Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

요약

여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag⁺를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

초록

실버 얼룩은 널리 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 다음 polyacrylamide 젤에 단백질 밴드를 시각화 하는 데 사용 색도계 기술. 클래식은 얼룩 얼룩, 불 쌍 한 단백질 복구, 낮은 재현성, 정량화, 및 질량 분석 (MS)와 호환성을 제한 된 좁은 선형 동적 범위 높은 백그라운드와 같은 특정 단점이 있다. 지금, TPE-4TA, fluorogenic⁺ Ag 프로브를 사용 하 여 우리 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 시각화 방법 얼룩이 지기 형광 실버를 개발 했다. 이 새로운 얼룩 전통적인 실버 얼룩에 성가신 실버 감소 단계를 피할 수 있습니다. 또한, 형광은 얼룩 좋은 재현성, 감도, 및 선형 부 량 단백질 검출, 유용 하 고 실용적인 단백질 젤 얼룩을 만드는 방법을 보여 줍니다.

서문

많은 얼룩 방법 단백질 젤 전기 이동 법에 따라, 예를 들면 Coomassie 화려한 블루, 실버 얼룩, 형광, 색도계 염료를 사용 하 여 시각화 하는 데 사용 되었거나 방사성 라벨^{1,2, 3 , 4}. 실버 얼룩 간주 됩니다 간단 하 고 저렴 한 시 약을 필요로 하는 단백질 검출에 대 한 가장 중요 한 기술 중 하나. 그것은 두 개의 주요 가족으로 분류 될 수 있다: 실버 질산염 및 암모니아은 얼룩 얼룩^5,6. 알칼리 성 암모니아 실버 메서드 실버 diamine 복잡 한 암모니아와 수산화 나트륨 생산 이며 산 성 포 름 알 데히드 솔루션을 사용 하 여 개발 하는 동안 금속은 감소. 얼룩 기본적인 단백질에 대 한 효율적으로 수용 하지만 산 성 및 중성 단백질에 대 한 손상 된 성능을 보여줍니다 그리고, 또한, 클래식 글리신 및 황소자리 전기 이동 시스템. 비교, 실버 질산염 얼룩 악용 단백질은 이온의 높은 바이오 선호도, 주로 sulfhydryl carboxyl 측면 체인에서 그룹 그리고 산 성 단백질을 보다 효율적으로 얼룩 하는 경향이⁷. 실버 이온 바인딩, 후 (일반적으로 만든 포름알데히드와 나트륨 thiosulphate를 포함 하는 금속 탄산 솔루션) 개발 솔루션은 이온 금속은 곡물 브라운-어두운 색상 시각화를 구축을 줄이기 위해 적용 되는 단백질 밴드입니다.

비록은 얼룩의 다양성 및 높은 감도 대 한 잘 알려진 1970 년대⁸의 개발 이후, 방법으로 까다로운 자주 간주 됩니다. 실버 얼룩 방법을 단계 시간 제한 있고 낮은 재현성을 보여줍니다. 실버 얼룩의 색상은 일반적으로 하지 균일 하 고 제어 하기 어렵다, 감소 단계에 따라 이후 실버 얼룩 양적 방법 이며, 따라서, 젤 비교 연구 및 단백질 정량화⁹에 대 한 권장 하지 않습니다. 감도에 최적화 하는 방법 또한 더 유니폼¹⁰얼룩을 제공할 수 있는 알데하이드 활용 수 있습니다. 그러나,이 때문에 알데하이드에 의해 단백질의 가교 추가 다운스트림 분석 비용입니다. 빠른 프로토콜은 주로 조합 또는 재현성 및 얼룩⁵의 균일성을 타협 하는 시간을 줄이기 위해 단계를 단축. 그 결과, 수많은 실버 얼룩 얼룩; 특정 요구 사항에 맞게 최적화 된 각 단백질 젤 내에서 이체 있다 예를 들어 단순, 감도, 또는 펩 티 드 복구 속도 다운스트림 분석에 대 한. 이러한 특성 또한 서로에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 한 프로토콜에서 모든 요구를 만족 시키기 어려울 수 있습니다.

