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Resumo

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Resumo

O neocórtex dos mamíferos é composto de muitos tipos de neurônios excitatórios e inibitórios, cada um com propriedades específicas eletrofisiológicas e bioquímicas, conexões sinápticas, e na vivo de funções, mas sua basic funcional e anatômica organização de celular para escala de rede é mal compreendida. Aqui nós descrevemos um método para a imagem tridimensional de neurônios fluorescente-etiquetadas em grandes áreas do cérebro para a investigação da organização celular cortical. Tipos específicos de neurônios são rotulados por injeção de traçadores neuronais retrógrados fluorescentes ou expressão de proteínas fluorescentes em ratos transgénicos. Amostras de cérebro de bloco, por exemplo, um hemisfério, são preparadas após a fixação, transparentes com tecido métodos de compensação e submetidas a fluorescente immunolabeling os tipos de células específicas. Grandes áreas são verificadas usando microscópios confocal ou dois fotões equipados com grandes objectivos de distância de trabalho e estágios motorizados. Esse método pode resolver a organização periódica dos módulos funcionais específicas do tipo microcolumn célula no neocórtex do mouse. O procedimento pode ser útil para o estudo da arquitetura celular tridimensional nas áreas diversas do cérebro e outros tecidos complexos.

Introdução

O neocórtex dos mamíferos é composto por um grande número de tipos de células, cada uma com os padrões de expressão de genes específicos, propriedades bioquímicas e eletrofisiológicas, conexões sinápticas, e na vivo funções1,2 ,3,4,5,6,7. Se estes tipos de células são organizados em estruturas repetidas tem sido pouco claras. Colunas corticais, incluindo colunas de orientação visual e somatossensorial barris, repetiram-se estruturas, mas sua organização celular permanece incerto8,9. Estas estão presentes nas áreas corticais específicas e não são um sistema de todo o cérebro.

Na camada neocortical 5, a grande maioria dos neurônios é classificada em quatro tipos principais. Um tipo importante de neurônios excitatórios, neurônios de projeção sub cerebral, projeta axônios para alvos subcorticais, incluindo o pons, medula espinhal e colículo superior e, portanto, representa a principal saída cortical via10. Neurônios de projeção cortical, um outro tipo importante de neurônios excitatórios, inervam o córtex10. Os neurônios inibitórios também contém duas classes principais: células parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando11.

Análises recentes indicam que os tipos de quatro célula são organizados em estruturas repetidas12,13,14. Tanto os neurônios de projeção cerebral secundário a12,13,14 e de neurônios de projeção cortical14 organizam em célula-tipo específico microcolumns com um diâmetro de 1 – 2 células. Células Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando alinham especificamente com microcolumns de neurônios de projeção sub cerebral, mas não com microcolumns de neurônios de projeção cortical14. Microcolumns se alinhar periodicamente para formar um hexagonal lattice de matriz14 e estão presentes em múltiplas áreas corticais incluindo áreas visuais, somatossensorial e motor em cérebro de rato,12,14 e na língua áreas do cérebro humano13. Neurônios no microcolumn individual apresentam atividade sincronizada e ter respostas sensoriais semelhantes14. Estas observações indicam que tipos de células da camada 5 organizam em uma estrutura de treliça de microcolumn que representa a primeira organização de todo o cérebro conhecida de repetir módulos funcionais.

Microcolumns ter um raio de aproximadamente 10 µm e têm uma periodicidade espacial de aproximadamente 40 µm. Além disso, a orientação do microcolumns é paralela às suas dendrites apicais e alterações dependendo de sua posição no córtex14. Portanto, o sistema microcolumn é difícil de analisar usando fatias corticais convencionais com uma espessura típica de algumas dezenas de micrômetros. Além disso, a análise de periodicidade requer dados tridimensionais de uma vasta gama de áreas do cérebro e, portanto, a área de imagem típica de microscopia confocal ou na vivo imagem 2-fóton é muito estreita.

