Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag⁺-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.

Resumo

Coloração prata é uma técnica colorimétrica amplamente usada para visualizar bandas de proteínas em gel de poliacrilamida após eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE). As manchas de prata clássicas tem alguns inconvenientes, tais como o fundo elevado, coloração, recuperação de proteína pobre, baixa reprodutibilidade, uma estreita faixa dinâmica linear para quantificação e compatibilidade limitada com espectrometria de massa (MS). Agora, com o uso de uma sonda de fluorogenic Ag⁺ , TPE-4TA, desenvolvemos uma fluorescente prata coloração método para a visualização de proteínas totais em gel de poliacrilamida. Esta mancha nova evita a etapa de redução de prata problemático em manchas de prata tradicionais. Além disso, a mancha de prata fluorescente demonstra boa reprodutibilidade, sensibilidade e quantificação linear na detecção de proteínas, tornando-se uma mancha de gel de proteína útil e prático.

Introdução

Muitos métodos de coloração têm sido usados para visualizar proteínas após eletroforese em gel, por exemplo, usando colorimétricos corantes como azul de Coomassie brilhante, mancha prateada, fluorescência, ou radioativo rotulagem^{1,2, 3 , 4}. coloração prata é considerada uma das técnicas mais sensíveis para a deteção de proteínas que requerem reagentes simples e baratos. Pode ser classificado em duas grandes famílias: a mancha de prata amoniacal e o nitrato de prata mancham^5,6. O método de prata amoniacal alcalino, o complexo de prata-diamina é produzido com amônia e hidróxido de sódio e reduzido a prata metálica durante o desenvolvimento usando uma solução de formaldeído ácido. A mancha acomoda eficientemente para proteínas básicas mas mostra um desempenho comprometido para proteínas ácidas e neutras e é, além disso, limitado a clássica glicina e taurinas sistemas eletroforético. Em comparação, as manchas de nitrato de prata exploram a bio-afinidade elevada de íons de prata à proteína, principalmente a sulfidrila e carboxila grupos de cadeias de lado e tendem a manchar as proteínas ácidas mais eficientemente⁷. Após o íon prateado vinculativo, uma solução em desenvolvimento (normalmente feita de uma solução de carbonato de metal contendo formaldeído e sódio tiossulfato) é aplicada para reduzir os íons de prata para grãos de prata metálicos, que construir uma cor marrom-escuro para visualizar o bandas de proteínas.

Embora a coloração prata bem conhecida por sua versatilidade e alta sensibilidade desde seu desenvolvimento na década de 1970⁸, o método é frequentemente considerado tão complicado. Métodos de coloração de prata tem passos de tempo restrito e mostram baixa reprodutibilidade. Desde que a cor da mancha prateada geralmente não é uniforme e dependente a etapa de redução, que é difícil de controlar, a mancha de prata não é um método quantitativo e, assim, não é recomendado para gel de comparação estudo e proteína quantificação⁹. Métodos otimizados em sensibilidade podem utilizar aldeídos que podem também fornecer um uniforme mais¹⁰de coloração. No entanto, isto é à custa de uma análise mais aprofundada a jusante devido a reticulação de proteínas por aldeídos. Protocolos rápidos principalmente combinam ou encurtam etapas para reduzir o tempo, comprometer a reprodutibilidade e a uniformidade da mancha⁵. Como resultado, existem numerosas prata coloração variantes dentro do gel de proteína, coloração, cada um otimizado para atender a certos requisitos; por exemplo, simplicidade, sensibilidade ou peptídeo taxa de recuperação para análise a jusante. Esses atributos também podem ter impacto sobre os outros, e satisfazer todas as exigências em um protocolo pode ser difícil.

Neste trabalho, apresentamos uma nova prata fluorescente método para detecção de proteínas em gel de poliacrilamida de coloração. Neste método, usamos uma sonda fluorogenic para íons de prata, TPE-4TA (Figura 1), para visualizar as proteínas impregnado de prata¹¹. TPE-4TA é projetado pelo princípio de emissão induzida por agregação (AIE). É não-emissivo quando dissolvido em solução aquosa, mas é altamente emissivo na presença de íons de prata. Substituindo o desenvolvimento cromogênico em manchas de prata tradicionais com um fluorogenic passo a desenvolver, o método fluorescente prateado permite a coloração robusto de proteínas totais com um fundo reduzida.

Além disso, a mancha de prata fluorescente mostrou uma boa faixa linear dinâmica para quantificação da proteína, que é comparável com a mancha de Ruby SYPRO amplamente utilizado e não realizáveis com manchas de prata tradicionais. O gel pode ser fotografado em sistemas de documentação comumente usados gel com uma lâmpada de ultravioleta (comprimento de onda de excitação: canal de 302/365 nm; emissão: ~ 490-530 nm) em muitos laboratórios biológicos.

Protocolo

1. preparação do Gel

Nota: A demonstração segue um protocolo padrão para preparar o gel para coloração pouco depois de SDS-PAGE¹². Em resumo, as etapas a seguir descrevem a preparação das amostras e electroforese do gel.

