Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Özet

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Özet

Memeli yeni korteksimiz eksitatör ve inhibitör nöronlar, her biri belirli elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, birçok türde oluşmaktadır ve in vivo fonksiyonları, onların temel fonksiyonel ve anatomik Organizasyon hücresel ağ ölçek kötü anlaşılmaktadır. Burada beyin kortikal hücresel organizasyon incelenmesi için geniş alanlar arasında fluorescently etiketli nöronlar üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronlar belirli türleri floresan retrograd nöronal izleyiciler enjeksiyon veya transgenik farelerde floresan proteinlerin ifade tarafından etiketlenir. Blok beyin örnekler, Örneğin, bir yarımküre fiksasyon sonra hazırlanan, yöntemleri takas doku ile şeffaf yapılmış ve belirli hücre tiplerinin floresan immunolabeling tabi. Geniş alanlarda büyük çalışma mesafe hedefler ve motorlu aşamaları ile donatılmış confocal veya iki fotonlu mikroskoplar kullanılarak taranır. Bu yöntem hücre türüne özgü microcolumn fonksiyonel modüller içinde fare yeni korteksimiz periyodik organizasyonu çözebilirsiniz. Yordamı üç boyutlu hücresel mimarisi farklı beyin bölgeleri ve diğer karmaşık doku çalışma için yararlı olabilir.

Giriş

Memeli yeni korteksimiz çok sayıda hücre tipleri, her biri belirli bir gen ifade desenleri, elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, oluşur ve in vivo ^{1,2 işlevleri ,3,4,5,6,7}. Bu hücre türleri tekrarlanan yapılarına olup olmadığını düzenlenir belirsiz oldu. Görsel yönü sütun ve somatosensor varil, birlikte, kortikal sütunlarını yapıları tekrarladık, ancak belirsiz^8,9hücresel kuruluşlarındaki kalır. Bunlar belirli kortikal alanlarda mevcut ve beyin çapında bir sistem değildir.

Neocortical katmanında 5, nöronlar büyük çoğunluğu dört önemli türe sınıflandırılmaktadır. Eksitatör nöronlar, alt beyin projeksiyon nöronlar, büyük bir tür aksonlar subcortical hedeflerine pons, spinal kord ve üstün olacaklar gibi projeler ve bu nedenle, büyük kortikal çıkış yolu¹⁰temsil eder. Kortikal projeksiyon nöronlar, eksitatör nöronlar, başka bir ana türü korteks¹⁰innervate. İnhibitör nöronlar da iki büyük sınıflar içerir: parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri¹¹.

Son analizler dört hücre tipleri tekrarlanan yapıları^12,13,14düzenlenir gösterir. Alt beyin projeksiyon nöronlar^12,13,14 ve kortikal projeksiyon nöronlar¹⁴ hücre tipi belirli microcolumns 1-2 hücreleri çapında organize etmek. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri özellikle alt beyin projeksiyon nöronların microcolumns ancak değil microcolumns kortikal projeksiyon nöronlar¹⁴hizalayın. Microcolumns kendilerini düzenli olarak altıgen bir dizi¹⁴ örgü ve fare beyin^12,14 ve dilinde görsel, somatosensor ve motor alanları da dahil olmak üzere birden çok kortikal alanlarda mevcut formuna hizalayın. insan beyni¹³alanları. Bireysel microcolumn nöronlarda eşitlenmiş aktivite sergilemek ve benzer duyusal tepkiler var.¹⁴. Bu gözlemler katmanı 5 hücre tipleri fonksiyonel modüller yinelenen ilk bilinen beyin çapında organizasyonu temsil eden bir microcolumn kafes yapısına düzenlemek gösterir.

Microcolumns yaklaşık 10 µm bir yarıçap ve yaklaşık 40 µm kayma bir periodicity var. Buna ek olarak, microcolumns yönünü paralel onların apikal dendrites ve korteks¹⁴konumlarına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, microcolumn sistem birkaç mikrometre onlarca tipik bir kalınlık ile geleneksel kortikal dilimleri kullanarak analiz etmek zordur. Ayrıca, bir çeşitli beyin bölgeleri ve bu nedenle, confocal mikroskobu tipik görüntüleme alanını üç boyutlu verileri periodicity analiz gerektirir veya vivo içinde 2-foton görüntüleme çok dardır.

