Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Zusammenfassung

Säugetier-Neocortex besteht aus vielen Arten von erregenden und hemmenden Neuronen, mit jeweils spezifischen elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und in Vivo Funktionen, aber ihre grundlegende funktionelle und anatomische Organisation von zellulären Netzwerk maßstabsgetreu ist wenig bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale Bildgebung von eindringmittel beschriftet Neuronen über große Bereiche des Gehirns für die Untersuchung der kortikalen zelluläre Organisation. Bestimmte Arten von Neuronen sind durch die Injektion von fluoreszierenden retrograde neuronaler Tracer oder Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen bei transgenen Mäusen beschriftet. Block Gehirn Proben, z. B. eine Halbkugel, zubereitet nach der Fixierung mit Gewebe clearing Methoden transparent gemacht und fluoreszierende Immunolabeling der spezifischen Zelltypen unterzogen. Große Flächen werden gescannt, konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit großen Arbeiten Abstand Ziele und motorisierte Stufen ausgestattet. Die regelmäßige Organisation der Zelle typspezifischen Microcolumn Funktionsmodule in der Maus Neocortex kann mit dieser Methode beheben. Das Verfahren kann für das Studium der dreidimensionalen zellulären Architektur in den verschiedenen Hirnarealen und anderen komplexen Geweben nützlich sein.

Einleitung

Der Säugetier-Neocortex besteht aus eine Vielzahl von Zelltypen, die jeweils mit spezifischen gen Expressionsmuster, elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und Funktionen in Vivo ^{1,2 ,3,4,5,6,7}. Ob dieser Zelltypen in wiederholten Strukturen organisiert sind war ungeklärt. Kortikale Säulen, einschließlich visuelle Orientierung Spalten und somatosensorischen Fässer haben Strukturen wiederholt, aber ihre zelluläre Organisation bleibt unklar^8,9. Diese sind in der kortikalen Bereiche und sind kein Gehirn-System.

In neokortikalen Schicht 5 sind die große Mehrheit der Neuronen in vier Haupttypen eingeteilt. Eine wichtige Art von exzitatorischen Neuronen, Sub-zerebrale Projektion Neuronen Axone, subkortikale Ziele einschließlich der Pons, Rückenmark und Colliculus superior-Projekte und stellt daher, die größeren kortikalen Ausgang Weg¹⁰. Kortikalen Projektion Neuronen, eine weitere wichtige Art von exzitatorischen Neuronen innervieren den Kortex-¹⁰. Hemmende Neuronen enthalten auch zwei Hauptgruppen: Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen¹¹.

Jüngste Analysen deuten darauf hin, dass die vier Zelltypen in wiederholten Strukturen^12,13,14organisiert sind. Sub-zerebrale Projektion Neuronen^12,13,14 und kortikalen Projektion Neuronen¹⁴ organisieren in Zelltyp spezifische Microcolumns mit einem Durchmesser von 1 – 2 Zellen. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen richten Sie speziell mit Microcolumns von Sub-zerebrale Projektion Neuronen, aber nicht mit Microcolumns von kortikalen Projektion Neuronen¹⁴. Microcolumns selbst ausrichten in regelmäßigen Abständen in Form eines sechseckigen Gitter Array¹⁴ und sind in mehrere kortikalen Bereiche einschließlich visuelle, somatosensorische und motorische Bereichen Maus Gehirn^12,14 und in Sprache Bereiche des menschlichen Gehirns¹³. Neuronen in den einzelnen Microcolumn synchronisierte Aktivität aufweisen und haben ähnliche sensorischen Antworten¹⁴. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Schicht 5 Zelltypen in einer Microcolumn Gitterstruktur repräsentieren die erste bekannte Gehirn-weiten Organisation wiederholen Funktionsmodule zu organisieren.