1. Executar SDS-PAGE com géis de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 mm, 15-bem) usando um gel de mini tanque cheio de 2-(N -Morpholinos) etanesulfónico tampão de ácido (MES).
2. Dilua as amostras com uma mistura de água destilada, lítio Dodecil sulfato de sódio (LDS) buffer e um agente de redução de amostra.
3. Carrega a primeira pista com o dobro da quantidade de ações (10 µ l), seguida a quantidade normal de estoque (5 µ l) e uma série de diluições do estoque posteriormente (13 diluições, de 2x para 8192 x).
4. Funcione o gel em uma constante tensão de 200 V para 30 min.

2. fixação do Gel

1. Após a electroforese, mergulhe o gel em uma solução de 100 mL de ácido acético a ethanol/10% 40% em um agitador orbital a 50 rpm em temperatura ambiente 2 x (cada um por 30 min), ou durante a noite a 4 ° C.
2. Lave o gel 3 x 10 min cada em água ultrapura em um recipiente limpo. A etapa de lavagem é crítica. Se o ácido da solução fixação não for devidamente removido na etapa de desenvolvimento fluorogenic, a excessiva TPE-4TA será ativado pelo ácido e levar a fluorescência de fundo forte no gel.

3. preparação do AgNO₃solução e impregnação de prata do Gel

1. Tornar a solução de₃ AgNO (0,0001%) para a impregnação, em primeiro lugar, dissolva 0,01 g de AgNO₃ em 10 mL de água ultrapura para preparar uma solução a 0,1% AgNO₃ ações. Em seguida, adicione 100 µ l da solução estoque de 0.1% AgNO₃ em 100 mL de água ultrapura para fazer a solução de trabalho.
   Nota: A solução de AgNO₃ deve ser armazenada no escuro antes de usar.
2. Impregnar o gel com 100 mL de solução para 1h de trabalho em um agitador orbital a 50 rpm em um recipiente de vidro fechado de prata. É fundamental para realizar a impregnação de prata sob uma coifa, protegida da luz com papel alumínio.
3. Lave o gel com água ultrapura (cerca de 100 mL) em um recipiente limpo para 2 x 60 s.

4. Fluorogenic desenvolvimento do Gel

1. Para preparar a solução de corante (0,1 mM), adicione 3,0 mg do TPE-4TA corante em 50 mL de água ultrapura. Proceda à sonicação a solução por alguns minutos e adicionar uma solução de NaOH (por exemplo, 1 M) para ajudar a dissolver o corante.
2. Verifique se a fluorescência da solução sob uma lâmpada de nanômetro UV 365 para garantir que a molécula do corante é totalmente dissolvida. Só soluções fracas ou nonemissive indicam dissolução completa.
   Nota: A tintura que TPE-4TA foi sintetizada a seguir o protocolo recentemente relatado por Xie et al ¹⁰ a TPE-4TA solução é muito estável e pode ser mantida no escuro por meses.
3. Para preparar 100 mL da solução em desenvolvimento fluorogenic (10 µM), adicione 10 mL da solução-mãe TPE-4TA em 90 mL de água ultrapura. Verificar o pH da solução usando um medidor de pH e ajustá-lo a 7-9 usando uma solução de hidróxido de sódio (1 µM).
4. Transferi o gel para um recipiente limpo e selável com 100 mL da solução em desenvolvimento fluorogenic. Certifique-se que o gel está totalmente imerso na solução. Sele o contêiner. Cobri-lo de luz e agitá-lo durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm, à temperatura ambiente. Alternativamente, a etapa de incubação também pode ser reduzida para cerca de ~ 2 h por pré-aquecimento a solução em desenvolvimento AIE a 80 ° C, para a coloração e em seguida, deixando-o à temperatura ambiente.

5. descoloração e imagem

1. Transferir o gel para um recipiente limpo e destain-lo em 100 mL de etanol a 10% por 30 min.
   Nota: A água sozinha pode ser usada para lavar o gel. No entanto, é mais tempo-eficiente usar uma solução de etanol de 10% para a descoloração. Isto ajudará a reduzir o processo de descoloração de horas a 30 min.
2. Lave o gel em água ultrapura por 5 min.
3. Imagem do gel na 365 nm ou 302 nm canais, por uma máquina de documentação de gel.

Resultados

As bandas de proteínas coradas pela mancha prata fluorescente apresentam uma fluorescência verde intensa sob uma lâmpada de UV 365 nm. Todas as bandas de proteínas 14 (10-200 kDa), de cima para baixo, eram claramente visíveis, correlacionando-se bem com os 14 cor vermelha manchada com o Ruby SYPRO corante (Figura 2)¹⁰.

Em relação a deteção quantitativa de proteína, ...

Discussão

Apresentado aqui é uma romance prata fluorescente método de coloração para proteínas em gel de poliacrilamida. Essa estratégia integra convencionais prata manchas e manchas fluorescentes. As façanhas de coloração a ligação seletiva de íons de prata às proteínas como em outra prata manchas mas emprega uma prata fluorogenic altamente sensível sonda TPE-4TA para iluminar as proteínas prata acopladas. Desde que a sonda fluorogenic TPE-4TA pressentem-se íons de prata em conce...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	-	Equipment