Son zamanlarda, teknikleri kalın doku^15,16temizlemek için geliştirilmiştir. Burada fare neocortical katmanı 5 büyük hücre tiplerinde microcolumn sistemi oluşturan büyük ölçekli, üç boyutlu görüntüleri elde etmek için bu yöntemlerin uygulanması açıklanmaktadır. Subcerebral projeksiyon nöronlar retrograd etiketleme veya Crym-egfp transgenik fareler¹²ve kortikal projeksiyon nöronların her iki tarafından retrograd etiketlenir gelişmiş yeşil flüoresan protein ifade etiketlenir etiketleme veya Tlx3-cre/Ai9 fareler¹⁷tdTomato ifadede. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri immünhistokimya tarafından etiketlenir. (Antikor ölçek S) AbScale yöntemi¹⁸ antikor (bkz: derin beyin) SeeDB yöntemi¹⁹ diğer deneyler için kullanıldığı gibi deneyler, boyama için kullanılır. Bu yöntemler konvansiyonel görüntüleme yöntemleri yukarıda belirtilen zorlukları aşmak ve katmanı 5¹⁴doğru hücresel organizasyonu ortaya koyuyor.

Protokol

Tüm deneysel yordamlar RIKEN Wako hayvan deneyleri Komitesi ve RIKEN genetik rekombinant deneyi Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan imkanları RIKEN beyin bilim kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen Enstitüsü.

1. hazırlık Chambers'ı görüntüleme

1. Odası¹⁹ görüntüleme
   1. Silikon kauçuk sayfalarını kullanarak, bir oda çeşitli kalınlıklarda yaklaşık 5 mm ve zemin plakaları kalınlığı ile hazırlayın. Ayrıca, Petri yemekler ve cam alt (Şekil 1A) olmadan hazırlayın.
2. Dilim rondela
   1. Silikon kauçuk yaprak kalınlığı 0,5 mm (Şekil 1 c) kullanarak örnekleri, tutmak için boşluk ekleyiciler hazırlayın.

2. izleme enjeksiyon

Not: enjeksiyonları pons (2.1) veya üstün olacaklar (2.2) içine alın. Görsel bölgede üstün olacaklar etiketleri alt beyin projeksiyon sinirlerde içine enjeksiyon sırasında görsel ve motor alanlar da dahil olmak üzere geniş beyin bölgesi pons etiket alt beyin projeksiyon nöronlarda içine enjeksiyon. Kontrol deneyleri için fluorescently etiketli Kolera toksini alt birim B. yerine serum enjekte Steril koşul bakım için steril ekipmanları ve etanol ile temizlenmiş plastik eldiven kullanın.

