Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Riepilogo

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Abstract

La neocorteccia dei mammiferi è composta di molti tipi di neuroni eccitatori ed inibitori, ognuno con specifiche proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni, ma loro basic funzionale e anatomica organizzazione dal cellulare alla scala di rete è capita male. Qui descriviamo un metodo per l'imaging tridimensionale dei neuroni fluorescente etichettati attraverso grandi aree del cervello per l'indagine l'organizzazione corticale. Specifici tipi di neuroni sono contrassegnati tramite l'iniezione di traccianti fluorescenti di un neurone retrogradi o l'espressione di proteine fluorescenti in topi transgenici. Campioni di blocco del cervello, per esempio, un emisfero, sono preparati dopo la fissazione, reso trasparenti con tessuto metodi di compensazione e sottoposti a immunolabeling fluorescente dei tipi cellulari specifici. Grandi aree vengono scansionati usando microscopi confocale o due-fotone dotati di grande lavoro distanza obiettivi e fasi motore. Questo metodo può risolvere l'organizzazione periodica dei moduli funzionali di tipo-specific microcolonna di cella nella neocorteccia del mouse. La procedura può essere utile per lo studio di architettura cellulare tridimensionale in aree cerebrali diverse e altri tessuti complessi.

Introduzione

La neocorteccia dei mammiferi è composta da un gran numero di tipi di cellule, ognuna con il pattern di espressione genica specifici, proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni^{1,2 ,3,4,5,6,7}. Se questi tipi di cellule sono organizzati in strutture ripetute è stato poco chiaro. Colonne corticali, comprese le colonne di orientamento visivo e somatosensoriali botti, hanno ripetuto le strutture, ma la loro organizzazione cellulare rimane poco chiaro^8,9. Questi sono presenti nelle specifiche aree corticali e non sono un sistema di tutto il cervello.

Nello strato neocortical 5, la grande maggioranza dei neuroni è classificata in quattro tipi principali. Un tipo principale di neuroni eccitatori, neuroni di proiezione Sub-cerebrale, proietta assoni subcortical obiettivi inclusi pons, midollo spinale e il collicolo superiore e, pertanto, rappresenta i principali output corticale via¹⁰. Neuroni di proiezione corticale, un altro tipo di neuroni eccitatori, innervano la corteccia¹⁰. Neuroni inibitori contengono anche due grandi classi: le cellule che esprimono parvalbumina ed esprimendo la somatostatina¹¹.

Recenti analisi indicano che i tipi di quattro cellule sono organizzati in strutture ripetute^12,13,14. Sia sub-cerebrale proiezione neuroni^12,13,14 e proiezione corticale neuroni¹⁴ organizzare in cellula-tipo microcolonne specifico con un diametro di 1 – 2 celle. Le cellule che esprimono parvalbumina e somatostatina-esprimendo allineare specificamente con microcolonne dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale ma non con microcolonne di proiezione corticale neuroni¹⁴. Microcolonne stessi allineare periodicamente a forma esagonale della grata di matrice¹⁴ e sono presenti in più aree corticali, comprese le zone visivi, somatosensoriali e motori nel cervello del mouse^12,14 e in lingua aree del cervello umano¹³. Neuroni nella microcolonna singolo esibiscono l'attività sincronizzata e avere risposte sensoriali simili¹⁴. Queste osservazioni indicano che tipi di cellule strato 5 organizzano in una struttura di reticolo microcolonna che rappresenta l'organizzazione di tutto il cervello nota prima di ripetere moduli funzionali.

Microcolonne hanno un raggio di circa 10 µm e hanno una periodicità spaziale di circa 40 µm. Inoltre, l'orientamento delle microcolonne è parallelo alla loro dendriti apicali e cambia a seconda della loro posizione nella corteccia¹⁴. Pertanto, il sistema microcolonna è difficile da analizzare utilizzando fette corticali convenzionale con uno spessore tipico di poche decine di micrometri. Inoltre, l'analisi della periodicità richiede dati tridimensionali da una vasta gamma di aree cerebrali e, pertanto, l'area di imaging tipico di microscopia confocale o in vivo imaging 2-fotone è troppo stretta.

