Fluorescent coloration à l’argent des protéines dans les Gels de Polyacrylamide

Résumé

Nous décrivons ici un protocole détaillé décrivant un fluorescent nouvelle coloration pour la détection de protéines totales dans les gels de polyacrylamide. Le protocole utilise une sonde de turn-on argent ionique spécifique fluorescence, qui permet de détecter Ag⁺-complexes de protéine et élimine certaines limitations des taches argent chromogène traditionnels.

Résumé

Coloration à l’argent est une technique colorimétrique largement utilisée pour visualiser les bandes de protéines dans les gels de polyacrylamide après électrophorèse sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE). Les taches argent classiques ont certains inconvénients, comme le haut fond de coloration, de recouvrement de mauvaises protéines, faible reproductibilité, une gamme dynamique linéaire étroite pour la quantification et une compatibilité limitée avec la spectrométrie de masse (MS). Maintenant, avec l’utilisation d’une sonde de fluorogène Ag⁺ , TPE-4TA, nous avons développé une coloration méthode pour la visualisation de protéines totales dans les gels de polyacrylamide fluorescent à l’argent. Cette nouvelle tache évite l’étape pénible réduction argent en taches argent traditionnels. En outre, la tache argentée fluorescente montre bonne reproductibilité, une sensibilité et une quantification linéaire dans la détection de protéines, ce qui en fait une tache de gel de protéines utiles et pratiques.

Introduction

Plusieurs méthodes de coloration ont été utilisées pour visualiser les protéines après électrophorèse sur gel, par exemple à l’aide de colorants colorimétriques tels que le bleu de Coomassie brillant bleu, tache argentée, fluorescence, ou radioactifs étiquetage^{1,2, 3 , 4}. coloration à l’argent est considérée comme une des techniques plus sensibles pour la détection de protéines nécessitant des réactifs simples et bon marchés. Il peut être classé en deux grandes familles : la tache d’argent ammoniacale et le nitrate d’argent tachent^5,6. Dans la méthode argentée ammoniacale alcaline, le complexe de l’argent-diamine est produit avec l’ammoniac et de l’hydroxyde de sodium et réduit à argent métallique au cours du développement à l’aide d’une solution de formaldéhyde acides. La tache peut accueillir efficacement pour les protéines basiques mais montre un compromis performances pour les protéines acides et neutres et est en outre limité à classique glycine et taurine systèmes électrophorétiques. En comparaison, les taches de nitrate d’argent a exploiter la bio-affinité élevée d’ions d’argent aux protéines, principalement les sulfhydryles carboxyle groupes de chaînes latérales et ont tendance à tacher les protéines acides plus efficacement⁷. Après ion argent contraignant, une solution en développement (généralement en une solution de carbonate de métal contenant du thiosulfate de sodium et de formaldéhyde) est appliquée afin de réduire les ions d’argent aux grains d’argent métalliques, qui s’accumulent d’une couleur brun-foncé à visualiser la bandes de protéines.

Bien que la coloration à l’argent est bien connue pour sa polyvalence et sa sensibilité élevée depuis son développement dans les années 1970⁸, la méthode est souvent considérée comme difficile. Méthodes de coloration à l’argent ont des mesures limitées dans le temps et montrent faible reproductibilité. Étant donné que la couleur de la tache argentée n’est généralement pas uniforme et dépend de l’étape de réduction, ce qui est difficile à contrôler, la tache argentée n’est pas une méthode quantitative et, ainsi, pas recommandé pour gel comparaison étude et protéine quantification⁹. Méthodes optimisées de sensibilité peuvent utiliser des aldéhydes peuvent également indiquer un uniforme plus coloration¹⁰. Cependant, c’est au détriment d’une analyse plus poussée en aval en raison de la réticulation des protéines par des aldéhydes. Protocoles rapides surtout combinent ou raccourcir des étapes pour réduire le temps, compromettre la reproductibilité et l’uniformité de la tache⁵. En conséquence, il y a nombreux argent souillant des variantes à l’intérieur de gel de protéine, coloration, chacun optimisé pour répondre à certaines exigences ; par exemple, simplicité, sensibilité ou peptide taux de récupération pour l’analyse en aval. Ces attributs peuvent également avoir une incidence sur l’autre, et satisfaire toutes les exigences dans un seul protocole peut s’avérer difficile.

Dans ce travail, nous introduisons une nouvelle méthode pour la détection des protéines en gel de polyacrylamide de coloration à l’argent fluorescent. Dans cette méthode, nous utilisons une sonde fluorogène d’ions d’argent, TPE-4TA (Figure 1), pour visualiser les protéines imprégnées d’argent¹¹. TPE-4TA est conçu selon le principe de l’émission induite par l’agrégation (AIE). Il est non-émissif dissous dans une solution aqueuse, mais est fortement émissif en présence d’ions d’argent. En remplaçant le développement chromogène en taches argent traditionnels par un fluorogène développer étape, la méthode argentée fluorescente permet la coloration robuste des protéines totales avec une formation réduite.

En outre, la tache argentée fluorescente a montré une bonne gamme dynamique linéaire pour la quantification des protéines, qui est comparable avec la tache de SYPRO Ruby largement utilisé et non réalisable avec des taches argent traditionnels. Le gel peut être photographié sur les systèmes de documentation gel couramment utilisés avec une lampe ultraviolette (longueur d’onde excitation : canal de 302/365 nm ; émission : ~ 490-530 nm) à plusieurs laboratoires de biologie.

