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Resumen

Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.

Resumen

El Neocórtex mamífero se compone de muchos tipos de neuronas inhibitorias y excitatorias, cada uno con propiedades electrofisiológicas y bioquímicas específicas, conexiones sinápticas, y en vivo funciona, pero básicas funcionales y anatómicas Organización de celular a escala de red es mal entendida. Aquí se describe un método para la proyección de imagen tridimensional de marcada con fluorescencia de neuronas a través de grandes áreas del cerebro para la investigación de la organización celular cortical. Tipos específicos de neuronas están marcados por la inyección de trazadores neuronales retrógrados fluorescentes o la expresión de proteínas fluorescentes en ratones transgénicos. Muestras de cerebro de bloque, por ejemplo, un hemisferio, son preparadas después de la fijación, hechas transparentes con tejido claro métodos y sometidas a inmunomarcación fluorescente de los tipos celulares específicos. Grandes áreas se analizan utilizando microscopios confocales o dos fotones equipados con objetivos de distancia de trabajo grande y etapas motorizadas. Este método puede resolver la organización periódica de los módulos funcionales de la microcolumna tipo-específicas de la célula en el neocortex de ratón. El procedimiento puede ser útil para el estudio de arquitectura celular tridimensional en las áreas diversas del cerebro y otros tejidos complejos.

Introducción

El Neocórtex mamífero se compone de un gran número de tipos celulares, cada uno con los patrones de expresión de genes específicos, propiedades electrofisiológicas y bioquímicas, conexiones sinápticas, y en vivo funciona1,2 ,3,4,5,6,7. Si estos tipos de células están organizados en estructuras repetidas ha sido claro. Columnas corticales, incluyendo columnas de orientación visual y somatosensoriales barriles, han repetido las estructuras, pero su organización celular permanece confuso8,9. Estos están presentes en las áreas corticales específicas y no son un sistema de todo el cerebro.

En la capa neocortical 5, la gran mayoría de las neuronas se clasifica en cuatro tipos principales. Un tipo importante de neuronas excitatorias, las neuronas de proyección el cerebral, proyecta axones a blancos subcorticales incluyendo el puente de Varolio, médula espinal y colículo superior y, por lo tanto, representa la principal salida cortical vía10. Las neuronas de proyección cortical, otro tipo importante de neuronas excitatorias, inervan la corteza10. Neuronas inhibitorias también contienen dos clases principales: las células expresan parvalbúmina y expresión de somatostatina11.

Análisis recientes indican que los tipos de cuatro células se organizan en estructuras repetidas12,13,14. Las neuronas de proyección sub-cerebral12,13,14 y proyección cortical neuronas14 organizan en microcolumns específicas tipo de celular con un diámetro de 1 – 2 células. Las células expresan parvalbúmina y expresión de somatostatina alinean específicamente con microcolumns de neuronas de proyección el cerebral pero no con microcolumns de proyección cortical neuronas14. Microcolumns se alinee periódicamente para formar un hexagonal enrejado matriz14 y están presentes en múltiples áreas corticales incluyendo áreas visuales, somatosensoriales y motor de12,de cerebro de ratón14 y el lenguaje áreas del cerebro humano13. Las neuronas en la microcolumna individual exhiben actividad sincronizada y tienen respuestas sensoriales similares14. Estas observaciones indican que tipos de células de la capa 5 se organizan en una estructura de enrejado microcolumna que representa la primera organización conocida de todo el cerebro de repetición de módulos funcionales.

Microcolumns tienen un radio de aproximadamente 10 μm y tienen una periodicidad espacial de aproximadamente 40 μm. Además, la orientación de microcolumns es paralela a sus dendritas apicales y cambia dependiendo de su posición en la corteza14. Por lo tanto, el sistema de la microcolumna es difícil analizar el láminas corticales convencionales con un espesor típico de unas decenas de micrómetros. Además, el análisis de la periodicidad requiere datos tridimensionales de una amplia gama de áreas del cerebro y, por tanto, la zona típica imagen de microscopía confocal o en vivo 2-fotón proyección de imagen es demasiado estrecho.