Recentemente, le tecniche sono state sviluppate per deselezionare tessuti spessi^15,16. Qui descriviamo l'applicazione di questi metodi per ottenere immagini tridimensionali, su larga scala dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5 che compongono il sistema microcolonna. Neuroni di proiezione subcerebral sono etichettati dall'etichettatura retrograda o dall'espressione della proteina fluorescente verde avanzata in Crym-egfp topi transgenici¹²e proiezione corticale neuroni sono etichettati da entrambi il retrogrado etichettatura o dall'espressione del tdTomato Tlx3-cre/Ai9 topi¹⁷. Le cellule che esprimono parvalbumina e che esprimono somatostatina sono etichettate da immunohistochemistry. Il metodo (anticorpo scala S) AbScale¹⁸ viene utilizzato per l'anticorpo che macchia esperimenti, mentre il metodo SeeDB (vedere cerebrale profonda)¹⁹ viene utilizzato per altri esperimenti. Questi metodi superare le suddette difficoltà dei metodi convenzionali di formazione immagine e rivelano l'organizzazione accurata di strato 5¹⁴.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di esperimenti di RIKEN Wako animale e RIKEN genetico ricombinante esperimento Safety Committee ed eseguite secondo le linee guida istituzionali dell'animale il RIKEN Brain Science: Servizi Istituto.

1. preparazione di Imaging Chambers

1. Imaging camera¹⁹
   1. Utilizzando lastre di gomma siliconica, preparare una camera con uno spessore di circa 5 mm e piano lamiere di vari spessori. Inoltre, preparare piatti Petri con e senza un fondo di vetro (Figura 1A).
2. Distanziale di fetta
   1. Preparare i distanziali per contenere campioni, utilizzando lastre di gomma siliconica con uno spessore di 0,5 mm (Figura 1).

2. tracer iniezione

Nota: Fare iniezioni nel collicolo superiore (2.2) o pons (2.1). Iniezione nei neuroni di proiezione Sub-cerebrale di etichetta pons in una regione vasta cervello, comprese le aree visive e motorie, mentre l'iniezione nel collicolo superiore etichette neuroni di proiezione Sub-cerebrale nel campo visivo. Per gli esperimenti di controllo, iniettare soluzione fisiologica invece di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B. Per il mantenimento dello stato sterile utilizzare attrezzature sterilizzate e guanti di plastica puliti con etanolo.

1. Fare le iniezioni nel ponte di topi adulti.
   1. Disegnare 1 µ l di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B (25 µ g / µ l di PBS) in una siringa Hamilton G 26.
   2. Posto un iniettore pompa della siringa.
   3. Posizionare la siringa e la pompa al supporto utensile di un manipolatore posizionato su uno strumento stereotassica. Inclinare il manipolatore 12° posteriormente rispetto all'asse verticale.
   4. Anestetizzare un topo adulto maschio o femmina (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9) iniettando sodio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg di peso corporeo) o con la somministrazione di isoflurano (2 – 3%). Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.
   5. Posizionare il mouse sullo strumento stereotassica.
   6. Rimuovere accuratamente i capelli con una lama di rasoio per prevenire l'infezione e tagliare 10 mm del cuoio capelluto in modo che il bregma e lambda sono visibili. Somministrare 0,1 mL di lidocaina 1% utilizzando una pipetta. Regolando la posizione verticale del boccaglio sullo strumento stereotassica affinché il bregma e lambda hanno lo stesso livello di z, impostare l'angolo della testa.
   7. Regolare la posizione del manipolatore facendolo sullo strumento stereotassica in modo che la punta della siringa è vicino il bregma e registrare la posizione del manipolatore. Ritrarre la siringa spostando il portautensile sul manipolatore.
   8. Spostare il manipolatore 5,4 mm posteriormente e 0,4 mm lateralmente. Avanzare la siringa in modo che la punta si trova vicino al punto di entrata sul cranio. Ritrarre la siringa e segnare il punto di ingresso.
   9. La posizione contrassegnata, praticare un foro con un diametro di circa 1 mm.
   10. Inserire la punta della siringa nel foro in modo che la profondità della punta è 6,9 mm più di quella misurata presso il bregma.
   11. Iniettare 1 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.
   12. Rimuovere la siringa dal cervello.
   13. Se necessario, coprire il cervello esposto con piccoli frammenti di microfibrillare emostato e adesivo istantaneo.
   14. Sciacquare il cervello esposto utilizzando soluzione fisiologica consegnato con una pipetta per prevenire l'infezione e suturare il cuoio capelluto.
   15. Rimuovere il mouse dallo strumento stereotassica. Consentire il mouse per recuperare dall'anestesia in un incubatore a 30 ˚ c, in genere per 1 h. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Restituire il mouse per la compagnia di altri animali dopo che completamente ha recuperato.
   16. Mantenere il mouse per 3 – 7 giorni.
2. Fare le iniezioni nel collicolo superiore di topi adulti.
   1. Preparare una pipetta di vetro con un diametro di punta di 30 – 50 µm.
   2. Connettere la pipetta di vetro una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica (Figura 2A).
   3. Riempire la pipetta di vetro, tubo di plastica e siringa Hamilton con il liquido paraffina.
   4. Posto un iniettore pompa della siringa.
   5. Inserire la pipetta di vetro sul manipolatore e inclinare il manipolatore 60° posteriormente rispetto all'asse verticale (Figura 2B).
   6. Eseguire 2.1.4–2.1.9. La posizione del manipolatore è 1,4 mm posteriore, laterale di 0,5 mm per l'espressione lambda.
   7. Posizionare una pellicola di plastica piccolo paraffina sul cranio, quindi mettere circa 1 µ l della soluzione tracciante su di esso. Avanzare la pipetta di vetro e riempirlo con almeno 0,5 µ l della soluzione tracciante rapidamente.
   8. Inserire la pipetta di vetro in modo che la profondità di punta è di 3,0 mm dalla superficie del cervello.
   9. Iniettare 0,5 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.
   10. Rimuovere la pipetta di vetro dal cervello.
   11. Eseguire 2.1.13–2.1.16.

