Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Résumé

Le néocortex mammifère se compose de nombreux types de neurones excitateurs et inhibiteurs, chacune avec des propriétés électrophysiologiques et biochimiques spécifiques, les connexions synaptiques, et in vivo des fonctions, mais leur base anatomique et fonctionnelle Organisation de cellulaires à l’échelle du réseau est mal comprise. Nous décrivons ici une méthode pour l’imagerie en trois dimensions des neurones marqués fluorescent à travers de vastes zones du cerveau pour l’enquête de l’organisation cellulaire corticale. Certains types de neurones sont étiquetés par l’injection de traceurs fluorescents de neuronales rétrogrades ou l’expression de protéines fluorescentes chez les souris transgéniques. Bloc des échantillons de cerveau, par exemple, un hémisphère, préparés après fixation, rendues transparentes avec des méthodes de compensation des tissus et soumis d’immunomarquage fluorescent des types spécifiques de cellules. Grandes surfaces sont analysés à l’aide de microscopes confocaux ou deux photons équipés d’objectifs de distance de travail grand et platines motorisées. Cette méthode peut résoudre l’organisation périodique des modules fonctionnels spécifiques au type microcolonne cellulaire dans le néocortex de souris. La procédure peut être utile pour l’étude de l’architecture cellulaire tridimensionnelle dans les zones du cerveau différentes et d’autres tissus complexes.

Introduction

Le néocortex mammifère est composé d’un grand nombre de types de cellules, chacune avec les modèles d’expression de gènes spécifiques, les propriétés électrophysiologiques et biochimiques, les connexions synaptiques, et in vivo fonctionne^{1,2 ,3,4,5,6,7}. Si ces types de cellules sont organisés en structures répétées a été peu clair. Les colonnes corticales, y compris les colonnes de l’orientation visuelle et somatosensoriels barils, ont répété les structures, mais leur organisation cellulaire reste peu clair^8,9. Ceux-ci sont présents dans les zones corticales spécifiques et ne sont pas un système à l’échelle du cerveau.

Dans la couche néocorticale 5, la grande majorité des neurones est classée en quatre grandes catégories. Un type majeur des neurones excitateurs, neurones de projection Sub cérébrale, projette des axones vers des cibles sous-corticales incluant les pons, la moelle épinière et colliculus supérieur et, représente donc la sortie corticale importante voie¹⁰. Neurones de projection corticale, un autre principal type de neurones excitateurs, innervent le cortex¹⁰. Neurones inhibiteurs contiennent également deux grandes catégories : les cellules exprimant le parvalbumine et exprimant la somatostatine¹¹.

Des analyses récentes indiquent que les types de quatre cellules sont organisés en structures répétées^12,13,14. Neurones de projection cérébrale Sub^12,13,14 tant de neurones de projection corticale¹⁴ organisent en type cellulaire spécifique microcolumns avec un diamètre de 1 à 2 cellules. Les cellules exprimant le parvalbumine et exprimant la somatostatine alignent plus précisément microcolumns de neurones de projection Sub cérébrale mais pas avec microcolumns de neurones de projection corticale¹⁴. Microcolumns s’aligner régulièrement pour former un hexagonal tableau¹⁴ en treillis et sont présents dans plusieurs aires corticales, y compris les villes de visuels, somesthésiques et moteurs dans le cerveau de souris^12,14 et dans la langue zones du cerveau humain¹³. Neurones dans la microcolonne individuel montrent une activité synchronisée et ont des réponses sensorielles semblables¹⁴. Ces observations indiquent que les types de cellules couche 5 organisent en une structure en treillis microcolonne qui représente la première organisation à l’échelle du cerveau connue de répéter les modules fonctionnels.

Microcolumns ont un rayon d’environ 10 µm et ont une périodicité spatiale d’environ 40 µm. En outre, l’orientation des microcolumns est parallèle à leurs dendrites apicaux et change en fonction de leur position dans le cortex¹⁴. Le système de la microcolonne est donc difficile d’analyser à l’aide des tranches de cortex conventionnels avec une épaisseur typique de quelques dizaines de micromètres. En outre, exige que l’analyse de la périodicité des données tridimensionnelles d’un large éventail de régions du cerveau et, par conséquent, la zone d’imagerie typique de la microscopie confocale ou l’imagerie in vivo 2 photons est trop étroite.