Recientemente, se han desarrollado técnicas para limpiar tejidos gruesos de15,16. Aquí se describe la aplicación de estos métodos para obtener imágenes tridimensionales, a gran escala los principales tipos de células en capa neocortical ratón 5 que integran el sistema de la microcolumna. Las neuronas de proyección subcerebral están marcadas por el etiquetado retrógrada o por la expresión de la proteína fluorescente verde mejorada en Crym-egfp ratones transgénicos12y proyección cortical neuronas están marcadas por la retrógrada etiquetado o por la expresión tdTomato en Tlx3-cre/Ai9 ratones17. Las células expresan parvalbúmina y expresión de somatostatina están marcadas por immunohistochemistry. El método (escala de anticuerpo S) AbScale del18 se utiliza para el anticuerpo tinción experimentos, mientras que el método de SeeDB (ver cerebral profunda)19 se utiliza para otros experimentos. Estos métodos de superar las dificultades antes mencionadas de los métodos por imágenes convencionales y revelan la exacta organización celular de la capa 514.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el RIKEN Wako Animal experimentos Comité y Comité de seguridad de RIKEN genética recombinante experimento y realizados según los lineamientos institucionales de las instalaciones de la ciencia del cerebro RIKEN Instituto.

1. preparación de imágenes de cámaras

  1. Proyección de imagen de cámara19
    1. Hojas de goma de silicona, preparar una cámara con un espesor de aproximadamente 5 mm y piso placas de diferentes espesores. Además, preparan platos de Petri con y sin un fondo de cristal (figura 1A).
  2. Espaciador de la rebanada
    1. Preparar los espaciadores para muestras, uso de láminas de caucho de silicona con un espesor de 0,5 mm (figura 1).

2. trazador inyección

Nota: Hacer las inyecciones en el colículo superior (2.2) o puente de Varolio (2.1). Inyección en las neuronas de proyección secundario-cerebral etiqueta de pons en una región del cerebro amplia incluyendo las áreas visuales y motoras, mientras que la inyección en las neuronas de proyección cerebral el colículo superior etiquetas en el área visual. Para los experimentos de control, inyectar solución salina en lugar de subunidad de la toxina de cólera marcada con fluorescencia B. Para el mantenimiento de condiciones de esterilidad utilizar equipo esterilizado y guantes de plástico limpiadas con etanol.

  1. Realizar las inyecciones en el puente de Varolio de ratones adultos.
    1. Dibujar 1 μl de subunidad de la toxina de cólera marcada con fluorescencia B (25 μg/μl de PBS) en una jeringa Hamilton G 26.
    2. Colocar una bomba inyector de la jeringa.
    3. Coloque la jeringa y la bomba en el soporte de herramienta de un manipulador a un instrumento estereotáxicas. Incline el manipulador 12° posteriorly en el eje vertical.
    4. Anestesiar un ratón adulto hombre o mujer (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9) mediante la inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (60 mg/kg de peso corporal) o mediante la administración de isoflurano (2 – 3%). Espere hasta que el ratón no hace ninguna respuesta cuando la cola se quede enganchada con pinzas, lo que indica que el ratón está totalmente anestesiado.
    5. Coloque el ratón sobre el instrumento estereotáxicas.
    6. Retire con cuidado el pelo usando una cuchilla de afeitar para prevenir infección y corte 10 mm del cuero cabelludo para que el bregma y lambda son visibles. Administrar 0,1 mL de lidocaína 1% con ayuda de una pipeta. Ajuste el ángulo de la cabeza mediante el ajuste de la posición vertical de la boquilla del instrumento estereotáctica para que el bregma y lambda tienen el mismo nivel de z.
    7. Ajustar la posición del manipulador deslizando el instrumento estereotáctica para que la punta de la jeringa está cerca de la bregma y registrar la posición del manipulador. Retire la jeringa moviendo el portaherramientas en el manipulador.
    8. Mover el manipulador 5,4 mm posteriorly y 0,4 mm lateralmente. Avanzar la jeringa para que la punta está cerca del punto de entrada en el cráneo. Retraiga la jeringa y marcar el punto de entrada.
    9. En la posición marcada, perfore un orificio de aproximadamente 1 mm de diámetro.
    10. Inserte la punta de la jeringa por el orificio para que la profundidad de la punta es 6,9 mm más medido en el bregma.
    11. Inyectar 1 μl de marcadores utilizando la bomba a 0,2 μl/min.
    12. Retire la jeringa del cerebro.
    13. Si es necesario, cubrir el cerebro expuesto con pequeños fragmentos de microfibrillar pinza y pegamento instantáneo.
    14. Enjuague el cerebro expuesto con solución salina con una pipeta para prevenir infecciones y se sutura el cuero cabelludo.
    15. Quitar el mouse del instrumento estereotáxicas. Permitir que el ratón para recuperar de la anestesia en una incubadora a 30 ° c, típicamente de 1 h. No descuide el ratón hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Volver el ratón a la compañía de otros animales después de que ha recuperado completamente.
    16. Mantenga el ratón para 3 a 7 días.
  2. Realizar las inyecciones en el colículo superior de ratones adultos.
    1. Preparar una pipeta de vidrio con un diámetro de punta de 30-50 μm.
    2. Conectar la pipeta de cristal con una jeringa Hamilton a través de un tubo de plástico (figura 2A).
    3. Llenar la pipeta de vidrio, tubo de plástico y Hamilton jeringa con el líquido de la parafina.
    4. Colocar una bomba inyector de la jeringa.
    5. Coloque la pipeta de vidrio en el manipulador e incline el manipulador 60° posteriorly en el eje vertical (figura 2B).
    6. Realizar 2.1.4–2.1.9. La posición del manipulador es posterior, 1.4 mm 0,5 mm lateral a la lambda.
    7. Colocar una película de parafina plástico pequeño en el cráneo, luego poner aproximadamente 1 μl de la solución del trazador en él. Rápidamente avanzar la pipeta de vidrio y llenarlo con por lo menos 0,5 μl de la solución del trazador.
    8. Insertar la pipeta de cristal para que la profundidad de la punta es de 3,0 mm de la superficie del cerebro.
    9. Inyectar 0,5 μl de marcadores utilizando la bomba a 0,2 μl/min.
    10. Retire la pipeta de cristal del cerebro.
    11. Realizar 2.1.13–2.1.16.

