Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Resumen

Aquí, describimos un protocolo detallado que un fluorescente nuevo coloración técnica para la detección de la proteína total en geles de poliacrilamida. El protocolo utiliza una sonda de encendido plata de iones específicos de fluorescencia que detecta Ag⁺-complejos de proteínas y elimina ciertas limitaciones de manchas plata cromogénicos tradicionales.

Resumen

Tinción de plata es una técnica colorimétrica ampliamente utilizada para visualizar las bandas de proteínas en geles de poliacrilamida siguiendo la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE). Las manchas de plata clásico tienen ciertos inconvenientes, como fondo alta coloración, recuperación de proteína pobre, baja reproducibilidad, un estrecho rango dinámico lineal de cuantificación y la compatibilidad limitada con espectrometría de masas (MS). Ahora, con el uso de una sonda de Ag⁺ fluorógenos, TPE-4TA, hemos desarrollado un método para la visualización total de proteínas en geles de poliacrilamida de tinción de plata fluorescente. Esta nueva mancha evita el paso de reducción plata molestas manchas de plata tradicional. Además, la tinción fluorescente de plata demuestra buena reproducibilidad, sensibilidad y cuantificación lineal de detección de la proteína, lo que es una mancha de gel de proteína útil y práctico.

Introducción

Muchos métodos de tinción han sido usados para visualizar proteínas después de electroforesis en gel, por ejemplo utilizando colorimétricos colorantes como el azul brillante de Coomassie, tinción de plata, fluorescencia, o radiactivo etiquetado^{1,2, 3 , 4}. plata es considerada como una de las técnicas más sensibles para la detección de proteínas que requieren reactivos simples y baratos. Pueden ser categorizado en dos grandes familias: la mancha de plata amoniacal y el nitrato de plata manchan^5,6. En el método alcalino de plata amoniacal, el complejo diamina de plata se produce con amoníaco e hidróxido de sodio y reducido a plata metálica durante el desarrollo de una solución de formaldehído ácidas. La mancha acomoda eficientemente las proteínas básicas pero muestra una actuación comprometida para las proteínas ácidas y neutras y es, además, se limita a sistemas electroforéticos taurina y glicina clásica. En comparación, las manchas de nitrato de plata aprovechen la alta bio-afinidad de los iones de plata a la proteína, principalmente el sulfidrilo carboxyl grupos de las cadenas laterales y tienden a manchar más eficientemente las proteínas ácidas⁷. Después de la Unión de iones de plata, una solución en desarrollo (normalmente hecha de una solución de carbonato de metal que contiene formaldehído y sodio tiosulfato) se aplica para reducir los iones de plata a los granos de plata metálicos, que se acumulan de un color marrón-oscuro para visualizar la bandas de proteínas.

Aunque plata ha sido conocido por su versatilidad y su alta sensibilidad desde su desarrollo en la década de 1970⁸, el método es con frecuencia considerado complicado. Métodos de tinción de plata tienen pasos restringidos por el tiempo y demuestran la baja reproducibilidad. Puesto que el color de plata generalmente no es uniforme y depende de la etapa de reducción, que es difícil de controlar, la tinción de plata no es un método cuantitativo y, por lo tanto, no se recomienda para gel comparación estudio y proteína cuantificación⁹. Métodos optimizados de sensibilidad pueden utilizar aldehídos que también pueden proporcionar un más uniforme coloración¹⁰. Sin embargo, esto es a expensas de posteriores análisis por el entrecruzamiento de proteínas por aldehídos. Protocolos rápidos sobre todo combinaran o acortan pasos para reducir tiempo, comprometer la reproducibilidad y la uniformidad de la mancha⁵. Como resultado, hay numerosas plata tinción variantes en gel proteína coloración, cada uno optimizado para adaptarse a ciertos requisitos; por ejemplo, sencillez, sensibilidad o péptido tasa de recuperación para el análisis de aguas abajo. Estos atributos también pueden tener un impacto sobre otros, y satisfacer todos los requisitos de un protocolo puede ser difícil.

En este trabajo, presentamos un nuevo método para la detección de proteínas en geles de poliacrilamida de tinción de plata fluorescente. En este método, utilizamos una sonda fluorógenos para iones de plata, TPE-4TA (figura 1), para visualizar las proteínas impregnado de plata¹¹. TPE-4TA es diseñada por el principio de emisión inducida por la agregación (AIE). Es no emisivo cuando está disuelto en solución acuosa, pero es altamente emisiva en presencia de iones de plata. Sustituyendo el desarrollo cromogénico en manchas de plata tradicionales con un fluorógenos desarrollo de paso, el método plata fluorescente permite la tinción robusto de proteínas totales con un fondo reducido.

Además, la mancha de plata fluorescente demostró una buena gama dinámica lineal para la cuantificación de la proteína, que es comparable con la tinción SYPRO Ruby ampliamente utilizado y no alcanzables con manchas de plata tradicionales. El gel puede ser reflejado en el gel comúnmente usado sistemas de documentación con una lámpara ultravioleta (longitud de onda de excitación: canal de 302/365 nm, emisión: ~ 490-530 nm) en muchos laboratorios biológicos.