Récemment, les techniques ont été développées pour effacer les tissus épais^15,16. Nous décrivons ici l’application de ces méthodes pour obtenir des images à grande échelle, en trois dimensions des types de grandes cellules en couche néocorticales souris 5 qui composent le système de la microcolonne. Neurones de projection subcerebral sont marqués par l’étiquetage rétrograde ou par l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée dans Crym-egfp souris transgéniques¹²et projection corticale neurones sont étiquetés par le rétrograde marquage ou par l’expression de tdTomato en Tlx3-cre/Ai9 souris¹⁷. Les cellules exprimant le parvalbumine et exprimant la somatostatine sont étiquetés par immunohistochimie. La méthode (anticorps échelle S) AbScale¹⁸ est utilisé pour l’anticorps coloration expériences, tandis que la méthode (voir Deep Brain) SeeDB¹⁹ est utilisé pour d’autres expériences. Ces méthodes de surmonter les difficultés susmentionnées des méthodes d’imagerie conventionnelles et révèlent l’organisation cellulaire précise de couche 5¹⁴.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par le Comité des expériences sur animaux RIKEN Wako et Comité de sécurité de Experiment RIKEN génétique recombiné et interprétés conformément aux directives institutionnelles des animaleries de la RIKEN Brain Science Institut.

1. préparation de l’imagerie Chambers

1. L’imagerie chambre¹⁹
   1. À partir de feuilles de caoutchouc de silicone, préparer une chambre avec une épaisseur d’environ 5 mm et le plancher des plaques de différentes épaisseurs. Également, préparer des boîtes de Pétri avec et sans un fond de verre (Figure 1 a).
2. Entretoise de tranche
   1. Préparer des entretoises pour contenir les échantillons, à l’aide de feuilles de caoutchouc de silicone d’une épaisseur de 0,5 mm (Figure 1).

2. Injection de traceur

Remarque : Faire des injections dans le colliculus supérieur (2.2) ou pons (2.1). Injection dans les neurones de projection cérébrale sous étiquette pons dans une région du cerveau large y compris les zones visuelles et motrices, tandis que de l’injection dans les neurones de projection cérébrale sous étiquettes colliculus supérieur dans l’aire visuelle. Pour des expériences de contrôle, injecter une solution saline au lieu de la sous-unité de toxine de choléra fluorescent marqué B. Pour le maintien de l’état stérile utilisent le matériel stérilisé et des gants en plastique, nettoyés avec de l’éthanol.