Recentemente, técnicas têm sido desenvolvidas para limpar tecidos grossos15,16. Aqui descrevemos a aplicação desses métodos para obter imagens tridimensionais, em grande escala os tipos de células principais na camada neocortical do rato 5 que compõem o sistema de microcolumn. Neurônios de projeção subcerebral são rotulados pela rotulagem retrógrada ou a expressão da proteína fluorescente verde reforçada em Crym-egfp ratos transgénicos12e projeção cortical neurônios são rotulados por ambos o retrógrado rotulagem ou pela expressão tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos17. Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando células são rotuladas por imuno-histoquímica. O método de (anticorpo escala S) AbScale18 é usado para o anticorpo que mancha experimentos, enquanto o método de SeeDB (ver profunda do cérebro)19 é usado para outras experiências. Esses métodos de superassem as dificuldades acima referidas dos métodos convencionais de imagem e revelam a organização celular exata da camada 514.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de segurança do RIKEN genética recombinante experimento e RIKEN Wako Animal experimentos Comité e executados de acordo com as orientações institucionais das instalações da RIKEN cérebro ciência animais Instituto.

1. preparação de câmaras de imagem

  1. Câmara de imagem19
    1. Folhas de borracha de silicone, prepare uma câmara com uma espessura de aproximadamente 5 mm e piso chapas de várias espessuras. Além disso, prepare caixas de Petri com e sem um fundo de vidro (figura 1A).
  2. Espaçador de fatia
    1. Prepare os espaçadores para manter as amostras, usando folhas de borracha de silicone com uma espessura de 0.5 mm (Figura 1).

2. tracer injeção

Nota: Fazer injeções no pons (2.1) ou no colículo superior (2.2). Injeção para os neurônios de projeção sub cerebral do rótulo de pons em uma região de cérebro grande, incluindo as áreas visuais e motoras, enquanto a injeção para os neurônios de projeção sub cerebral de rótulos colículo superior na área de visual. Para controle de experimentos, injetar soro, em vez de subunidade de toxina da cólera fluorescente-etiquetadas B. Para a manutenção da condição estéril use equipamento esterilizado e luvas de plástico limpadas com álcool etílico.

  1. Fazer injecções na ponte de ratos adultos.
    1. Desenhar 1 µ l de subunidade de toxina da cólera fluorescente-etiquetadas B (25 µ g / µ l de PBS) uma seringa Hamilton G 26.
    2. Coloque uma bomba injetora na seringa.
    3. Coloque a seringa e a bomba no suporte de um manipulador colocado num instrumento estereotáxica. Incline o manipulador 12° posteriormente de eixo vertical.
    4. Anestesiar um rato adulto masculino ou feminino (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9) através da injeção de sódio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg de peso corporal) ou através da administração de isoflurano (2-3%). Espere até que o rato faz sem resposta quando a cauda é comprimida com fórceps, indicando que o mouse é totalmente anestesiado.
    5. Coloque o mouse sobre o instrumento estereotáxica.
    6. Remova cuidadosamente o cabelo usando uma lâmina de barbear para prevenir a infecção e cortar 10mm do couro cabeludo, para que o bregma e o lambda são visíveis. Administre 0,1 mL de lidocaína a 1% usando uma pipeta. Defina o ângulo da cabeça, ajustando a posição vertical do bocal do instrumento estereotáxica para que o bregma e o lambda têm o mesmo nível de z.
    7. Ajuste a posição do manipulator deslizando-o no instrumento estereotáxica para que a ponta da seringa é perto o bregma e gravar a posição do manipulator. Retire a seringa movendo o suporte da ferramenta sobre o manipulador.
    8. Mover o manipulador 5,4 mm posterior e 0,4 mm lateralmente. Avança a seringa para que a ponta está perto de ponto de entrada no crânio. Retire a seringa e marcar o ponto de entrada.
    9. Posição do marcado, faça um furo com um diâmetro de aproximadamente 1 mm.
    10. Inserir a ponta da seringa no orifício para que a profundidade de ponta é 6,9 mm mais do que a que medida no bregma.
    11. Injete 1 µ l dos marcadores usando a bomba em 0,2 µ l/min.
    12. Retire a seringa do cérebro.
    13. Se necessário, cubra o cérebro exposto com pequenos fragmentos de pinça hemostática microfibrilar e adesivo instantâneo.
    14. Lave o cérebro exposto utilizando soro fisiológico entregado com uma pipeta para prevenir a infecção e suturar o couro cabeludo.
    15. Remova o mouse do instrumento estereotáxica. Permitir que o mouse para recuperar da anestesia em uma incubadora a 30 ˚ c, normalmente por 1h. Não deixe o mouse sem vigilância até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Retorne o mouse para a companhia de outros animais depois que ele se recuperou totalmente.
    16. Manter o mouse por 3 a 7 dias.
  2. Fazer injeções para o colículo superior de ratos adultos.
    1. Prepare uma pipeta de vidro com um diâmetro de ponta de 30 – 50 µm.
    2. Conectar-se a pipeta de vidro para uma seringa Hamilton através de um tubo de plástico (Figura 2A).
    3. Encha a pipeta de vidro, tubo de plástico e Hamilton seringa com o líquido de parafina.
    4. Coloque uma bomba injetora na seringa.
    5. Coloque a pipeta de vidro sobre o manipulador e incline o manipulador 60° posteriormente de eixo vertical (Figura 2B).
    6. Execute 2.1.4–2.1.9. A posição do manipulator é 1,4 mm posterior, lateral de 0,5 mm para o lambda.
    7. Coloque uma película de parafina de plástico pequena no crânio e, em seguida, coloque aproximadamente 1 µ l da solução de rastreamento nele. Rapidamente avançar a pipeta de vidro e encha-o com pelo menos 0,5 µ l da solução de rastreamento.
    8. Introduza a pipeta de vidro para que a profundidade da ponta é de 3,0 mm da superfície do cérebro.
    9. Injete 0,5 µ l dos marcadores usando a bomba em 0,2 µ l/min.
    10. Retire a pipeta de vidro do cérebro.
    11. Execute 2.1.13–2.1.16.

