Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Резюме

Здесь мы описываем подробный протокол с изложением новых флуоресцентных, техника для определения общего белка в полиакриламидных гелей окрашивания. Протокол использует Серебряный Ион конкретных флуоресценции включения зонд, который обнаруживает Ag⁺-белковых комплексов и устраняет определенные ограничения традиционных хромогенных серебряные пятна.

Аннотация

Серебряный пятнать это колориметрический метод широко используется для визуализации белка полосы в полиакриламидных гелях после натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE). Классические серебряные пятна имеют определенные недостатки, такие как высокая предпосылка окрашивание, восстановления бедных белками, низкая воспроизводимость, узкие линейный динамический диапазон для количественной оценки и ограниченная совместимость с масс-спектрометрия (МС). Теперь с использованием fluorogenic АГ⁺ зонд, ТЭП 4TA, мы разработали флуоресцентные Серебряный пятнать метод для визуализации общего белка в полиакриламидных гелей. Это новое пятно избегает хлопотно Серебряный сокращения шаг в традиционные серебряные пятна. Кроме того люминесцентные серебряные пятна демонстрирует хорошую воспроизводимость, чувствительность и линейной количественной оценки обнаружения белка, делая это пятно гель полезной и практической белка.

Введение

Многие пятная методы были используется для визуализации белков после электрофореза геля, например с помощью колориметрических красители Кумасси синим, Серебряная пятно, флуоресценции или радиоактивных маркировки^{1,2, 3 , 4}. Серебряный пятнать считается одним из наиболее чувствительных методов для обнаружения белка, требующих простой и дешевый реагентов. Это могут быть разделены на два основных семей: аммиачный Серебряная пятно и нитрата серебра пятно^5,6. В методе щелочной аммиачного серебра серебра диамин комплекс производится с аммиаком и гидроксид натрия и сокращено до металлического серебра во время разработки с помощью решения кислотные формальдегида. Пятно вмещает эффективно для основных белков, но показывает Скомпрометированное представление для кислых и нейтральных белков и, Кроме того, ограничивается классической глицин и таурина электрофоретической систем. В сравнении, нитрата серебра пятна эксплуатировать высокой био близость ионов серебра белка, главным образом сульфгидрильных и карбоксильных групп из боковых цепей и склонны пятно кислые белки более эффективно⁷. После ионов серебра привязки, развивающихся решение (как правило, сделаны из металла карбонат раствор, содержащий формальдегида и натрия тиосульфата) применяется для снижения ионы серебра Металлик серебряный зерна, которые строить коричневого до темного цвета для визуализации белка полосы.

Хотя Серебряные пятная был хорошо известен своей универсальностью и высокой чувствительности с его развития в 1970-х⁸, метод часто рассматривается как сложная. Серебро окрашивание методы имеют ограниченный время шаги и показать низкая воспроизводимость. Поскольку цвет серебряные пятна обычно не является единообразной и зависит от сокращения шаг, который сложно контролировать, Серебряная пятно не количественный метод и, таким образом, не рекомендуется для геля сравнения исследования и белка количественная оценка⁹. Методы оптимизации чувствительности могут использовать альдегидов, которые также могут обеспечить более единообразной пятнать¹⁰. Однако это за счет далее вниз по течению анализ благодаря сшивки белков, альдегиды. Быстрый протоколы главным образом объединить или сократить шаги по сокращению времени, ущерба для воспроизводимости и единообразия пятно⁵. В результате имеются многочисленные Серебряные пятная варианты внутри гель белка, окрашивание, каждый оптимизирована для удовлетворения определенных требований; например простота, чувствительности или пептид ставки возмещения по течению анализа. Эти атрибуты также могут иметь влияние друг на друга, и удовлетворение всех требований в одном протоколе может быть затруднено.

В этой работе мы представляем новый флуоресцентные Серебряный пятнать метод для определения белка в геле полиакриламида. В этом методе мы используем fluorogenic зонд для ионы серебра, ТЭП 4TA (рис. 1), чтобы визуализировать серебро пропитанные белков¹¹. TPE-4TA разработан принцип индуцированной агрегации выбросов (АЕИ). Это не эмиссионные при растворении в водном растворе, но весьма эмиссионных присутствии ионов серебра. Заменив хромогенных развития в традиционные серебряные пятна fluorogenic развивающихся шаг, люминесцентные серебряные метод позволяет надежные пятнать суммарных белков на фоне снижения.

Кроме того люминесцентные серебряные пятна показал хороший линейный динамический диапазон для количественного определения белка, которая сравнима с пятно SYPRO Ruby широко используется и не достижимы с традиционной серебряные пятна. Гель может отражаться на часто используемые гель документации систем с ультрафиолетовой лампой (длина волны возбуждения: 302/365 Нм канал; выбросов: ~ 490-530 Нм) на многих биологических лабораториях.