Protocolo

1. preparación del Gel

Nota: La demostración sigue un protocolo estándar para preparar el gel para manchas poco después de SDS-PAGE¹². En Resumen, los pasos siguientes describen la preparación de las muestras y electrophoresis del gel.

1. Realizar SDS-PAGE con geles de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 m m, 15-bien) usando un gel mini tanque lleno con 2-(N -morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido tampón de ácido (MES).
2. Diluir las muestras con una mezcla de agua destilada, litio dodecil sulfato (LDS) tampón y un agente de reducción de muestra.
3. Carga el primer carril con el doble de acción (10 μl), seguido de la cantidad normal de stock (5 μl) y una serie de diluciones del doble de la acción después de eso (13 diluciones, de 2 x para x 8192).
4. Correr el gel a una tensión constante de 200 V durante 30 minutos.

2. fijación del Gel

1. Después de la electroforesis, sumergir los geles en una solución de 100 mL de ácido acético al 40% ethanol/10% en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente 2 x (cada uno por 30 min), o durante la noche a 4 ° C.
2. Lave los geles 3 x 10 min cada uno en agua ultrapura en un recipiente limpio. El paso de lavado es fundamental. Si el ácido de la solución de fijación no se quita correctamente en el paso en desarrollo fluorógenos, la excesiva TPE-4TA será activada por el ácido y llevar a la fluorescencia de fondo fuerte en el gel.

3. preparación del AgNO₃solución e impregnación de plata del Gel

1. Para hacer la solución de₃ AgNO (0,0001%) para la impregnación, en primer lugar, disolver 0.01 g de AgNO₃ en 10 mL de agua ultrapura para preparar una solución 0,1% AgNO₃ . A continuación, añada 100 μl de la solución 0.1% AgNO₃ en 100 mL de agua ultrapura para la solución de trabajo.
   Nota: La solución de AgNO₃ debe almacenarse en la oscuridad antes de su uso.
2. Impregnar el gel con 100 mL de solución para 1 h de trabajo en un agitador orbital a 50 rpm en un recipiente de vidrio sellado de plata. Es fundamental realizar la impregnación de plata debajo de una campana de humos, protegida de la luz con papel de aluminio.
3. Lavar el gel con agua ultrapura (aproximadamente 100 mL) en un recipiente limpio de 2 x 60 s.

4. fluorógenos desarrollo del Gel

1. Para preparar la solución colorante (0,1 mM), agregar 3.0 mg de colorante TPE-4TA en 50 mL de agua ultrapura. Someter a ultrasonidos la solución durante unos minutos y añadir una solución de NaOH (por ejemplo 1 M) para ayudar a disolver el tinte.
2. Comprobar la fluorescencia de la solución bajo una lámpara de nm UV 365 para asegurarse de que la molécula del colorante se haya disuelto completamente. Sólo soluciones débiles o nonemissive indican disolución completa.
   Nota: El tinte que TPE-4TA fue sintetizado el protocolo recientemente notificado por Xie et al. ¹⁰ la solución TPE-4TA es muy estable y puede conservarse en la oscuridad durante meses.
3. Para preparar 100 mL de la solución en desarrollo fluorógenos (10 μm), añadir 10 mL de la solución madre de TPE-4TA en 90 mL de agua ultrapura. Compruebe el pH de la solución usando un medidor de pH y ajustar a 7-9 usando una solución de hidróxido de sodio (1 μm).
4. Transferir el gel a un recipiente limpio y sellable con 100 mL de la solución en desarrollo fluorógenos. Asegúrese de que el gel se sumergen totalmente en la solución. Sellar el recipiente. Cubierta de la luz y agitar durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente. Como alternativa, el paso de incubación puede también reducirse a unos ~ 2 h por precalentar la solución en desarrollo de la AIE a 80 ° C para la coloración y luego dejarlo a temperatura ambiente.

5. extracción y proyección de imagen

1. Transferir el gel a un recipiente limpio y desmanchar en 100 mL de etanol al 10% durante 30 minutos.
   Nota: El agua sola puede utilizarse para lavar el gel. Sin embargo, es más eficiente utilizar una solución de etanol del 10% para la extracción. Esto ayudará a reducir el proceso de extracción de horas a 30 minutos.
2. Enjuagar el gel en agua ultrapura durante 5 minutos.
3. Imagen del gel en los 365 nm o 302 canales de nm por un equipo de documentación de gel.

Resultados

Las bandas de proteínas teñidas por el tinte plata fluorescente presentan una intensa fluorescencia verde bajo una lámpara de UV 365 nm. Todas las bandas de proteína 14 (10-200 kDa), de arriba hacia abajo, eran claramente visibles, correlacionan bien con los 14 color rojo teñido por el tinte (figura 2) SYPRO Ruby del¹⁰.

Detección cuantitativa de la proteína, los geles ...

Discusión

Presentada aquí es una novela plata fluorescente tinción de proteínas en geles de poliacrilamida. Esta estrategia integra fluorescentes manchas y manchas de plata convencionales. Las hazañas de tinción la Unión selectiva de iones de plata a las proteínas como en otros plata manchas pero emplea una plata muy sensible fluorógenos sondeo TPE-4TA para iluminar las proteínas límite plata. Puesto que la sonda fluorógenos TPE-4TA puede detectar iones de plata en una concentración ba...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	-	Equipment