Microcolumns haben einen Radius von ca. 10 µm und eine räumliche Periodizität von etwa 40 µm. Darüber hinaus ist die Ausrichtung des Microcolumns parallel zu ihrer apikalen Dendriten und ändert sich je nach ihrer Position in der Kortex-¹⁴. Das Microcolumn System ist daher schwer zu analysieren, mit herkömmlichen kortikalen Scheiben mit einer typischen Dicke von ein paar Dutzend Mikrometer. Darüber hinaus die Analyse der Periodizität erfordert dreidimensionale Daten aus einer Vielzahl von Hirnareale und daher die typische imaging-Bereich der konfokalen Mikroskopie oder in Vivo 2-Photonen-Bildgebung ist zu schmal.

Vor kurzem haben Techniken entwickelt worden, um Dicke Gewebe^15,16zu löschen. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Methoden auf groß angelegte, dreidimensionale Bilder der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 erhalten, aus die das Microcolumn-System besteht. Subcerebral Projektion Neuronen sind gekennzeichnet durch die retrograde Beschriftung oder den Ausdruck das erhöhte grün fluoreszierende Protein in Crym-Egfp Transgene Mäuse¹²und kortikalen Projektion Neuronen durch entweder die retrograde beschriftet sind Kennzeichnung oder durch den TdTomato Ausdruck im Tlx3-Cre/Ai9 Mäuse¹⁷. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen sind von Immunohistochemistry bezeichnet. (Antikörper Skala S) AbScale Methode¹⁸ dient für den Antikörper Experimente, Färbung, während die SeeDB (siehe Deep Brain) Methode¹⁹ für andere Experimente verwendet wird. Diese Methoden der konventionellen bildgebenden Verfahren die oben genannten Schwierigkeiten überwinden und zeigen die genaue zelluläre Organisation der Schicht 5¹⁴.

Protokoll

Alle experimentelle Verfahren wurde vom RIKEN Wako Animal Experimente Committee und RIKEN genetische rekombinante Experiment Safety Committee genehmigt und durchgeführt nach den institutionellen Richtlinien der Tierhaltung des RIKEN Brain Science Institut.

1. Vorbereitung von Imaging-Kammern

1. Imaging-Kammer¹⁹
   1. Mit Silikon-Beläge, bereiten Sie eine Kammer mit einer Dicke von ca. 5 mm und Boden Platten in verschiedenen stärken. Darüber hinaus bereiten Sie Petrischalen mit und ohne einem Glasboden (Abbildung 1A).
2. Slice-Abstandhalter
   1. Bereiten Sie Abstandhalter für Samples, mit Silikon-Beläge mit einer Dicke von 0,5 mm (Abbildung 1).

(2) Tracer Injektion

Hinweis: Stellen Sie Injektionen in der Pons (2.1) oder superior Colliculus (2.2). Injektion in den Pons Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einem breiten Hirnregion einschließlich der visuellen und motorischen Bereiche während der Injektion in die superior Colliculus Labels Sub zerebralen Projektion Neuronen im visuellen Bereich. Injizieren Sie für Experimente Kochsalzlösung statt eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B. Verwenden Sie für die Wartung von sterilem Zustand sterilisierte Geräte und Plastikhandschuhe mit Ethanol gereinigt.