3. fixação e remoção

  1. Injectar intraperitonealmente pentobarbital de sódio (60 mg/kg de peso corporal) por um mouse (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9, com ou sem a injeção do traçador conforme descrito na etapa 2. Espere até que o rato faz sem resposta quando a cauda é comprimida com fórceps, indicando que o mouse é totalmente anestesiado.
  2. Eutanásia o mouse humanamente pelo perfusing o rato transcardially20 com soro fisiológico a 0,9%.
  3. Corrigir o rato20 por perfusing paraformaldeído 4% (PFA) em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,5).
  4. Corte o couro cabeludo usando um par de tesouras para expor o crânio como descrito20.
    1. Corte a linha média do crânio exposta usando um par de tesouras. Remova o crânio usando fórceps.
    2. Se marcar a posição do bregma e o lambda é necessário, primeiro remova um hemisfério do crânio. Inserir agulhas de tungstênio fina do cérebro nas posições do bregma e o lambda no crânio que permaneçam no cérebro e, em seguida, remover o restante do crânio.
      Nota: O cérebro pode ser armazenado em PBS em 4 ˚ c.
  5. Para executar a mancha do anticorpo de neurônios inibitórios, corte as amostras de cérebro em fatias.
    1. Coloque a amostra do cérebro em um vibratome.
    2. Corte as fatias até 500 µm de espessura em PBS na temperatura ambiente e vá para a etapa 5 (AbScale método).
  6. Se a mancha do anticorpo é desnecessário, aparar a amostra do cérebro para bloqueia (até 3 mm de espessura) usando uma lâmina de barbear (Figura 3) e avance para o passo 4 (o método de SeeDB).
    Nota: O cérebro pode ser armazenado em PBS a 4 ° C após cortar ou aparar. O método SeeDB é preferível ao anticorpo coloração não é necessário, porque ele requer menos tempo do que o método de elAbSca.

