צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט חלוקה לרמות של פלורסנט חדש מכתים טכניקה לגילוי חלבון סה בג'לים לזיהוי. הפרוטוקול מנצל בדיקה קרינה פלואורסצנטית ספציפיים יון כסף מדליק, אשר מגלה Ag⁺-חלבון מכלולי ומונע הגבלות מסוימות של כתמי כסף הדפסות כסף מסורתי.

Abstract

צביעת כסף היא טכניקה ערכי צבע מוחלטים בשימוש נרחב כדי להמחיש להקות חלבון בג'לים לזיהוי בעקבות נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד). כתמי כסף קלאסי יש חסרונות מסוימים, כגון רקע מכתים, חלבון המסכן התאוששות, הפארמצבטית נמוך, טווח דינמי צר ליניארי עבור כימות ותאימות מוגבלת עם ספקטרומטר מסה (MS). עכשיו, עם השימוש של בדיקה Ag⁺ fluorogenic, TPE-4TA, פיתחנו כסף פלורסנט מכתים שיטת עבור הפריט החזותי הכולל חלבון ב לזיהוי ג'לים. הכתם החדש הזה מונע הצעד הפחתת כסף בעייתי כתמי כסף מסורתי. יתר על כן, הכתם כסף פלורסנט מדגים הפארמצבטית טוב, רגישות, כימות ליניארי בזיהוי חלבון, שהופך אותו כתם ג'ל חלבון שימושי ומעשי.

Introduction

שיטות מכתימים רבות היו בשימוש להמחיש חלבונים בעקבות בג'ל, לדוגמה באמצעות ערכי צבע מוחלטים צבעי כחול מבריק Coomassie, הכתם כסף, זריחה, או רדיואקטיבי תיוג^{1,2, 3 , 4}. צביעת כסף נחשב לאחד הטכניקות הרגישים ביותר לגילוי חלבון הדורשים ריאגנטים פשוט וזול. יכולים להיות מסווגים לתוך שתי המשפחות הגדולות: הכתם כסף אמוני, של כסף חנקתי כתם^5,6. השיטה כסף אמוני אלקליין, המתחם diamine בכסף הוא הפיק עם אמוניה, סודיום הידרוקסיד והוריד את כסף מטאלי במהלך הפיתוח באמצעות פתרון פורמלדהיד חומצי. הכתם להכיל ביעילות חלבונים בסיסי אבל מציגה הופעה פרוץ חלבונים חומצי ונייטרלי, הוא, יתר על כן, הוגבלו גליצין קלאסית ומערכות electrophoretic טאורין. לשם השוואה, לנצל הכתמים כסף חנקתי הביו-בזיקה גבוהה של יוני כסף לחלבון, בעיקר את sulfhydryl ואת carboxyl קבוצות מכל הכבלים צד ועל נוטים כתם חומצי חלבונים ביעילות רבה יותר⁷. לאחר יון כסף מחייב, פתרון המתפתח (בדרך כלל ממתכות פתרון קרבונט מתכת המכילים פורמלדהיד, נתרן thiosulphate) מוחל כדי לצמצם את יוני כסף מטאלי גרגירי כסף, אשר לבנות בצבע חום-כדי-כהה כדי להמחיש להקות חלבון.

למרות צביעת כסף היה ידוע שלו רב-תכליתיות, רגישות גבוהה מאז פיתוחה ב שנות השבעים⁸, השיטה לעתים קרובות נחשב מסובך. שיטות מכתים כסף יש זמן מוגבלת צעדים ולהראות הפארמצבטית נמוכה. מאז צבע הכתם כסף. בדרך כלל לא אחיד ובלתי תלויה השלב צמצום, אשר קשה לשלוט, הכתם כסף היא לא שיטה כמותית, לפיכך, אינה מומלצת ג'ל השוואה המחקר וחלבון כימות⁹. שיטות אופטימיזציה של רגישות עלולה לנצל את aldehydes אשר יכול גם לספק מדים יותר להכתים¹⁰. עם זאת, זה על חשבון הזרם ניתוח נוסף בשל crosslinking של חלבונים על-ידי aldehydes. פרוטוקולים מהיר בעיקר לשלב או לקצר שלבים כדי לצמצם את זמן, להתפשר על הפארמצבטית ואחידות של הכתם⁵. כתוצאה מכך, ישנם רבים כסף מכתים משתנים בתוך ג'ל חלבון מכתים, כל אחד בצורה מיטבית כדי שיתאימו בדרישות מסוימות; לדוגמה, פשטות, רגישות או פפטיד שחזור קצב לניתוח במורד הזרם. תכונות אלה עשויים גם להשפיע אחד על השני, והוא מספק את כל הדרישות באחד הפרוטוקולים יכול להיות קשה.

