birleştirilmiş makromoleküllerin kompleksi içinde uzaysal konumları belirli kinetik ve yapısal imleyicileri monoklonal antikorlar (mAb) kullanılarak belirlenebilir. Bir kompleks oluşmuş belirledikten sonra Örneğin, monoklonal antikor belirli bileşenleri bağlamak eklenir. Bu yöntemi sık sık EM büyük grupları¹⁵içinde belirli bileşenlerini tanımlamak için kullanılır. Başka bir sınırlama karmaşık boyutuna ilgili, her ne kadar olmuştur nerede kullanılarak tanımlanmış simetrik derlemeler 70 kDa (GroES heptamer) gibi kolayca küçük çözümlendi örnekleri leke EM negatif. EM tarafından analiz monte kompleksleri genellikle boyut ~ 100 Å çapı veya yukarıda arasındadır. Son zamanlarda ancak, proteinler 20 kDa küçük çözümlenmiş ve düşük çözünürlüklü yapıları metodolojileri¹⁶boyama çift kullanırken elde edilmiştir.

MS analiz için geçerli MS araçları femtomolar (attomoles) düzeyine kadar artan duyarlılık bazı durumlarda BLI algılama hassasiyeti artırır. Bu genlikleri en az ama tekrarlanabilir artış gösteren protein sinyalleri söz konusu protein tanımlaması içinde sonuçlanır son derece akla yatkın. Buna ek olarak, bir biyoalgılayıcı ve diğer hücresel ortamında bağlı ortak ile protein-protein etkileşimleri sondalama etkin bir arınma ve yeni kurulan tesisin daha sonra daha kolay algılanması neden olur. Mevcut son derece hassas MS sistemleri ile gözlenen bir sınırlama olduğunu faiz protein veritabanında olmayabilir, ancak bu gözlem nadirdir (Örneğin, proteomes nadir türlerden). Dizileri ilgi proteinlerin biliniyorsa, kolayca (Bu çalışma protokolü bölümünde açıklandığı gibi) bir arka plan protein veritabanındaki protein(s) amino asit dizisine dahil ederek bu sorunu çözdü. Direniş trypsinolysis için metodoloji sonuçlarından bir proteinin başka bir potansiyel sınırlandırılmasıdır. Tripsin sindirim genellikle protein kimlik tabandan için varsayılan yöntemdir. Ancak, onlar Arg ve Lys artıkları eksikliği veya bu erişimi katlanmış yapı tarafından kısıtlı protein tripsin için dirençli olabilir. Bu sınırlamalar, sırasıyla, alternatif veya proteaz birleşimini kullanarak veya daha önce enzimatik sindirim bir açılım reaktif (üre veya guanidin 1.1.14 ve 1.2.6 belirtildiği şekilde HCl) dahil olmak üzere çözümlenir.

Bu metodoloji olası açılımlar izleyin ve hücresel derleme kompleksleri ham hücresel lysates üzerinden tanımlamak kullanıcı izin içerir. Konsantre hücresel özleri derleme bileşenleri için biolayer Interferometry yordamları kullanarak gerçekleştirmek kolay deneyerek döner. Tıkanma eğilimli ve hassas toplama için yaygın olarak kullanılan mikrosıvısal dayalı metodolojisi BLI yaklaşım doğrudan biolayer sensör ipuçları potansiyel olarak belirli kompleksleri doğrudan düzenlemek için ham özleri sokmak için kullanılabilir Bu konsantre saf örneklerinden. Monte sonra daha fazla belirlemek ve hatta microvolume MS yöntemiyle tespit edilmiştir hücresel özleri şüpheli bileşenlerinde quantitate BLI sistem takip olarak spesifik antikor probları kullanmak için tamamen uygun. Yine, burada anahtar belirli benzeşme probları olarak tanımlanan, düzgün odaklı temel proteinler kullanmaktır.