3. fijación y ajuste

  1. Inyecte pentobarbital sódico (60 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal en ratón (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9, con o sin la inyección del trazador como se describe en el paso 2. Espere hasta que el ratón no hace ninguna respuesta cuando la cola se quede enganchada con pinzas, lo que indica que el ratón está totalmente anestesiado.
  2. Eutanasia el ratón humanamente por perfundiendo el ratón transcardially20 con solución salina al 0.9%.
  3. Fijar el ratón20 perfundiendo 4% paraformaldehido (PFA) en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7.5).
  4. Cortar el cuero cabelludo utilizando un par de tijeras para exponer el cráneo descrito20.
    1. Corte de la línea media del cráneo expuesto mediante un par de tijeras. Quitar el cráneo con unas pinzas.
    2. Si es necesario marcar la posición de bregma y lambda, primero retire un hemisferio del cráneo. Insertar agujas finas de tungsteno en el cerebro en las posiciones de la bregma y lambda en el cráneo en el cerebro y luego retire el resto del cráneo.
      Nota: El cerebro puede almacenarse en PBS a 4 ° c.
  5. Para realizar la tinción de anticuerpos de neuronas inhibidoras, cortar las muestras de cerebro.
    1. Coloque la muestra de cerebro en un vibratome.
    2. Cortar láminas hasta 500 μm de espesor en PBS a temperatura ambiente y proceder al paso 5 (el método AbScale).
  6. Si anticuerpos es necesario, ajuste la muestra de cerebro bloquea (hasta 3 mm de espesor) utilizando una hoja de afeitar (figura 3) y vaya al paso 4 (método SeeDB).
    Nota: El cerebro puede almacenarse en PBS a 4 ° C después de corte o recorte. El método SeeDB es preferible cuando los anticuerpos no es necesario porque requiere menos tiempo que el método de elAbSca.

4. claro sin anticuerpo tinción (el SeeDB)

  1. Transferir la muestra con una espátula a un tubo de plástico de 50 mL que contenga 20 mL de α-thioglycerol 0,5% y 20% (p/v) fructosa e incubar durante 4 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  2. Transferir la muestra con una espátula a un tubo de plástico de 50 mL que contenga 20 mL de 0.5% α-thioglycerol y fructosa 40% (w/v) e incubar durante 4 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  3. Transferir la muestra con una espátula a un tubo de plástico de 50 mL que contenga 20 mL de α-thioglycerol 0,5% y 60% (w/v) fructosa e incubar durante 4 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  4. Transferir la muestra con una espátula a un tubo de plástico de 50 mL que contenga 20 mL de α-thioglycerol 0,5% y 80% (w/v) fructosa e incubar durante 12 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  5. Transferir la muestra con una espátula a un tubo de plástico de 50 mL que contenga 20 mL de 0.5% α-thioglycerol y fructosa 100% (w/v) e incubar durante 12 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  6. Transferir la muestra con una espátula a un tubo de plástico de 50 mL que contenga 20 mL de α-thioglycerol 0,5% y 80.2% (w/w) fructosa e incubar durante 24 h con agitación suave a temperatura ambiente.
    Nota: Manipule la muestra cuidadosamente para mantener las deformaciones tan pequeño como sea posible. No incubar muestras más de lo indicado, como muestras pueden convertirse rápidamente en opacas.
  7. Embeber la muestra en una cámara de proyección de imagen con la solución de fructosa de 80.2% (figura 1B). Si es necesario, fijar la muestra poniendo pequeños trozos de adhesivo caucho. Si la cámara es demasiado profunda, poner una placa de piso de la cámara antes de colocar las muestras.
  8. Coloque el plato Petri con una cubierta de cristal de la sala de proyección de imagen y poner agua en el plato y la imagen mediante microscopía confocal o dos fotones con una inmersión en agua durante mucho tiempo de trabajo objetivo de distancia. Longitudes de onda de excitación y emisión filtros se describen en la tabla 1. Si es necesario, use una etapa motorizada.