1. Yetişkin fareler pons içine enjeksiyonu yapmak.
   1. Bir fluorescently etiketli Kolera toksini alt birimi B 1 µL çizmek (25 µg/µL PBS içinde) 26 G Hamilton şırınga içine.
   2. Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.
   3. Şırınga ve pompa stereotaksik araç üzerinde yerleştirilen bir manipülatör araç sahibinin yerleştirin. Manipülatör 12 ° dikey eksenden özafagusu eğ.
   4. İntraperitoneally sodyum Fentobarbital enjekte edilerek bir erkek veya kadın yetişkin (C57BL/6J veya fare Tlx3-cre/Ai9) anestezi (60 mg/kg vücut ağırlığı) veya isoflurane (2-%3) yönetmek. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.
   5. Stereotaksik araç üzerinde fareyi getirin.
   6. Enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi, 10 mm bregma ve lambda görünecek şekilde kesilmiş bir jilet kullanarak saç dikkatli bir şekilde çıkarın. Bir pipet kullanarak %1 lidokain 0.1 mL yönetmek. Böylece bregma ve lambda aynı z düzeyde sahip stereotaksik cihazda ağızlık dikey konumunu ayarlayarak baş açısını ayarlamak.
   7. Manipülatör konumunu kaydetmek ve şırınga ucu bregma yakın olması stereotaksik araç üzerinde kaydırarak manipülatör konumunu ayarlayın. Şırınga manipülatör üzerinde araç tutucu taşıyarak geri çek.
   8. Manipülatör hareket 5.4 mm özafagusu ve 0.4 mm yanal. Böylece kafatası üzerinde giriş noktası ucu yakındır şırınga ilerlemek. Şırıngayı geri çekmek ve giriş noktası işareti.
   9. İşaretli konumda yaklaşık 1 mm çapında bir delik.
   10. Bu bregma ölçülen daha fazla ipucu derinlik 6.9 mm böylece şırınga ucu delikten yerleştirin.
   11. 0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 1 µL enjekte.
   12. Şırınga beyinden kaldırın.
   13. Gerekirse, maruz kalan beyin microfibrillar hemostat ve anlık yapışkan küçük parçaları ile kapak.
   14. Bir pipet ile teslim salin enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi dikiş kullanarak maruz beyin durulayın.
   15. Fare stereotaksik araç kaldırın. Fareyi anestezi genellikle için 1 h 30 ˚C adlı bir kuluçka kurtarmak izin verir. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi sahipsiz bırakmayın. Tam olarak kurtarıldı sonra fare diğer hayvanlar şirkete geri dönün.
   16. Fare 3-7 gün boyunca korumak.
2. Yetişkin fareler üstün olacaklar içine enjeksiyonu yapmak.
   1. Cam Pipet ucu çapı 30 – 50 µm ile hazırlayın.
   2. Cam Pipet Hamilton şırınga plastik tüp (Şekil 2A) aracılığıyla bağlayın.
   3. Cam Pipet, plastik tüp ve Hamilton şırınga parafin sıvı ile doldurun.
   4. Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.
   5. Cam Pipet manipülatör yerleştirin ve manipülatör özafagusu dikey eksen (Şekil 2B) üzerinden 60 ° tilt.
   6. 2.1.4–2.1.9 gerçekleştirin. Manipülatör 1.4 mm arka, 0,5 mm lateral lambda için konumdur.
   7. Kafatasında bir küçük plastik parafin film yeri, sonra yaklaşık 1 µL izleyici çözüm üzerine koydum. Hızlı bir şekilde Cam Pipet ilerlemek ve izleyici çözüm en az 0,5 µL ile doldurun.
   8. İpucu derinliğidir beyin yüzeyinden 3.0 mm Cam Pipet ekleyin.
   9. 0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 0.5 µL enjekte.
   10. Cam Pipet beyinden kaldırın.
   11. 2.1.13–2.1.16 gerçekleştirin.

3. fiksasyon ve düzeltme

1. Sodyum Fentobarbital (60 mg/kg vücut ağırlığı) intraperitoneally (C57BL/6J veya Tlx3-cre/Ai9, ya da 2. adımda açıklandığı şekilde tracer enjeksiyon olmasın. bir fare içine enjekte. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.
2. Fare fare transcardially^%20 0,9 serum fizyolojik ile ventriküler tarafından insanca ötenazi.
3. Ventriküler tarafından²⁰ fare saptamak 0.1 M fosfat tampon (pH 7.5) % 4 paraformaldehyde (PFA).
4. Kafatası açıklanan²⁰olarak ortaya çıkarmak için makas kullanarak kafa derisi kesilmiş.
   1. Makas kullanarak maruz kafatasının orta hat kesilmiş. Forseps kullanarak kafatasını.
   2. Bregma ve lambda konumunu işaretleme gerekli ise, önce bir yarımküre kafatası kaldırın. Beyin bregma ve beyin üzerinde kalan kafatasındaki lambda pozisyonlarda ince tungsten iğne takın, sonra kalan kafatası kaldırın.
      Not: Beyin 4 ˚C PBS içinde depolanabilir.
5. İnhibitör nöronlar antikor boyama gerçekleştirmek için beyin örnekleri dilimler halinde kesin.
   1. Beyin örnek bir vibratome yerleştirin.
   2. En fazla 500 µm oda sıcaklığında PBS içinde kalın dilimler kesin ve adım 5 (AbScale yöntemi)'e devam edin.
6. Antikor boyama gereksizdir, trim beyin örnek (ilâ 3 mm kalınlığında) engeller bir tıraş bıçağı (Şekil 3) kullanarak ve adım 4 (SeeDB yöntemi)'e devam edin.
   Not: Beyin PBS içinde 4 ° C'de kesme veya düzeltme sonra saklanır. AbScale yöntemi daha az zaman gerektirir çünkü antikor boyama gerekmediğinde SeeDB yöntemi tercih edilir.