4. limpar sem anticorpo que mancha (o método de SeeDB)

  1. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  2. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  3. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  4. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 80% (p/v) de frutose e incube-lo por 12 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  5. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) de frutose e incube-lo por 12 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  6. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 80,2% (w/w) frutose e incube-lo por 24 h com agitação suave na temperatura de quarto.
    Nota: Manipular a amostra cuidadosamente para manter deformações tão pequena quanto possível. Não Incube as amostras mais tempo do que o indicado, como amostras podem rapidamente se tornar opacas.
  7. Incorpore a amostra em uma câmara de imagem preenchida com solução de frutose a 80,2% (figura 1B). Se necessário, corrigi a amostra, colocando pequenos pedaços de adesivo de borracha ao redor. Se a câmara for muito profunda, coloquei uma placa de piso na câmara antes de colocar as amostras.
  8. Coloque a placa de Petri com uma tampa de vidro sobre a câmara de imagem e colocar água no prato e imagem utilizando microscopia confocal ou dois fotões com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância. Comprimentos de onda de excitação e filtros de emissão são descritos na tabela 1. Se necessário, utilize um palco motorizado.

5. compensação com anticorpo que mancha (o AbScale método)

  1. Prepare reagentes, conforme descrito na tabela 2.
  2. Transfira as fatias com uma espátula para um tubo de plástico de 5 mL contendo 4 mL de solução de Sca/eS0 e incube-os por 12 h com agitação suave a 37 ° C (Figura 4B).
  3. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eA2 e incubar as fatias para 36 h com agitação suave a 37 ° C.
  4. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eB4 e incubar as fatias para 24 h com agitação suave a 37 ° C.
  5. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eA2 e incubar as fatias para 12 h com agitação suave a 37 ° C.
  6. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de PBS e incubar as fatias para 6 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  7. Retire cuidadosamente as fatias para um tubo plástico de 2 mL, usando uma espátula.
  8. Incube com anticorpos primários (tabela 3) em 1 mL de solução de AbScale para 48-72 h a 37 ° C (Figura 4), com agitação suave.
  9. Retire cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de 5 mL com uma espátula.
  10. Incube em 4 mL de solução de AbScale para 2 h à temperatura ambiente com agitação suave em 2 vezes.
  11. Retire cuidadosamente as fatias para um tubo plástico de 2 mL, usando uma espátula.
  12. Incube com fluorescente etiquetado anticorpos secundários (Tabela de materiais, 1: 100) em 1 mL de solução de AbScale por 48 h a 37 ° C, com agitação suave.
  13. Retire as fatias com uma espátula para um tubo de plástico de 5 mL contendo 4 mL da solução AbScale cuidadosamente e incubar as fatias para 6 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  14. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicione 4 mL da solução e AbScale incubar as fatias por 2 h 2 vezes com agitação suave na temperatura de quarto.
  15. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de 4% PFA e incubar as fatias para 1 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  16. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de PBS e incubar as fatias para 1 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  17. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL da solução de Sca/eS4 e incubar as fatias para 12 h com agitação suave a 37 ° C.
  18. Coloque o espaçador sobre uma lâmina de vidro e coloque as fatias no espaçador e mergulhe as fatias com solução Sca/eS4. Sele o espaçador com um tampa de vidro (Figura 1).
  19. Ponha água no vidro de tampa e imagem utilizando microscopia confocal ou dois fotões com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância. Se necessário, utilize um palco motorizado.
    Nota: Verifique se as partes profundas da amostra são etiquetadas similarmente às partes superficiais para confirmar a ausência de um significativo viés de rotulagem.
    Nota: A penetração dos anticorpos testados é descrita na tabela 3.

6. determinação de posição de célula

  1. Para cada posição em imagens digitalizadas, calcule os valores de correlação usando um filtro de imagem tridimensional14 (Figura 5A-5D).
  2. Determine as posições dos picos do valor de correlação (Figura 5).
  3. Investiga imagens em torno dos picos para localizar as células (Figura 5E).

Resultados

Nós rotulados de neurônios de projeção cortical pela expressão de tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos transgénicos e visualizado neurônios de projeção sub cerebral através da injeção do traçador retrógrado CTB488 em ponte. O hemisfério esquerdo do cérebro foi submetido ao método SeeDB e digitalizados usando um microscópio de dois fotões equipado com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância (25 X, N.A. 1.1, distância de trabalho 2 mm) e...