3. fissazione e rifilatura

1. Iniettare per via intraperitoneale sodio pentobarbital (60 mg/kg di peso corporeo) in un mouse (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9, con o senza l'iniezione tracciante come descritto nel passaggio 2. Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.
2. Eutanasia il mouse umanamente irrorando il mouse via²⁰ con soluzione fisiologica allo 0,9%.
3. Difficoltà il mouse²⁰ irrorando paraformaldeide al 4% (PFA) in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.5).
4. Tagliare il cuoio capelluto utilizzando un paio di forbici per esporre il cranio come descritto²⁰.
   1. Tagliare la linea mediana del cranio esposto utilizzando un paio di forbici. Rimuovere il cranio usando il forcipe.
   2. Se contrassegnare la posizione del bregma e lambda è necessario, prima di rimuovere un emisfero del cranio. Inserire gli aghi sottili di tungsteno nel cervello alle posizioni del bregma e lambda sul cranio restanti sul cervello, quindi rimuovere il cranio rimanente.
      Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ˚ c.
5. Per eseguire la macchiatura dell'anticorpo dei neuroni inibitori, tagliare a fette i campioni di cervello.
   1. Posizionare il campione di cervello su un vibratomo.
   2. Tagliate le fette fino a 500 µm di spessore in PBS a temperatura ambiente e procedere al passaggio 5 (il AbScale metodo).
6. Se la macchiatura dell'anticorpo è necessaria, trim il campione di cervello a blocchi (fino a 3 mm di spessore) con una lama di rasoio (Figura 3) e procedere al passaggio 4 (metodo SeeDB).
   Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ° C dopo il taglio o rifilatura. Il metodo di SeeDB è preferibile quando la macchiatura dell'anticorpo non è necessaria perché richiede meno tempo rispetto al metodo dil. e AbSca.

4. compensazione senza anticorpi (metodo SeeDB)

1. Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
2. Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
3. Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
4. Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80% (w/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
5. Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
6. Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica di 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80,2% di fruttosio (w/w) e incubare per 24 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
   Nota: Maneggiare il campione accuratamente per evitare deformazioni più piccolo possibile. Non Incubare i campioni più lunghi rispetto a quanto indicato, come campioni possono rapidamente diventare opachi.
7. Incorporare il campione in una camera di imaging riempita con la soluzione di fruttosio 80,2% (Figura 1B). Se necessario, correggere l'esempio mettendo piccoli pezzi di adesivo di gomma intorno. Se la camera è troppo profonda, mettere un piatto piano in Aula prima di mettere i campioni.
8. Mettere la capsula di Petri con un coperchio di vetro sulla camera imaging e mettere l'acqua nel piatto e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione filtri sono descritti nella tabella 1. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato.

5. schiarimento con anticorpo che macchia (il AbScale metodo)

1. Preparare i reagenti come descritto in tabella 2.
2. Trasferire le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL di soluzione di Sca/eS0 e li Incubare per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C (Figura 4B).
3. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 36 h con agitazione delicata a 37 ° C.
4. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eB4 e incubare le fette per 24 h con agitazione delicata a 37 ° C.
5. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.
6. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
7. Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.
8. Incubare con gli anticorpi primari (tabella 3) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48-72 h a 37 ° C (Figura 4) con agitazione delicata.
9. Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 5 mL con una spatola.
10. Incubare in 4 mL di soluzione di AbScale per 2 h 2 volte a temperatura ambiente con agitazione delicata.
11. Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.
12. Incubare con anticorpi secondari con etichetta fluorescente (Tabella materiali, 1: 100) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48 h a 37 ° C con agitazione delicata.
13. Rimuovere le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL della soluzione elAbSca con cautela e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
14. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL della soluzione elAbSca e incubare le fette per 2 h 2 volte con agitazione delicata a temperatura ambiente.
15. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di 4% PFA e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
16. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
17. Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca-eS4 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.
18. Posizionare il distanziale su un vetrino e mettere le fette nel distanziale e immergere le fette con Sca-eS4 soluzione. Sigillare il distanziatore con un vetro di copertura (Figura 1).
19. Mettere l'acqua sul vetro di copertura e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato.
    Nota: Controllare se le parti profonde del campione sono etichettate allo stesso modo per le parti superficiali per confermare l'assenza di una significativa distorsione d'etichettatura.
    Nota: La penetrazione degli anticorpi testati è descritto nella tabella 3.