протокол

1. Подготовка геля

Примечание: Демонстрация следующим стандартным протоколом для подготовки гель для окрашивания вскоре после SDS-PAGE¹². Короче говоря следующие шаги описывают подготовки проб и электрофорез геля.

1. Выполняют SDS-PAGE с 4% - 12% бис-трис белка гели (1 мм, 15-а) с помощью танк мини-Гель заполнены с 2-(N -Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES) буфера.
2. Развести образцы с сочетанием дистиллированной воды, литий Додециловый сульфат (LDS) буфер и образец уменьшение агента.
3. Загрузите первый Лейн с удвоить количество запасов (10 мкл), а затем суммы обычных запасов (5 мкл) и серию разведений двойную фондовой впоследствии (13 разведений, с 2 x до 8192 x).
4. Побегите гель на постоянное напряжение 200 В течение 30 мин.

2. Фиксация геля

1. После электрофореза опускайте гели в 100 мл раствора уксусной кислоты 40% ethanol/10% на орбитальный шейкер на 50 об/мин при комнатной температуре 2 x (каждый 30 минут), или на ночь при 4 ° C.
2. Вымойте гели 3 x 10 мин в ультрачистая вода в контейнере чистой. Стиральная шаг очень важен. Если кислоты из крепления решения не удаляется надлежащим образом в fluorogenic развивающихся шаг, чрезмерное TPE-4TA будет активироваться кислоты и привести к флуоресцирования сильный фон в геле.

3. Подготовка AgNO₃решения и серебряные пропитки геля

1. Чтобы сделать решение₃ AgNO (0,0001%) для пропитки во-первых, Растворите 0,01 г₃ AgNO сверхчистой воды приготовить раствор штока₃ AgNO 0,1% 10 мл. Далее добавите 100 мкл раствора 0,1% AgNO₃ штока в 100 мл сверхчистой воды, чтобы сделать рабочий раствор.
   Примечание: AgNO₃ раствор должен храниться в темноте перед использованием.
2. Пропитать гель 100 мл серебра рабочего раствора на 1 ч на орбитальный шейкер на 50 об/мин в закрытой стеклянной посуде. Это имеет решающее значение для выполнения Серебряный пропитки под вытяжного шкафа, защищенном от света с алюминиевой фольгой.
3. Промойте гель с ультрачистая вода (около 100 мл) в чистую емкость для 2 x 60 s.

4. Fluorogenic развитие геля

1. Подготовить раствор красителя (0,1 мм), добавьте 3,0 мг красителя TPE-4TA в 50 мл сверхчистой воды. Sonicate раствор на несколько минут и добавить некоторые растворе NaOH (например 1 М) чтобы помочь растворить краску.
2. Проверьте флуоресценции решения под 365 Нм УФ лампа для обеспечения что молекулы красителя полностью растворяется. Только слабые или nonemissive решения указывают полное растворение.
   Примечание: Краситель, который был TPE-4TA синтезированы следующие протокола недавно сообщали СЕ et al. ¹⁰ решение TPE-4TA очень стабильна и может храниться в темноте в течение месяцев.
3. Подготовить 100 мл fluorogenic развивающихся раствора (10 мкм), добавьте 10 мл раствора TPE-4TA акций в 90 мл ультрачистая вода. Проверьте рН раствора с помощью рН метр и настроить его для 7-9 с помощью раствора гидроксида натрия (1 мкм).
4. Передача геля чистым и герметичные контейнер с 100 мл раствора развивающихся fluorogenic. Убедитесь в том, что гель полностью погружается в решении. Уплотнение контейнера. Накройте его от света и встряхните его на ночь на орбитальный шейкер на 50 об/мин при комнатной температуре. Кроме того на этапе инкубации также может быть сокращен до около ~ 2 h, подогрева развивающихся решение АНО до 80 ° C для окрашивания и затем оставить его при комнатной температуре.

5. минигелей и обработки изображений

1. Передавать чистый контейнер гель, Отмойте в 100 мл 10% этанола за 30 мин.
   Примечание: Только вода может использоваться для мытья гель. Однако это время эффективнее использовать 10% этанола раствор для минигелей. Это поможет уменьшить destaining процесс от часа до 30 мин.
2. Промойте гель в ультрачистая вода для 5 мин.
3. Изображение геля на 365 Нм канал или 302 Нм канал гель документации машиной.

Результаты

Белка полосы запятнана люминесцентные серебряные пятна экспонат интенсивный зеленый флуоресценции под лампой УФ 365 Нм. Все 14 белка полосы (10-200 кДа), сверху вниз, были хорошо видны, соотнося с 14 красного цвета те запятнана SYPRO Рубиновый краситель (рис. 2)

Обсуждение

Представленные здесь является роман люминесцентные серебряные пятная метод для белков в полиакриламидных гелей. Эта стратегия объединяет традиционные серебряные пятна и флуоресцентные пятна. Окрашивание подвиги селективного связывание ионов серебра с белками, как и другие серебрян...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	-	Equipment