1. Faire des injections dans la protubérance de souris adultes.
   1. Dessiner 1 µL de sous-unité de toxine de choléra fluorescent marqué B (25 µg/µL dans du PBS) dans une seringue de Hamilton G 26.
   2. Placer une pompe d’injecteur sur la seringue.
   3. Placer la seringue et pompe sur le porte-outil d’un manipulateur placé sur un instrument stéréotaxique. Inclinez le manipulateur 12° vers l’arrière de l’axe vertical.
   4. Anesthésier une souris adulte mâle ou femelle (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9) par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (60 mg/kg de poids corporel) ou par l’administration d’isoflurane (2 – 3 %). Attendez que la souris n’apporte aucune réponse quand sa queue est pincée avec une pince, ce qui indique que la souris est complètement anesthésiée.
   5. Placez votre souris sur l’instrument stéréotaxique.
   6. Retirer délicatement les cheveux à l’aide d’une lame de rasoir pour prévenir l’infection et couper 10 mm du cuir chevelu afin que le bregma lambda sont visibles. Administrer 0,1 mL de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une pipette. Réglez l’angle de la tête en ajustant la position verticale de l’embout sur l’instrument stéréotaxique afin que le bregma et lambda ont le même niveau z.
   7. Ajustez la position du manipulateur en le glissant sur l’instrument stéréotaxique afin que l’embout de la seringue est proche du bregma et enregistrer la position du manipulateur. Retirer la seringue en déplaçant le porte-outil sur le manipulateur.
   8. Déplacez le manipulateur 5,4 mm vers l’arrière et 0,4 mm latéralement. La seringue à l’avance afin que la pointe se trouve à proximité du point d’entrée sur le crâne. Retirer la seringue et marquer le point d’entrée.
   9. À l’emplacement marqué, percer un trou d’un diamètre d’environ 1 mm.
   10. Insérer l’embout de la seringue dans le trou de sorte que la profondeur de la pointe est 6,9 mm de plus que celle mesurée à la bregma.
   11. Injecter 1 µL de traceurs à l’aide de la pompe à 0.2 µL/min.
   12. Retirer la seringue du cerveau.
   13. Si nécessaire, couvrir le cerveau exposé avec de petits fragments de pince hémostatique microfibrillaire et adhésif instantané.
   14. Rincez le cerveau exposé à l’aide de sérum physiologique livré avec une pipette pour prévenir l’infection et la suture du cuir chevelu.
   15. Retirer la souris de l’instrument stéréotaxique. Laissez la souris récupérer de l’anesthésie dans un incubateur à 30 ° c, généralement pendant 1 h. N’abandonnez pas la souris jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Retourner la souris à la compagnie d’autres animaux après que elle a entièrement récupéré.
   16. Maintenir la souris pendant 3 à 7 jours.
2. Faire des injections dans le colliculus supérieur de souris adultes.
   1. Préparer une pipette en verre avec un diamètre de 30 – 50 µm.
   2. Se connecter à la pipette de verre à une seringue de Hamilton à travers un tube en plastique (Figure 2 a).
   3. Remplir la pipette en verre, tube en plastique et Hamilton seringue avec le liquide de la paraffine.
   4. Placer une pompe d’injecteur sur la seringue.
   5. Placez la pipette de verre sur le manipulateur et inclinez le manipulateur 60° vers l’arrière de l’axe vertical (Figure 2 b).
   6. Exécuter 2.1.4–2.1.9. La position du manipulateur est postérieure, 1,4 mm 0,5 mm latéral à la lambda.
   7. Placer un film de paraffine en plastique petit sur le crâne, puis mettre environ 1 µL de la solution de traceur là-dessus. Rapidement progresser la pipette en verre et le remplir avec au moins 0,5 µL de la solution de traceur.
   8. Insérer la pipette de verre pour que la profondeur de la pointe est de 3,0 mm de la surface du cerveau.
   9. Injecter 0,5 µL de traceurs à l’aide de la pompe à 0.2 µL/min.
   10. Retirez la pipette de verre du cerveau.
   11. Exécuter 2.1.13–2.1.16.

3. fixation et coupe

1. Injecter par voie intrapéritonéale pentobarbital sodique (60 mg/kg de poids corporel) une souris (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9, avec ou sans l’injection de traceurs tel que décrit à l’étape 2. Attendez que la souris n’apporte aucune réponse quand sa queue est pincée avec une pince, ce qui indique que la souris est complètement anesthésiée.
2. Euthanasier la souris sans cruauté en perfusant la souris transcardially²⁰ avec la solution saline à 0,9 %.
3. Corriger la souris²⁰ en perfusant la paraformaldéhyde (PFA) de 4 % dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7.5).
4. Couper le cuir chevelu à l’aide d’une paire de ciseaux pour exposer le crâne comme décrit²⁰.
   1. Couper la ligne médiane du crâne exposé à l’aide d’une paire de ciseaux. Retirez le crâne avec une pincette.
   2. S’il est nécessaire de marquer la position du bregma et lambda, retirez d’abord un hémisphère du crâne. Insérer les aiguilles minces tungstène dans le cerveau aux positions du bregma et lambda sur le crâne restant sur le cerveau, puis retirez le crâne restant.
      Remarque : Le cerveau peut être stocké dans du PBS à 4 ° c.
5. Pour effectuer la souillure d’anticorps de neurones inhibiteurs, couper les échantillons de cerveau en tranches.
   1. Placer l’échantillon de cerveau sur un vibratome.
   2. Couper en tranches jusqu'à 500 µm d’épaisseur dans du PBS à température ambiante et passez à l’étape 5 (la méthode AbScale).
6. Si l’anticorps n’est pas nécessaire, découper l’échantillon de cerveau à bloque (jusqu'à 3 mm d’épaisseur) à l’aide d’une lame de rasoir (Figure 3) et passez à l’étape 4 (méthode SeeDB).
   Remarque : Le cerveau peut être stocké dans du PBS à 4 ° C après la coupe ou la tondeuse. La méthode de SeeDB est préférable lorsque l’anticorps n’est pas nécessaire car elle nécessite moins de temps que la méthode de e AbScal.