1. Machen Sie Injektionen in der Pons Erwachsener Mäuse.
   1. 1 µL eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B zu zeichnen (25 µg/µL mit PBS-Puffer) in eine 26 G Hamilton-Spritze.
   2. Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.
   3. Legen Sie die Spritze und Pumpe auf dem Werkzeugträger eines Manipulator, platziert auf einem stereotaktischen Instrument. Kippen Sie den Manipulator 12° nach hinten aus der vertikalen Achse.
   4. Betäuben Sie eine männliche oder weibliche Erwachsene Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9) durch die intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) oder durch die Gabe von Isofluran (2 – 3 %). Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.
   5. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem stereotaktischen Instrument.
   6. Entfernen Sie vorsichtig die Haare mit einer Rasierklinge um Infektionen zu verhindern und 10 mm von der Kopfhaut zu schneiden, so dass die Bregma und Lambda sichtbar sind. Verabreichen Sie 0,1 mL von 1 % Lidocain mit einer Pipette. Legen Sie den Winkel des Kopfes, die vertikale Position des Mundstücks auf dem stereotaktischen Instrument so angepasst, dass die Bregma und Lambda die gleichen Z-Ebene haben.
   7. Passen Sie die Position des Manipulators am stereotaktischen Gerät schieben, so dass die Spitze der Spritze in der Nähe der Bregma und zeichnen Sie die Position des Manipulators. Ziehen Sie die Spritze durch Verschieben der Werkzeughalter auf dem Manipulator.
   8. Verschieben den Manipulator 5,4 mm nach hinten und 0,4 mm seitlich. Voraus die Spritze, so dass die Spitze in der Nähe der Einstiegspunkt auf dem Schädel ist. Ziehen Sie die Spritze und markieren Sie den Eintrittspunkt.
   9. Bohren Sie an der markierten Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von ca. 1 mm.
   10. Legen Sie die Spitze der Spritze durch das Loch, so dass die Spitze Tiefe 6,9 mm ist mehr als, dass bei der Bregma gemessen.
   11. 1 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.
   12. Ziehen Sie die Spritze aus dem Gehirn.
   13. Bei Bedarf decken Sie die exponierten Gehirn mit kleine Fragmente von mikrofibrillären Gefäßklemme und Sekundenkleber.
   14. Spülen Sie die exponierten Gehirn mit Kochsalzlösung mit einer Pipette geliefert um Infektionen zu verhindern und die Kopfhaut Naht.
   15. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Lassen Sie die Maus wieder aus der Narkose in einem Inkubator bei 30 ° c, in der Regel für 1 h. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Zurückzugeben Sie die Maus an die Gesellschaft anderer Tiere, nachdem es vollständig erholt hat.
   16. Halten Sie die Maus für 3 – 7 Tage.
2. Machen Sie Injektionen in den superior Colliculus Erwachsener Mäuse.
   1. Bereiten Sie eine Glaspipette mit einem Durchmesser von 30 – 50 µm.
   2. Verbinden Sie die Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr (Abbildung 2A).
   3. Füllen Sie die Glaspipette, Kunststoffrohr und Hamilton Spritze mit Paraffin Flüssigkeit.
   4. Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.
   5. Der Manipulator der Glaspipette aufsetzen und Kippen des Manipulators 60° nach hinten aus der vertikalen Achse (Abb. 2 b).
   6. Führen Sie 2.1.4–2.1.9. Die Position des Manipulators ist 1,4 mm posterior, 0,5 mm seitlich an den Lambda-Ausdruck.
   7. Legen Sie einen kleine Kunststoff-Paraffin-Film auf den Schädel, dann setzen Sie ca. 1 µL Tracer Lösung auf. Schnell die Glaspipette voraus und füllen Sie ihn mit mindestens 0,5 µL Tracer-Lösung.
   8. Fügen Sie die Glaspipette, sodass die Spitze Tiefe 3,0 mm von der Oberfläche des Gehirns ist.
   9. 0,5 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.
   10. Die Glaspipette aus dem Gehirn zu entfernen.
   11. Führen Sie 2.1.13–2.1.16.

(3) Fixierung und trimmen

1. Verleihen Sie Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal eine Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9, mit oder ohne die Tracer-Injektion wie in Schritt 2 beschrieben. Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.
2. Einschläfern der Maus menschlich von Vorrichtung die Maus Transcardially²⁰ mit 0,9 % Kochsalzlösung.
3. Fix die Maus²⁰ durch Vorrichtung 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5).
4. Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Schere, um den Schädel wie beschrieben²⁰verfügbar zu machen.
   1. Schneiden Sie die Mittellinie des freigelegten Schädel mit einer Schere. Entfernen Sie den Schädel mit Pinzette.
   2. Wenn markiert die Position des Bregma und Lambda notwendig ist, entfernen Sie zunächst eine Hemisphäre des Schädels. Legen Sie dünne Wolfram Nadeln in das Gehirn an den Stellen der Bregma und Lambda auf dem Schädel noch auf das Gehirn, dann entfernen Sie die restlichen Schädel.
      Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° c gespeichert werden.
5. Um durchzuführen Antikörper Färbung der hemmenden Neuronen, schneiden Sie die Gehirn-Muster in Scheiben.
   1. Legen Sie die Gehirn-Probe auf einem Vibratome.
   2. Scheiben Sie bis zu 500 µm Dicke mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Schritt 5 (AbScale-Methode).
6. Wenn Antikörper Färbung nicht erforderlich ist, trim zu Probe Gehirn blockiert (bis zu 3 mm dick) mit einer Rasierklinge (Abbildung 3) und fahren Sie mit Schritt 4 (SeeDB-Methode).
   Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° C nach dem Schneiden oder Trimmen gespeichert werden. Die SeeDB-Methode ist vorzuziehen, wenn Antikörper Färbung nicht notwendig ist, denn es weniger Zeit als die AbSca-l-e-Methode erfordert.