Protocole

1. préparation du Gel

Remarque : La démonstration suit un protocole standard utilisé pour préparer le gel pour une coloration peu après SDS-PAGE¹². En bref, les étapes suivantes décrivent la préparation des échantillons et électrophorèse sur gel.

1. Effectuer des SDS-PAGE avec des gels de protéines de Bis-Tris (1 mm, 15 puits) 4-12 % à l’aide d’un gel mini réservoir rempli de 2-(N -morpholino) tampon d’ethanesulfonic acide (MES).
2. Diluer les échantillons avec un mélange d’eau distillée, au lithium dodécyl sulfate (LDS) tampon et un agent réducteur échantillon.
3. Charger la première voie avec double la quantité de brut (10 µL), suivie de la quantité normale de stock (5 µL) et une série de dilutions de double du stock par la suite (13 dilutions, de 2 x à x 8192).
4. Exécutez le gel à une tension constante de 200 V pendant 30 min.

2. fixation du Gel

1. Après électrophorèse, submerger les gels dans une solution de 100 mL d’acide acétique ethanol/10% à 40 % dans un agitateur orbital à 50 tr/min à température ambiante 2 x (chacune pendant 30 min) ou toute la nuit à 4 ° C.
2. Laver les gels 3 x 10 min chacun dans l’eau ultrapure dans un récipient propre. L’étape de lavage est essentielle. Si l’acide de la solution de fixation n’est pas supprimé correctement lors de l’étape de développement fluorogène, l' excessive TPE-4TA sera activé par l’acide et conduire à fluorescence de fond fort dans le gel.

3. préparation du AgNO₃Solution et imprégnation à l’argent du Gel

1. Pour que la solution de₃ AgNO (0,0001 %) pour l’imprégnation, tout d’abord, dissoudre 0,01 g de AgNO₃ dans 10 mL d’eau ultrapure à préparer une solution 0,1 % AgNO₃ . Ensuite, ajouter 100 µL de la solution mère de 0,1 % AgNO₃ dans 100 mL d’eau ultrapure pour faire la solution de travail.
   Remarque : La solution de₃ AgNO devrait être conservée dans l’obscurité avant utilisation.
2. Imprégner le gel avec 100 mL d’argent solution pendant 1 h de travail dans un agitateur orbital à 50 tr/min dans un récipient de verre scellé. Il est essentiel d’effectuer l’imprégnation à l’argent sous une hotte aspirante, Abrie de la lumière avec du papier aluminium.
3. Laver le gel avec de l’eau ultrapure (environ 100 mL) dans un récipient propre pour 2 x 60 s.

4. Fluorogène développement du Gel

1. Pour préparer la solution mère de colorant (0,1 mM), ajouter 3,0 mg de teinture TPE-4TA dans 50 mL d’eau ultrapure. Laisser agir la solution pendant quelques minutes et ajouter une solution de NaOH (par exemple 1 M) pour aider à dissoudre le colorant.
2. Vérifier la fluorescence de la solution sous une lampe de 365 nm UV pour s’assurer que la molécule de colorant est entièrement dissous. Des solutions faibles ou causées indiquent seulement une dissolution complète.
   Remarque : Le colorant que TPE-4TA a été synthétisé suit le protocole rapporté récemment par Xie et al. ¹⁰ la solution TPE-4TA est très stable et peut être conservée à l’obscurité pendant des mois.
3. Pour préparer 100 mL de la solution en développement fluorogène (10 µM), ajouter 10 mL de la solution mère de TPE-4TA dans 90 mL d’eau ultrapure. Vérifier le pH de la solution à l’aide d’un pH-mètre et accordez-la à 7-9 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (1 µM).
4. Transférer le gel dans un récipient propre et scellable avec 100 mL de la solution en développement fluorogène. Assurez-vous que le gel est totalement immergé dans la solution. Sceller le contenant. Couvrez-le de la lumière et le secouer pendant la nuit dans un agitateur orbital à 50 tr/min à température ambiante. Alternativement, l’étape d’incubation peut également être raccourcie à environ ~ 2 h en préchauffant la solution en développement AIE à 80 ° C pour la coloration et puis en le laissant à température ambiante.

5. de décoloration et d’imagerie

1. Transférer le gel dans un récipient propre et décolorer il dans 100 mL d’éthanol à 10 % pendant 30 min.
   Remarque : L’eau seule peut être utilisée pour laver le gel. Toutefois, il est plus économe en temps d’utiliser une solution d’éthanol de 10 % pour la décoloration. Cela aidera à réduire le processus de décoloration de heures à 30 min.
2. Rincer le gel en eau ultrapure pendant 5 min.
3. Le gel à la 365 nm ou 302 nm canaux grâce à une machine de documentation de gel de l’image.

Résultats

Les bandes de protéines colorées par la tache argentée fluorescente présentent une fluorescence vert intense sous une lampe à UV 365 nm. Toutes les bandes de protéines 14 (10-200 kDa), de haut en bas, étaient clairement visibles, en corrélant bien avec 14 ceux rouge taché par le SYPRO Ruby colorant (Figure 2)¹⁰.

Concernant la détection de protéines quantitative, le...

Discussion

Présenté ici est un roman d’argent fluorescent coloration PROCEDE de protéines dans les gels de polyacrylamide. Cette stratégie intègre les taches argent classiques et taches fluorescentes. Les exploits de coloration la liaison sélective d’ions d’argent aux protéines comme dans l’autre argent taches mais emploie un argent fluorogène hautement sensible sonde TPE-4TA pour éclairer les protéines liées argent. Étant donné que la sonde fluorogène TPE-4TA peut détecter d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	-	Equipment