4. takas antikor boyama (SeeDB yöntemi)

1. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %20 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
2. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve % 40 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
3. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %60 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
4. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
5. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %100 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
6. Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80.2 (w/w) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 24 h için kuluçkaya.
   Not: örnek dikkatle deformasyonlar olabildiğince küçük tutmak için baş. Örnekleri hızla opak olabilirsiniz gibi örnekleri belirtilenden daha uzun kuluçkaya değil.
7. Örnek %80.2 fruktoz çözüm (Şekil 1B) ile dolu bir görüntüleme odası katıştırın. Gerekirse, örnek kauçuk yapıştırıcı küçük parçalar koyarak düzeltmek. Odası örnekleri yerleştirmeden önce odasında bir yere plaka koymak çok derin değilse.
8. Görüntüleme odası cam kapaklı Petri kabına yerleştirin ve çanak ve görüntü confocal veya iki fotonlu mikroskobu uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile kullanarak su koyun. Uyarma dalga boylarında ve emisyon filtreler Tablo 1' de açıklanmıştır. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.

5. (AbScale yöntemi) boyama antikor ile takas

1. Reaktifler Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
2. Bir spatula 4 mL ani kalp durması/eS0 çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri aktarın ve onlara nazik 37 ° C'de (Şekil 4B) sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
3. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 36 h için dilimleri kuluçkaya
4. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eB4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 24 h için dilimleri kuluçkaya
5. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya
6. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.
7. Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
8. 1 ml AbScale çözüm 48-72 h 37 ° C'de nazik sallayarak ile (Şekil 4 c) için birincil antikorlar (Tablo 3) ile kuluçkaya.
9. Bir spatula kullanarak bir 5 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
10. AbScale çözüm için 2 h 2 kez oda sıcaklığında hafif sallayarak ile 4 ml kuluçkaya.
11. Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
12. Fluorescently etiketli ikincil antikorlar (Tablo malzemeler, 1: 100) AbScale çözüm 37 ° C'de nazik sallayarak ile 48 saat için 1 ml ile kuluçkaya.
13. Dikkatli bir spatula 4 mL AbScale çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri kaldırmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.
14. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve 4 mL AbScale çözeltisi ekleyin ve 2 kez nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 2 h için dilimleri kuluçkaya.
15. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırın ve 4 mL % 4'lük ekleyin PFA ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.
16. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.
17. Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eS4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya
18. Bir cam slayt üzerinde spacer yer ve dilimleri içinde spacer yer ve ani kalp durması/eS4 çözüm dilimlerle batırmayın. Rondela (Şekil 1 d) bir cam ile kapatın.
19. Su cam ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile confocal veya iki fotonlu mikroskobu kullanarak resim koymak. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.
    Not: örnek derin bölgelerinde önemli bir etiketleme önyargı yokluğu onaylamak için yüzeysel bölümlerine benzer şekilde etiketli olup olmadığını kontrol edin.
    Not: Penetrasyon test antikorların Tablo 3' te tanımlanmıştır.

6. hücre konumu belirleme

1. Taranan görüntülerde her bir pozisyon için bir üç boyutlu görüntü filtresi¹⁴ (Şekil 5A-5D) kullanarak korelasyon değerleri hesaplar.
2. Correlation değeri (Şekil 5 d) doruklarına konumları belirler.
3. Görüntüleri hücreleri (Şekil 5E) bulmak için zirveleri etrafına araştırmak.