이 작품에서 새로운 형광은 단백질 검출 polyacrylamide 젤에 방법 얼룩을 소개 합니다. 이 방법에서는, 우리 실버 침 단백질¹¹시각화 하은 이온, TPE-4TA (그림 1)에 대 한 fluorogenic 프로브를 사용 합니다. TPE 4TA 집계 유도 방출 (AIE) 원칙에 의해 설계 되었습니다. 그것은 비-브 수성 해결책에서 녹을 때 하지만 높은 브은 이온의 존재. 전통적인 실버 얼룩에 비 개발 단계를 개발 하는 fluorogenic, 바꿔서 형광은 메서드 감소 배경으로 총 단백질의 강력한 얼룩 수 있습니다.

또한, 형광은 얼룩 널리 SYPRO 루비 얼룩과 비교 하 고 전통적인은 얼룩 하지 달성 단백질 정량화에 대 한 좋은 동적 선형 범위를 보였다. 젤 자외선 램프로 일반적으로 사용 되 젤 문서 시스템에 몇 군데 수 있습니다 (여기 파장: 302/365 nm 채널; 방출: 490 ~ 530 nm) 많은 생물학 실험실에서.

프로토콜

1입니다. 젤의 준비

참고: 데모 SDS 페이지¹²직후 얼룩에 대 한 젤을 준비 하는 표준 프로토콜을 따릅니다. 간단히, 다음 단계는 샘플의 준비를 설명 하 고 젤 전기 이동 법.

1. 4%-12% 두번째-트리 스 단백질 젤 (1mm, 15 잘) SDS 페이지 수행 2-(N-morpholino)로 가득 미니 젤 탱크를 사용 하 여 ethanesulfonic 산 (MES) 버퍼.
2. 희석 증류수, 리튬 라우릴 황산 (LDS) 버퍼, 그리고 샘플을 감소 요원의 혼합물으로 샘플.
3. 재고 (10 µ L), 양의 두 배 첫 번째 레인 정상적인 재고 금액 (5 µ L) 및 (13 희석, 8192 x 2 배에서)의 두 가지 희석 후의 일련 로드.
4. 30 분 동안 200 V의 정 전압에서 젤을 실행 합니다.

2입니다. 젤의 고정

1. 실내 온도 (각 30 분), x 2에 또는 하룻밤 4 ° c.에서 50 rpm에서 궤도 통에 40 %ethanol/10% 초 산의 100 mL 해결책에 젤 전기 이동 법, 후 잠수함
2. 3 x 10 분 각 깨끗 한 용기에 초순에 젤을 씻어. 세척 단계는 중요 한. 고정 솔루션에서 산 fluorogenic 개발 단계에서 제대로 제거 되지 않습니다, 경우 과도 한 TPE-4TA 산에 의해 활성화 되 고 젤에서 강한 배경 형광.

3. 준비는 AgNO₃솔루션 및 젤의 실버 침

1. 어 그 노₃ 솔루션 (0.0001%) 임신에 대 한 첫째, 0.01 g 0.1% AgNO₃ 재고 솔루션을 준비 하는 초순의 10 ml에서 AgNO₃ 의 분해. 다음, 작업 솔루션 초순 물 100 mL에 0.1% AgNO₃ 재고 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
   참고: AgNO₃ 솔루션 사용 하기 전에 어둠 속에 저장 합니다.
2. 실버 밀폐 유리 용기에서 50 rpm에서 궤도 통에 1 시간에 대 한 솔루션을 작업의 100 mL와 함께 젤 임신 그것은 증기 두건, 알루미늄 호 일 빛에서 보호 아래은 수태를 수행 하는 중요 한입니다.
3. 2 x 60에 대 한 깨끗 한 용기에 초순 (약 100ml)와 젤을 씻어 s.