4. löschen ohne Antikörper Färbung (SeeDB Methode)

1. Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 40 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 60 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 100 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80,2 % (w/w) Fruktose enthält und 24 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
   Hinweis: Behandeln Sie die Probe sorgfältig, um Verformungen so gering wie möglich zu halten. Inkubieren Sie Proben länger als angegeben, nicht als Proben schnell undurchsichtig werden können.
7. Betten Sie die Probe in einer bildgebenden Kammer gefüllt mit 80,2 % Fructose-Lösung (Abbildung 1 b). Gegebenenfalls zu beheben die Probe indem man kleine Stücke von Kautschukkleber um. Wenn die Kammer zu tief ist, legen Sie eine Bodenplatte in der Kammer vor den Proben.
8. Die Petrischale mit einer Glasabdeckung auf der bildgebenden Kammer legen Sie und Wasser in die Schüssel und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit. Erregung Wellenlängen und Emission Filter sind in Tabelle 1beschrieben. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne.

(5) Clearing mit Antikörper Färbung (AbScale-Methode)

1. Bereiten Sie Reagenzien, wie in Tabelle 2beschrieben.
2. Übertragen Sie die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL des Sca/eS0 Lösung und inkubieren sie 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° C (Abbildung 4 b).
3. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 36 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren
4. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL Sca/eB4-Lösung und inkubieren die Scheiben für 24 h mit sanft schütteln bei 37 ° c
5. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren
6. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.
7. Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.
8. Brüten Sie mit Primärantikörpern (Tabelle 3) in 1 mL AbScale Lösung für 48-72 h bei 37 ° C (Abbildung 4) mit sanft schütteln.
9. Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 5 mL-kunststofftube mit einem Spatel.
10. Brüten Sie in 4 mL AbScale Lösung für 2 h 2 Mal bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.
11. Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.
12. Inkubieren Sie mit fluoreszent-markierten Sekundärantikörper (Table of Materials, 1: 100) in 1 mL AbScale Lösung für 48 h bei 37 ° C mit sanft schütteln.
13. Vorsichtig die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL der AbScale Lösung zu entfernen und die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
14. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL AbScale Lösung hinzugeben und die Scheiben für 2 h 2 Mal mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
15. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL 4 % PFA und die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
16. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.
17. Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL der Sca/eS4 Lösung hinzufügen und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren
18. Legen Sie das Distanzstück auf einen Glasobjektträger und legen Sie die Scheiben in der Abstandhalter und Tauchen Sie die Scheiben mit Sca/eS4 Lösung ein. Versiegeln Sie das Distanzstück mit einem Deckglas (Abbildung 1).
19. Das Deckglas und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit setzen Sie Wasser auf. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne.
    Hinweis: Überprüfen Sie, ob die tiefen Teile der Probe zu den oberflächlichen teilen, ohne eine deutliche Kennzeichnung Voreingenommenheit bestätigen ähnlich beschriftet werden.
    Hinweis: Die Durchdringung der getesteten Antikörper ist in Tabelle 3beschrieben.

6. Zelle Positionsbestimmung

1. Berechnen Sie für jede Position in den gescannten Bildern Korrelationswerte mithilfe ein dreidimensionales Bild Filter¹⁴ (Abb. 5A-5D).
2. Bestimmen der Gipfel der Korrelationswert (Abbildung 5).
3. Untersuchen Sie Bilder rund um die Gipfel, Zellen (Abb. 5E) zu finden.