בעבודה זו, אנו מציגים כסף פלורסנט חדש מכתים שיטה לגילוי חלבון בג'ל לזיהוי. בשיטה זו, אנו משתמשים בדיקה fluorogenic על יוני כסף, TPE-4TA (איור 1), כדי להמחיש את החלבונים ספוג כסף¹¹. TPE-4TA מיועד על פי. העיקרון הנוצרות על-ידי צבירת פליטה (קובי אשכנזי). זה בלתי-emissive נמס בתמיסה המימית, אבל הוא מאוד emissive בנוכחות יוני כסף. על-ידי החלפת הפיתוח הדפסות כסף בכתמי כסף המסורתי fluorogenic פיתוח שלב, מאפשרת השיטה כסף פלורסנט ההכתמה חזקים של חלבונים הכולל עם רקע מופחת.

יתר על כן, הכתם כסף פלורסנט הראה טווח דינמי טוב ליניארי על כימות חלבון, שהוא דומה עם הכתם עברית בשימוש נרחב וגם לא בר השגה עם כתמי כסף מסורתי. הג'ל יכול לדימות במערכות תיעוד ג'ל נפוץ עם מנורת אולטרה סגול (אורך גל עירור: ערוץ nm 302/365; פליטה: ~ 490-530 ננומטר) במעבדות ביולוגיות רבות.

Protocol

1. הכנת הג'ל

הערה: ההפגנה כדלקמן פרוטוקול רגיל להכין הג'ל מכתים זמן קצר לאחר מרחביות-דף¹². בקצרה, השלבים הבאים מתארים את הכנת הדגימות, ג'ל אלקטרופורזה.

1. לבצע מרחביות-דף עם 4% - 12% Bis-טריס חלבון ג'ל (1 מ"מ, ובכן 15) באמצעות ג'ל מיני טנק מלא 2-(N -מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר.
2. לדלל את הדגימות עם תערובת של מים מזוקקים, ליתיום dodecyl סולפט (LDS) מאגר סוכן בהפחתת דגימה.
3. לטעון את הנתיב הראשון עם כמות כפולה של המניות (10 µL), ואחריו את כמות מניות רגילה (5 µL) ואת סדרת דילולים כפולה של המניה לאחר מכן (13 דילולים, מ- 2 x ל 8192 x).
4. הפעל את הג'ל על מתח קבוע של 200 וולט למשך 30 דקות.

2. קיבוע של הג'ל

1. לאחר אלקטרופורזה, להטביע את ג'ל בריכוז 100 מ של 40% חומצה אצטית ethanol/10% על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד בטמפרטורת החדר 2 x (כל אחד למשך 30 דקות), או ללון ב 4 º C.
2. לשטוף את ג'ל 3 x 10 דקות כל הנדסה גנטית מים במיכל נקי. השלב כביסה הוא קריטי. אם החומצה מהפתרון תיקון לא יוסר כראוי בשלב פיתוח fluorogenic, יתר TPE-4TA יופעלו על ידי החומצה ולהוביל רקע חזק פלורסצנטיות הג'ל.