Geçiş işlemi kinetically ile BLI gözenek prepore görüntüleme olanağı potansiyel "Anti-toksin" küçük molekül inhibitörleri özellikle geç endosomal altında düşük pH (5.0) işlev protein geçişlerini teşhis etmek için son derece faydalı olacaktır koşullar. Bu indüklenen pH prepore geçiş gözenek sabitleyici (osmolytes) gliserol veya sukroz gibi katlanır huzurunda engellenir ve böylece_gözenek oluşumu PA önlemek belirli hedeflenen katlama stabilizatörleri geliştirmek için güçlü bir destek ödünç. Bu belirli bir yaklaşım önler ve ham toplama tabanlı deneyleri nerede pH protein yağış müşteri adayına damla yerini alır. Bu ikinci yöntem için birincil prescreening yöntemleri, iyi olmasına rağmen genellikle yanlış pozitif sonuçlar için nerede belirli bileşikler gerçek moleküler geçişler yerine toplama inhibe açar.

Aşağı akım gözlem yapısı ve küçük microvolume örnekleri içinde bireysel montajı bileşenleri tanımlaması da potansiyel kurşun bileşikleri doğrulanırken yararlı olabilir. Bu özel derleme sabitleme veya istikrarsızlık hedef sonucu olduğu durumlarda uygulanabilir. Bu kinetik/yapısı/kimlik paralel yaklaşım doğrudan şüpheli kurşun bileşik effectors derleme geçerliliği teyit için yararlı ve bir makul ikincil tarama adım veya orta üretilen iş yaklaşımı olarak hizmet vermektedir.

Cryo-EM makromolekül kompleksleri derleme çeşitli Birleşik Devletleri atomik ayrıntılarını incelemek için kullanışlı bir yöntemdir. Cryo-EM örnekleri hazırlamadan önce ilk negatif leke EM ile makul saf homojen kompleksleri bir hazırlık içeren doğrulamanız önemlidir. Burada sunulan iş protein kompleksleri BLI biyoalgılayıcı yüzeylerde Meclisi bu komplekslerin EM görselleştirme için sürümü ve MS kullanarak bu bileşenleri tanımlaması gösterir. Bu belirli metodoloji kontrollü montaj ve yayın homojen ardışık numune hazırlama negatif leke EM, için ilerleyen önce gösterilmelidir gerekli bir adım için geliştirmek çok özel iletişim kuralları oluşturmak için yararlı olabilir Cryo-EM. Düşük çözünürlükte 3D yapısı elde etmek için sadece 30-50 parçacıklar kompleks sağlanan yönlendirme çeşitlilik (birden çok farklı görünüm) konik tilt serisi (Parçacık başına 70 farklı 2B görüntü sayısı) gerçekleştirmek için gerekli olacaktır.

MS yöntemler geliştirilmesi ile ilgili gelişmeler duyarlılık ve numune hacmi azalma geliştirmeye devam. Nano akışları ve ultra yüksek basınç sıvı kromatografi kütle spektrometreleri hızlı bir görev ile geliştirilmesi ile birlikte döngüsü, duyarlılık arttı ve güç çözme. Orbitrap kütle spektrometre son giriş, özellikle son sürüm (orbitrap füzyon Lumos ve beklenen halefi Orbitrap füzyon Lumos 1M) gibi arama algoritmaları büyük ölçüde bu sürecini kolaylaştırmak.

Geçerli metodoloji kinetik montaj ve demontaj şarbon toksin bileşenlerin etiket içermeyen BLI yöntemlerini kullanarak izler ve yapısı ve EM ve MS, sırasıyla kullanarak bu bileşenleri kimliğini değerlendirir. Basit bir tek kanal BLI sistem kullanımı rutin EM analiz boyama negatif ile birleştiğinde ve temel MS teknikleri bir derleme işlemi tanımlamak yeterli daha fazla.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 mL black microtubes	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å	ThermoFisher Scientific	164561
Acetic acid glacial	Fisher	A38SL-212
Acetonitrile	Fisher	A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips	Forte Bio	18-5092
Ammonium bicarbonate	Fisher	A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Boric acid	Fisher Scientific	10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2			Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid	Electron Microscopy Sciences	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Formic acids	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals,LLC	100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain			Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system	Ted Pella, Inc	91000
Protective Antigen prepore			Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles	Fisher Scientific	09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sequest HT search engine	ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	BP334-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Sodium cholate	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Uranyl formate (UF)	Electron Microscopy Sciences	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487