Ergebnisse

Wir beschriftet kortikalen Projektion Neuronen durch Expression von TdTomato in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse und Sub-zerebrale Projektion Neuronen durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons visualisiert. Die linke Hemisphäre des Gehirns wurde an die SeeDB-Methode unterzogen und mit einem zwei-Photonen-Mikroskop verfügt über eine lange Distanz Ziel arbeiten Wasserlagerung gescannt (25 X, N.A. 1.1, Arbeitsabstand 2 mm) und einem motorisierten Stadiu...

Diskussion

Wir stellten Verfahren um großformatige dreidimensionale Bilder der Zelle Typ-spezifische Organisation der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 zu erhalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Slice Färbung, eignet sich die Methode bei der Bestimmung der dreidimensionalen Organisation des Neocortex. Die Methode ermöglicht die Bildaufnahme aus der breiteren und tieferen Hirnregionen im Vergleich zu den typischen in Vivo 2-Photonen-Mikroskopie oder konventionelle konfokale Mikroskopie und somit kön...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crym-egfp transgenic mice	MMRRC	012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice	MMRRC	36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX #7909
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-01	0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-02	1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-05	3.0 mm thickness
Petri dishes	Falcon	351008
Cover glass	Matsunami	C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate	Invitrogen	C34778
26 G Hamilton syringe	Hamilton	701N
Injector pump	KD Scientific	KDS 310	Pons injection
Injector pump	KD Scientific	KDS 100	Superior colliculus injection
Manipulator	Narishige	SM-15
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl
Isoflurane	Pfizer
Lidocaine	AstraZeneca	Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill	Toyo Associates	HP-200
Avitene microfibrillar hemostat	Davol Inc	1010090
Alonalfa	Daiichi-Sankyo	Alonalpha A
Surgical silk	Ethicon	K881H
Incubator	UVP	HB-1000 Hybridizer
Glass pipette	Drummond Scientific Company	2-000-075
Electrode puller	Sutter Instrument Company	P-97
Paraffin Liquid, light	Nacalai tesque	26132-35
Saline	Otsuka	1326
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	26126-54
Tungsten needle	Inter medical	Φ0.1 *L200 mm
Vibratome	Leica	VT1000S
50 mL plastic tube	Falcon	352070
α-thioglycerol	Nacalai tesque	33709-62
D(-) Fructose	Nacalai tesque	16315-55
BluTack	Bostik	CKBT-450000
Two-photon microscope	Nikon	A1RMP
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage	COMS	PT100C-50XY
Filter	Semrock	FF01-492/SP-25
Filter	Semrock	FF03-525/50-25
Filter	Semrock	FF03-575/25-25
Filter	Semrock	FF01-629/56
Filter	Chroma	D605/55m
5 mL plastic tube	AS ONE	VIO-5B
2 mL plastic tube	Eppendorf	0030120094
Urea	Nacalai tesque	35905-35
Triton X-100	Nacalai tesque	35501-15
Glyserol	Sigma-aldrich	191612
D(-)-sorbitol	Wako	191-14735
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo chemical industry	M1356
γ-Cyclodextrin	Wako	037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline	Skin Essential Actives	33996-33-7
DMSO	Nacalai tesque	13445-45
Bovine Serum Albumin	Sigma-aldrich	A7906
Tween-20 (1.1 g/mL)	Nacalai tesque	35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Water-immersion long working distance objectives	Olympus	XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN	Millipore	MAB377
Anti-NeuN	Millipore	ABN78
Anti-CTIP2	Abcam	ab18465
Anti-Statb2	Abcam	ab51502
Anti-GAD67	Millipore	MAB5406
Anti-GABA	Sigma	A2052
Anti-Parvalbumin	Swant	235
Anti-Parvalbumin	Frontier Institute	PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin	Sigma	P3088
Anti-Parvalbumin	Abcam	ab11427
Anti-Somatostatin	Peninsula Laboratories	T-4103
Anti-c-Fos	CalbioChem	PC38