5. despejando con el anticuerpo de tinción (el AbScale)

  1. Preparar los reactivos como se describe en la tabla 2.
  2. Transferir las rebanadas con una espátula a un tubo de plástico de 5 mL que contiene 4 mL de solución de Sca/eS0 e incúbelos durante 12 horas con agitación suave a 37 ° C (Figura 4B).
  3. Quitar la solución del tubo con una pipeta, añadir 4 mL de solución de Sca/eA2 e incubar las rebanadas por 36 h con agitación suave a 37 ° C.
  4. Retirar la solución del tubo con una pipeta y añadir 4 mL de solución de Sca/eB4 e incubar las rebanadas durante 24 h con agitación suave a 37 ° C.
  5. Quitar la solución del tubo con una pipeta, añadir 4 mL de solución de Sca/eA2 e incubar las rebanadas por 12 h con agitación suave a 37 ° C.
  6. Retirar la solución del tubo con una pipeta y añadir 4 mL de PBS e incubar las rebanadas durante 6 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  7. Retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de 2 mL con una espátula.
  8. Incubar con anticuerpos primarios (tabla 3) en 1 mL de AbScale solución de 48-72 h a 37 ° C (figura 4) con agitación suave.
  9. Retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de 5 mL con una espátula.
  10. Incubar en 4 mL de solución de AbScale h 2 2 veces a temperatura ambiente con agitación suave.
  11. Retire con cuidado las rodajas a un tubo de plástico de 2 mL con una espátula.
  12. Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (Tabla de materiales, 1: 100) en 1 mL de solución de AbScale durante 48 h a 37 ° C con agitación suave.
  13. Cuidadosamente retire las rebanadas con una espátula a un tubo de plástico de 5 mL que contiene 4 mL de la solución AbScale e incubar las rebanadas durante 6 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  14. Retirar la solución del tubo con una pipeta y añadir 4 mL de la solución AbScale incubar las rebanadas durante 2 h. 2 veces con agitación suave a temperatura ambiente.
  15. Retirar la solución del tubo con una pipeta y añadir 4 mL de 4% PFA e incubar las rebanadas durante 1 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  16. Retirar la solución del tubo con una pipeta y añadir 4 mL de PBS e incubar las rebanadas durante 1 h con agitación suave a temperatura ambiente.
  17. Quitar la solución del tubo con una pipeta y añadir 4 mL de la solución de Sca/eS4 e incubar las rebanadas por 12 h con agitación suave a 37 ° C.
  18. Coloque al espaciador en un portaobjetos de vidrio y coloque las rebanadas en el espaciador y sumerja las rebanadas con la solución de Sca/eS4. Sello a separador con una cubierta de vidrio (figura 1).
  19. Poner agua en la cubierta de vidrio y la imagen mediante microscopía confocal o dos fotones con una inmersión en agua durante mucho tiempo de trabajo objetivo de distancia. Si es necesario, use una etapa motorizada.
    Nota: Compruebe si las partes profundas de la muestra están marcadas de manera similar a las partes superficiales para confirmar la ausencia de un importante sesgo etiquetado.
    Nota: Penetración de los anticuerpos prueba se describe en la tabla 3.

6. determinación de la posición de la célula

  1. Para cada posición en las imágenes escaneadas, calcular los valores de correlación mediante una imagen tridimensional filtro14 (figura 5A-5D).
  2. Determinar las posiciones de los picos del valor de correlación (figura 5).
  3. Investigar imágenes alrededor de los picos para localizar las células (figura 5E).