4. Fluorogenic 젤의 개발

1. 염료 스톡 솔루션 (0.1 m m)를 준비 하려면 초순 물 50 mL에 TPE 4TA 염료의 3.0 mg을 추가 합니다. 몇 분 동안 솔루션을 sonicate 고 염료를 분해 수 있도록 일부 NaOH 솔루션 (예를 들면 1 개 M)를 추가 합니다.
2. 염료 분자는 완전히 용 해 되도록 365 nm UV 램프에서 솔루션의 형광을 확인 하십시오. 만 약 또는 nonemissive 솔루션 전체 해체를 나타냅니다.
   참고: TPE-4TA 은 염료 합성 다음 프로토콜 최근 보고 시 외. ¹⁰ TPE 4TA 솔루션 매우 안정적 이며 달 동안 어둠 속에 보관 하실 수 있습니다.
3. Fluorogenic 개발 솔루션 (10 µ M)의 100 mL를 준비 하려면 초순 물 90 mL에 TPE 4TA 재고 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. PH 미터를 사용 하 여 솔루션의 산도 확인 하 고 7-9를 사용 하 여 수산화 나트륨 용액 (1 µ M)에 그것을 조정할.
4. Fluorogenic 개발 솔루션의 100 mL와 함께 깨끗 하 고 접착성 컨테이너에 젤을 전송 합니다. 젤은 완전히 몰입 솔루션에 다는 것을 확인 하십시오. 컨테이너 봉인. 빛에서 그것을 커버 하 고 하룻밤 실 온에서 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어. 또는, 인큐베이션 단계 수 또한 단축 될 약 ~ 2 h AIE 개발 솔루션 얼룩이 지 고 실내 온도에 그것을 떠날에 대 한 80 ° C로 예 열 하 여.

5. destaining 및 이미징

1. 깨끗 한 용기에 젤을 전송 하 고 30 분 동안 10% 에탄올 100ml에 destain.
   참고: 혼자 물 젤을 씻어 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 destaining에 대 한 10% 에탄올 솔루션을 사용 하 여 시간을 더 효율적입니다. 이 시간에서 30 분으로 destaining 과정을 줄이기 위해 도움이 됩니다.
2. 5 분 동안 초순에 젤 린스.
3. 365 nm 채널 또는 302 nm 채널에서 젤 젤 문서 컴퓨터 이미지.

결과

형광은 얼룩에 의해 얼룩이 단백질 밴드 365 nm UV 램프에서 강렬한 녹색 형광을 전시 한다. 모든 14 단백질 밴드 (10-200 kDa), 위에서 아래로, 명확 하 게 보이는, SYPRO 루비 염료 (그림 2)¹⁰에 의해 스테인드 14 레드 색 들과 잘 했다.

정량적 단백질 검출에 관한는 젤은 젤 이미징 시스템 자동화 ?...

토론

여기는 소설 형광은 얼룩 polyacrylamide 젤에 단백질을 위한 방법. 이 전략은 기존의 얼룩 및 형광 얼룩 통합합니다. 얼룩 악용 다른 실버로 단백질은 이온의 선택적 바인딩 얼룩 하지만 매우 중요 한 fluorogenic 실버를 사용 하 여 TPE 4TA 빛은 바인딩된 단백질을 조사. 하면 전통에 필요에 따라 감소 시각화 단계의 더 이상 요구 하지 않고 매우 민감한 감지 이후 fluorogenic 프로브 TPE 4TA

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagent
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	Precast gel
Sample Reducing Agent (10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagent
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagent
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Equipment
300W Power Supply (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	Equipment
Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Sample
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagent
Ethanol	Bragg and co.	42520J	Reagent
Acetic acid	J.T. Baker	103201A	Reagent
Milli-Q Synthesis A10	Merk	-	Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model)	Azure biosystems	-	Equipment