Sonuçlar

Kortikal projeksiyon nöronlar tdTomato Tlx3-creiçinde ifade tarafından /Ai9 transgenik fareler etiketli ve retrograd izleyici CTB488 pons enjekte edilerek alt beyin projeksiyon nöronlar görüntülenir. Beynin sol hemisfer SeeDB yöntemine maruz bırakıldı ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile donatılmış iki fotonlu mikroskop kullanarak inceden inceye gözden geçirmek (25 X, N.A. 1.1, çalışma mesafesi 2 mm) ve motorlu bir sahne. 401 görünt?...

Tartışmalar

Biz büyük hücre tiplerinin fare neocortical tabakasında 5 hücre türüne özgü organizasyonun büyük ölçekli üç boyutlu görüntü elde etmek yordamlar sundu. Geleneksel dilim boyama için karşılaştırıldığında, yöntem yeni korteksimiz üç boyutlu organizasyonu belirlemede daha yararlı olur. Yöntem resim alma üzerinden daha geniş ve daha derin beyin bölgeleri tipik vivo içinde 2-foton mikroskopi veya geleneksel confocal mikroskobu ile karşılaştırıldığında ve böylece, neocortica...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crym-egfp transgenic mice	MMRRC	012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice	MMRRC	36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX #7909
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-01	0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-02	1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-05	3.0 mm thickness
Petri dishes	Falcon	351008
Cover glass	Matsunami	C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate	Invitrogen	C34778
26 G Hamilton syringe	Hamilton	701N
Injector pump	KD Scientific	KDS 310	Pons injection
Injector pump	KD Scientific	KDS 100	Superior colliculus injection
Manipulator	Narishige	SM-15
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl
Isoflurane	Pfizer
Lidocaine	AstraZeneca	Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill	Toyo Associates	HP-200
Avitene microfibrillar hemostat	Davol Inc	1010090
Alonalfa	Daiichi-Sankyo	Alonalpha A
Surgical silk	Ethicon	K881H
Incubator	UVP	HB-1000 Hybridizer
Glass pipette	Drummond Scientific Company	2-000-075
Electrode puller	Sutter Instrument Company	P-97
Paraffin Liquid, light	Nacalai tesque	26132-35
Saline	Otsuka	1326
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	26126-54
Tungsten needle	Inter medical	Φ0.1 *L200 mm
Vibratome	Leica	VT1000S
50 mL plastic tube	Falcon	352070
α-thioglycerol	Nacalai tesque	33709-62
D(-) Fructose	Nacalai tesque	16315-55
BluTack	Bostik	CKBT-450000
Two-photon microscope	Nikon	A1RMP
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage	COMS	PT100C-50XY
Filter	Semrock	FF01-492/SP-25
Filter	Semrock	FF03-525/50-25
Filter	Semrock	FF03-575/25-25
Filter	Semrock	FF01-629/56
Filter	Chroma	D605/55m
5 mL plastic tube	AS ONE	VIO-5B
2 mL plastic tube	Eppendorf	0030120094
Urea	Nacalai tesque	35905-35
Triton X-100	Nacalai tesque	35501-15
Glyserol	Sigma-aldrich	191612
D(-)-sorbitol	Wako	191-14735
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo chemical industry	M1356
γ-Cyclodextrin	Wako	037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline	Skin Essential Actives	33996-33-7
DMSO	Nacalai tesque	13445-45
Bovine Serum Albumin	Sigma-aldrich	A7906
Tween-20 (1.1 g/mL)	Nacalai tesque	35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Water-immersion long working distance objectives	Olympus	XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN	Millipore	MAB377
Anti-NeuN	Millipore	ABN78
Anti-CTIP2	Abcam	ab18465
Anti-Statb2	Abcam	ab51502
Anti-GAD67	Millipore	MAB5406
Anti-GABA	Sigma	A2052
Anti-Parvalbumin	Swant	235
Anti-Parvalbumin	Frontier Institute	PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin	Sigma	P3088
Anti-Parvalbumin	Abcam	ab11427
Anti-Somatostatin	Peninsula Laboratories	T-4103
Anti-c-Fos	CalbioChem	PC38