Resultados

Etiquetado como las neuronas de proyección cortical por la expresión de tdTomato en Tlx3-creratones transgénicos /Ai9 y visualizar las neuronas de proyección el cerebral mediante la inyección del trazador retrógrado CTB488 en el puente de Varolio. El hemisferio izquierdo del cerebro fue sometido al método SeeDB y analizados utilizando un microscopio de dos fotones, equipado con una inmersión en agua durante mucho tiempo de trabajo objetivo de distancia (25 X, N.A...

Discusión

Hemos presentado los procedimientos para obtener imágenes tridimensionales a gran escala de la organización de tipo específico de célula los principales tipos de células en capa neocortical ratón 5. En comparación con la tinción de corte convencional, el método es más útil en la determinación de la organización tridimensional del neocórtex. El método permite la adquisición de la imagen de la más amplia y las regiones más profundas del cerebro en comparación con el típico en vivo 2-fotón micr...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Atsushi Miyawaki y Hiroshi Hama para su asesoramiento en los experimentos de elAbSca, Charles Yokoyama para la edición del manuscrito, Eriko Ohshima y Miyuki Kishino su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación de RIKEN T.H. y subvenciones para la investigación científica desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT) de Japón a T.H. (áreas innovadoras "Mesoscópica Neurocircuitry"; 22115004) y S.S. (25890023).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Crym-egfp transgenic miceMMRRC012003-UCD
Tlx3-cre transgenic miceMMRRC36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato miceJackson LaboratoryJAX #7909
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-010.5 mm thickness
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-021.0 mm thickness
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-053.0 mm thickness
Petri dishesFalcon351008
Cover glassMatsunamiC022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugateInvitrogenC22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugateInvitrogenC22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugateInvitrogenC22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugateInvitrogenC34778
26 G Hamilton syringeHamilton701N
Injector pumpKD ScientificKDS 310Pons injection
Injector pumpKD ScientificKDS 100Superior colliculus injection
ManipulatorNarishigeSM-15
Sodium pentobarbitalKyoritsu SeiyakuSomnopentyl
IsofluranePfizer
LidocaineAstraZenecaXylocaine injection 1% with epinephrine
DrillToyo AssociatesHP-200
Avitene microfibrillar hemostatDavol Inc1010090
AlonalfaDaiichi-SankyoAlonalpha A
Surgical silkEthiconK881H
IncubatorUVPHB-1000 Hybridizer
Glass pipetteDrummond Scientific Company2-000-075
Electrode pullerSutter Instrument CompanyP-97
Paraffin Liquid, lightNacalai tesque26132-35
SalineOtsuka1326
ParaformaldehydeNacalai tesque26126-54
Tungsten needleInter medicalΦ0.1 *L200 mm
VibratomeLeicaVT1000S
50 mL plastic tubeFalcon352070
α-thioglycerolNacalai tesque33709-62
D(-) FructoseNacalai tesque16315-55
BluTackBostikCKBT-450000
Two-photon microscopeNikonA1RMP
Water-immersion long working distance objectivesNikonCFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectivesNikonCFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stageCOMSPT100C-50XY
FilterSemrockFF01-492/SP-25
FilterSemrockFF03-525/50-25
FilterSemrockFF03-575/25-25
FilterSemrockFF01-629/56
FilterChromaD605/55m
5 mL plastic tubeAS ONEVIO-5B
2 mL plastic tubeEppendorf 0030120094
UreaNacalai tesque35905-35
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
GlyserolSigma-aldrich191612
D(-)-sorbitolWako191-14735
Methyl-β-cyclodextrinTokyo chemical industryM1356
γ-CyclodextrinWako037-10643
N-acetyl-L-hydroxyprolineSkin Essential Actives33996-33-7
DMSONacalai tesque13445-45
Bovine Serum AlbuminSigma-aldrichA7906
Tween-20 (1.1 g/mL)Nacalai tesque35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206
Confocal microscopeOlympusFV1000
Water-immersion long working distance objectivesOlympusXLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuNMilliporeMAB377
Anti-NeuNMilliporeABN78
Anti-CTIP2Abcamab18465
Anti-Statb2Abcamab51502
Anti-GAD67MilliporeMAB5406
Anti-GABASigmaA2052
Anti-ParvalbuminSwant235
Anti-ParvalbuminFrontier InstitutePV-Go-Af460
Anti-ParvalbuminSigmaP3088
Anti-ParvalbuminAbcamab11427
Anti-SomatostatinPeninsula LaboratoriesT-4103
Anti-c-FosCalbioChemPC38

Referencias

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