3. הכנת AgNO₃פתרון והספגה כסף של הג'ל

1. כדי להפוך את הפתרון₃ AgNO (0.0001%) על ההפריה, ראשית, להמיס 0.01 גר' AgNO₃ מ"ל של מים הנדסה גנטית כדי להכין AgNO 0.1%₃ מניות פתרון. לאחר מכן, להוסיף 100 µL של 0.1% AgNO₃ מניות הפתרון לתוך 100 מ של מים הנדסה גנטית כדי להפוך את הפתרון עובד.
   הערה: יש לאחסן את הפתרון₃ AgNO בחושך לפני השימוש.
2. להפרות את הג'ל עם 100 מ של כסף עובד פתרון עבור 1 h על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד במיכל זכוכית אטום. זה חיוני כדי לבצע את ההפריה כסף ברדס fume, מוגן מפני אור ברדיד אלומיניום.
3. לשטוף את הג'ל עם הנדסה גנטית מים (בערך 100 מ ל) במיכל נקי עבור 2 x 60 s.

4. Fluorogenic הפיתוח של הג'ל

1. כדי להכין הפתרון מלאי צבע (0.1 מ מ), להוסיף 3.0 מ"ג לצבוע TPE-4TA 50 מ של מים הנדסה גנטית. Sonicate הפתרון לכמה דקות ולהוסיף קצת פתרון NaOH (לדוגמה 1 מ') כדי לעזור לפזר את הצבע.
2. בדוק את זריחה של הפתרון תחת מנורה nm UV 365 כדי להבטיח כי מולקולת צבע מלא התפרקה. רק פתרונות חלש או nonemissive מצביעים על פירוק מלא.
   הערה: לצבוע ש-TPE-4TA היה מסונתז להלן הפרוטוקול דיווח לאחרונה על-ידי שיה. et al. ¹⁰ הפתרון TPE-4TA יציב מאוד, יכול להישמר בחושך במשך חודשים.
3. כדי להכין 100 מ של הפתרון פיתוח fluorogenic (10 מיקרומטר), להוסיף 10 מ של הפתרון מניות TPE-4TA לתוך 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. בדוק את ה-pH של התמיסה באמצעות מד pH, לכוונן אותו כדי 7-9 באמצעות פתרון נתרן הידרוקסידי (1 מיקרומטר).
4. להעביר את הג'ל מיכל sealable ונקי עם 100 מ של פתרון fluorogenic מתפתחות. ודא שהג'ל הוא שקוע לגמרי בפתרון. חותם את המכולה. לכסות את זה האור ולנער אותו בן לילה על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד בטמפרטורת החדר. לחלופין, שלב הדגירה יכולה גם יתקצר בערך ~ 2 ש על ידי חימום הפתרון המתפתח קובי אשכנזי עד 80 ° C עבור צביעת ולהשאיר אותו ואז בטמפרטורת החדר.

5. destaining והדמיה

1. להעביר את הג'ל במיכל נקי, destain אותו ב- 100 מ של 10% אתנול למשך 30 דקות.
   הערה: מים לבד יכול לשמש כדי לשטוף את הג'ל. עם זאת, יותר זמן יעיל לשימוש 10% אתנול הפתרון destaining. פעולה זו תסייע להפחית את תהליך destaining שעות עד 30 דקות.
2. יש לשטוף את ג'ל אלקטרופורזה מים במשך 5 דקות.
3. תמונה הג'ל בערוץ nm 365 או ערוץ nm 302 ע י מכונה תיעוד ג'ל.

תוצאות

הלהקות חלבון מוכתמת הכתם כסף פלורסנט התערוכה של קרינה פלואורסצנטית ירוק עז תחת מנורת UV nm 365. חלבון 14 כל להקות (10-200 kDa), מלמעלה למטה, נראו בבירור, מתאם טוב עם אלה שצבעו אדום 14 מוכתמת צבען (איור 2)¹⁰עברית.

לגבי זיהוי ח...

Discussion

המוצג כאן כסף פלורסנט הרומן מכתימה שיטת חלבונים בג'לים לזיהוי. אסטרטגיה זו משלבת כתמי כסף קונבנציונאלי כתמי פלורסנט. מעלליו מכתימים הכריכה סלקטיבי של יון כסף חלבונים כמו כסף אחרים כתמים אך מעסיקה כסף fluorogenic רגישה מאוד בדיקה TPE-4TA כדי להאיר את החלבונים מאוגד כסף. מאז המכשיר fluorogenic

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	-	Equipment