4. compensation sans anticorps coloration (méthode SeeDB)

1. Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 20 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 4 h avec agitant doucement à température ambiante.
2. Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 40 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 4 h avec agitant doucement à température ambiante.
3. Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 60 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 4 h avec agitant doucement à température ambiante.
4. Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 80 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 12 heures avec agitant doucement à température ambiante.
5. Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de α-thioglycérol de 0,5 % et 100 % (p/v) de fructose et il incuber pendant 12 heures avec agitant doucement à température ambiante.
6. Transférer l’échantillon à l’aide d’une spatule pour un tube en plastique de 50 mL contenant 20 mL de 0,5 % α-thioglycérol et de 80,2 % (p/p) fructose et il incuber pendant 24 h avec agitant doucement à température ambiante.
   NOTE : Manipuler l’échantillon avec précaution pour garder les déformations aussi petit que possible. Pas Incuber les échantillons est retardee, comme échantillons peuvent rapidement devenir opaques.
7. Incorporer l’échantillon dans une chambre d’imagerie remplie de la solution de fructose de 80,2 % (Figure 1 b). Si nécessaire, fixez l’exemple en mettant des petits morceaux d’adhésif de caoutchouc autour. Si la chambre est trop profonde, mettre une plaque de sol dans la chambre avant de placer les échantillons.
8. Placez la boîte de Pétri avec un couvercle en verre sur la chambre d’imagerie et mettre de l’eau dans le plat et l’image à l’aide de la microscopie confocale ou deux photons avec une immersion en eau long objectif de distance de travail. Longueurs d’onde excitation et filtres d’émission sont décrites dans le tableau 1. Si nécessaire, utilisez une platine motorisée.

5. compensation avec anticorps coloration (AbScale méthode)

1. Préparer des réactifs comme décrit dans le tableau 2.
2. Transférer les tranches à l’aide d’une spatule dans un tube en plastique de 5 mL contenant 4 mL de solution de Sca/eS0 et les incuber pendant 12 h avec agitation douce à 37 ° C (Figure 4 b).
3. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de solution de Sca/eA2 et incuber les tranches pendant 36 h avec agitant doucement à 37 ° C.
4. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de solution de Sca/eB4 et incuber les tranches pendant 24 h avec agitant doucement à 37 ° C.
5. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de solution de Sca/eA2 et incuber les tranches pendant 12 h avec agitation douce à 37 ° C.
6. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de PBS et incuber les tranches pendant 6 h avec agitant doucement à température ambiante.
7. Retirer délicatement les tranches dans un tube en plastique de 2 mL à l’aide d’une spatule.
8. Incuber les anticorps primaire (tableau 3) dans 1 mL de solution d’AbScale pendant 48 à 72 h à 37 ° C (Figure 4) avec agitant doucement.
9. Retirer délicatement les tranches pour un tube de plastique de 5 mL à l’aide d’une spatule.
10. Incuber dans 4 mL de solution d’AbScale 2 h 2 fois à température ambiante avec agitant doucement.
11. Retirer délicatement les tranches dans un tube en plastique de 2 mL à l’aide d’une spatule.
12. Incubez avec anticorps secondaires marqués fluorescent (Table des matières, 1/100) dans 1 mL de solution d’AbScale pendant 48 h à 37 ° C sous agitation douce.
13. Retirez les tranches à l’aide d’une spatule pour un tube de plastique de 5 mL contenant 4 mL de la solution de elAbSca délicatement et incuber les tranches pendant 6 h avec agitant doucement à température ambiante.
14. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de la solution de elAbSca et incuber les tranches pendant 2 h 2 fois avec agitant doucement à température ambiante.
15. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette et ajouter 4 mL de 4 % PFA et incuber les tranches pendant 1 h avec agitant doucement à température ambiante.
16. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de PBS et incuber les tranches pendant 1 h avec agitant doucement à température ambiante.
17. Retirer la solution du tube à l’aide d’une pipette, ajouter 4 mL de la solution de Sca/eS4 et incuber les tranches pendant 12 h avec agitation douce à 37 ° C.
18. Placez la cale sur une lame de verre et placer les tranches dans l’entretoise et plonger les tranches avec Sca/eS4 solution. Sceller l’entretoise avec une lamelle couvre-objet (Figure 1).
19. Mettre de l’eau sur la lamelle couvre-objet et l’image à l’aide de la microscopie confocale ou deux photons avec une immersion en eau long objectif de distance de travail. Si nécessaire, utilisez une platine motorisée.
    Remarque : Vérifiez si les parties profondes de l’échantillon sont étiquetés de la même façon sur les parties superficielles à confirmer l’absence d’un biais important d’étiquetage.
    Remarque : La pénétration des anticorps testés est décrit dans le tableau 3.