Discussão

Apresentamos os procedimentos para obter imagens tridimensionais em grande escala da organização de tipo específico de célula a tipos de grandes células na camada neocortical do rato 5. Em comparação com a coloração da fatia convencional, o método é mais útil na determinação da organização tridimensional do neocórtex. O método permite a aquisição de imagens do mais amplo e as mais profundas regiões do cérebro em comparação com o típico na vivo microscopia 2-fóton ou microscopia confocal...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama seus conselhos sobre as experiências de elAbSca, Charles Yokoyama para edição do manuscrito, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino para sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por fundos de pesquisa de RIKEN T.H. e Grants-in-Aid para a investigação científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão para T.H. (áreas inovadoras "Neurocircuitos mesoscópica"; 22115004) e S.S. (25890023).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Crym-egfp transgenic miceMMRRC012003-UCD
Tlx3-cre transgenic miceMMRRC36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato miceJackson LaboratoryJAX #7909
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-010.5 mm thickness
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-021.0 mm thickness
Silicone rubber sheetAS ONE6-611-053.0 mm thickness
Petri dishesFalcon351008
Cover glassMatsunamiC022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugateInvitrogenC22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugateInvitrogenC22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugateInvitrogenC22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugateInvitrogenC34778
26 G Hamilton syringeHamilton701N
Injector pumpKD ScientificKDS 310Pons injection
Injector pumpKD ScientificKDS 100Superior colliculus injection
ManipulatorNarishigeSM-15
Sodium pentobarbitalKyoritsu SeiyakuSomnopentyl
IsofluranePfizer
LidocaineAstraZenecaXylocaine injection 1% with epinephrine
DrillToyo AssociatesHP-200
Avitene microfibrillar hemostatDavol Inc1010090
AlonalfaDaiichi-SankyoAlonalpha A
Surgical silkEthiconK881H
IncubatorUVPHB-1000 Hybridizer
Glass pipetteDrummond Scientific Company2-000-075
Electrode pullerSutter Instrument CompanyP-97
Paraffin Liquid, lightNacalai tesque26132-35
SalineOtsuka1326
ParaformaldehydeNacalai tesque26126-54
Tungsten needleInter medicalΦ0.1 *L200 mm
VibratomeLeicaVT1000S
50 mL plastic tubeFalcon352070
α-thioglycerolNacalai tesque33709-62
D(-) FructoseNacalai tesque16315-55
BluTackBostikCKBT-450000
Two-photon microscopeNikonA1RMP
Water-immersion long working distance objectivesNikonCFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectivesNikonCFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stageCOMSPT100C-50XY
FilterSemrockFF01-492/SP-25
FilterSemrockFF03-525/50-25
FilterSemrockFF03-575/25-25
FilterSemrockFF01-629/56
FilterChromaD605/55m
5 mL plastic tubeAS ONEVIO-5B
2 mL plastic tubeEppendorf 0030120094
UreaNacalai tesque35905-35
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
GlyserolSigma-aldrich191612
D(-)-sorbitolWako191-14735
Methyl-β-cyclodextrinTokyo chemical industryM1356
γ-CyclodextrinWako037-10643
N-acetyl-L-hydroxyprolineSkin Essential Actives33996-33-7
DMSONacalai tesque13445-45
Bovine Serum AlbuminSigma-aldrichA7906
Tween-20 (1.1 g/mL)Nacalai tesque35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206
Confocal microscopeOlympusFV1000
Water-immersion long working distance objectivesOlympusXLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuNMilliporeMAB377
Anti-NeuNMilliporeABN78
Anti-CTIP2Abcamab18465
Anti-Statb2Abcamab51502
Anti-GAD67MilliporeMAB5406
Anti-GABASigmaA2052
Anti-ParvalbuminSwant235
Anti-ParvalbuminFrontier InstitutePV-Go-Af460
Anti-ParvalbuminSigmaP3088
Anti-ParvalbuminAbcamab11427
Anti-SomatostatinPeninsula LaboratoriesT-4103
Anti-c-FosCalbioChemPC38

Referências

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