6. determinazione della posizione di cella

1. Per ciascuna posizione in immagini digitalizzate, calcolare i valori di correlazione utilizzando un'immagine tridimensionale filtro¹⁴ (Figura 5A-5D).
2. Determinare le posizioni dei picchi del valore di correlazione (Figura 5).
3. Indagare le immagini intorno alle cime per individuare le celle (Figura 5E).

Risultati

Abbiamo etichettato neuroni di proiezione corticale di espressione di tdTomato in Tlx3-cretopi transgenici /Ai9 e visualizzati i neuroni di proiezione Sub-cerebrale iniettando il tracciante retrogrado CTB488 nel ponte. L'emisfero sinistro del cervello è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionati usando un microscopio a due fotoni dotato di un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (25 X, N.A. 1.1, distanza di lavoro 2 mm) e un tavolino moto...

Discussione

Abbiamo presentato le procedure per ottenere immagini tridimensionali su larga scala dell'organizzazione cellulare specifico del tipo dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5. Rispetto alla fetta convenzionale macchiatura, il metodo è più utile nel determinare l'organizzazione tridimensionale della neocorteccia. Il metodo consente acquisizione immagini dalla più ampia e le regioni del cervello più profonde rispetto al tipico in vivo microscopia 2-fotone o microscopia confocale conve...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crym-egfp transgenic mice	MMRRC	012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice	MMRRC	36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX #7909
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-01	0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-02	1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-05	3.0 mm thickness
Petri dishes	Falcon	351008
Cover glass	Matsunami	C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate	Invitrogen	C34778
26 G Hamilton syringe	Hamilton	701N
Injector pump	KD Scientific	KDS 310	Pons injection
Injector pump	KD Scientific	KDS 100	Superior colliculus injection
Manipulator	Narishige	SM-15
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl
Isoflurane	Pfizer
Lidocaine	AstraZeneca	Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill	Toyo Associates	HP-200
Avitene microfibrillar hemostat	Davol Inc	1010090
Alonalfa	Daiichi-Sankyo	Alonalpha A
Surgical silk	Ethicon	K881H
Incubator	UVP	HB-1000 Hybridizer
Glass pipette	Drummond Scientific Company	2-000-075
Electrode puller	Sutter Instrument Company	P-97
Paraffin Liquid, light	Nacalai tesque	26132-35
Saline	Otsuka	1326
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	26126-54
Tungsten needle	Inter medical	Φ0.1 *L200 mm
Vibratome	Leica	VT1000S
50 mL plastic tube	Falcon	352070
α-thioglycerol	Nacalai tesque	33709-62
D(-) Fructose	Nacalai tesque	16315-55
BluTack	Bostik	CKBT-450000
Two-photon microscope	Nikon	A1RMP
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage	COMS	PT100C-50XY
Filter	Semrock	FF01-492/SP-25
Filter	Semrock	FF03-525/50-25
Filter	Semrock	FF03-575/25-25
Filter	Semrock	FF01-629/56
Filter	Chroma	D605/55m
5 mL plastic tube	AS ONE	VIO-5B
2 mL plastic tube	Eppendorf	0030120094
Urea	Nacalai tesque	35905-35
Triton X-100	Nacalai tesque	35501-15
Glyserol	Sigma-aldrich	191612
D(-)-sorbitol	Wako	191-14735
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo chemical industry	M1356
γ-Cyclodextrin	Wako	037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline	Skin Essential Actives	33996-33-7
DMSO	Nacalai tesque	13445-45
Bovine Serum Albumin	Sigma-aldrich	A7906
Tween-20 (1.1 g/mL)	Nacalai tesque	35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Water-immersion long working distance objectives	Olympus	XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN	Millipore	MAB377
Anti-NeuN	Millipore	ABN78
Anti-CTIP2	Abcam	ab18465
Anti-Statb2	Abcam	ab51502
Anti-GAD67	Millipore	MAB5406
Anti-GABA	Sigma	A2052
Anti-Parvalbumin	Swant	235
Anti-Parvalbumin	Frontier Institute	PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin	Sigma	P3088
Anti-Parvalbumin	Abcam	ab11427
Anti-Somatostatin	Peninsula Laboratories	T-4103
Anti-c-Fos	CalbioChem	PC38