6. cellule détermination de Position

1. Pour chaque poste dans les images scannées, calculer les valeurs de corrélation à l’aide d’une image en trois dimensions filtre¹⁴ (Figure 5 a-5D).
2. Déterminer les positions des sommets de la valeur de corrélation (Figure 5).
3. Examinez les images autour des sommets de localiser les cellules (Figure 5E).

Résultats

Nous marqué des neurones de projection corticale par l’expression de tdTomato dans Tlx3-cre/Ai9 souris transgéniques et visualisé des neurones de projection cérébrale secondaire par l’injection du traceur rétrograde CTB488 dans la protubérance. L’hémisphère gauche du cerveau était soumis à la méthode SeeDB et analysés à l’aide d’un microscope biphotonique avec une immersion en eau long objectif de distance de travail (25 X, N.A. 1,1, distance de t...

Discussion

Nous avons présenté les procédures pour obtenir des images en trois dimensions à grande échelle de l’organisation spécifique du type de cellule des types de grandes cellules en couche néocorticales souris 5. Par rapport à la coloration de la tranche conventionnelle, la méthode est plus utile dans la détermination de l’organisation en trois dimensions du néocortex. La méthode permet l’acquisition d’images de la plus large et les régions plus profondes du cerveau par rapport à la typique en vivo

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crym-egfp transgenic mice	MMRRC	012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice	MMRRC	36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX #7909
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-01	0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-02	1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet	AS ONE	6-611-05	3.0 mm thickness
Petri dishes	Falcon	351008
Cover glass	Matsunami	C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate	Invitrogen	C34778
26 G Hamilton syringe	Hamilton	701N
Injector pump	KD Scientific	KDS 310	Pons injection
Injector pump	KD Scientific	KDS 100	Superior colliculus injection
Manipulator	Narishige	SM-15
Sodium pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl
Isoflurane	Pfizer
Lidocaine	AstraZeneca	Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill	Toyo Associates	HP-200
Avitene microfibrillar hemostat	Davol Inc	1010090
Alonalfa	Daiichi-Sankyo	Alonalpha A
Surgical silk	Ethicon	K881H
Incubator	UVP	HB-1000 Hybridizer
Glass pipette	Drummond Scientific Company	2-000-075
Electrode puller	Sutter Instrument Company	P-97
Paraffin Liquid, light	Nacalai tesque	26132-35
Saline	Otsuka	1326
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	26126-54
Tungsten needle	Inter medical	Φ0.1 *L200 mm
Vibratome	Leica	VT1000S
50 mL plastic tube	Falcon	352070
α-thioglycerol	Nacalai tesque	33709-62
D(-) Fructose	Nacalai tesque	16315-55
BluTack	Bostik	CKBT-450000
Two-photon microscope	Nikon	A1RMP
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives	Nikon	CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage	COMS	PT100C-50XY
Filter	Semrock	FF01-492/SP-25
Filter	Semrock	FF03-525/50-25
Filter	Semrock	FF03-575/25-25
Filter	Semrock	FF01-629/56
Filter	Chroma	D605/55m
5 mL plastic tube	AS ONE	VIO-5B
2 mL plastic tube	Eppendorf	0030120094
Urea	Nacalai tesque	35905-35
Triton X-100	Nacalai tesque	35501-15
Glyserol	Sigma-aldrich	191612
D(-)-sorbitol	Wako	191-14735
Methyl-β-cyclodextrin	Tokyo chemical industry	M1356
γ-Cyclodextrin	Wako	037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline	Skin Essential Actives	33996-33-7
DMSO	Nacalai tesque	13445-45
Bovine Serum Albumin	Sigma-aldrich	A7906
Tween-20 (1.1 g/mL)	Nacalai tesque	35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Water-immersion long working distance objectives	Olympus	XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN	Millipore	MAB377
Anti-NeuN	Millipore	ABN78
Anti-CTIP2	Abcam	ab18465
Anti-Statb2	Abcam	ab51502
Anti-GAD67	Millipore	MAB5406
Anti-GABA	Sigma	A2052
Anti-Parvalbumin	Swant	235
Anti-Parvalbumin	Frontier Institute	PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin	Sigma	P3088
Anti-Parvalbumin	Abcam	ab11427
Anti-Somatostatin	Peninsula Laboratories	T-4103
Anti-c-Fos	CalbioChem	PC38