Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4⁺ y CD8⁺ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

Resumen

Caracterización de células inmunitarias se basa pesadamente multicolor por citometría de flujo para identificar subpoblaciones basadas en la expresión diferencial de marcadores de superficie. Instalación de un panel multicolor clásico requiere instrumentos High-End, anticuerpos etiquetados personalizados y cuidadoso estudio diseño para minimizar la superposición espectral. Hemos desarrollado un análisis multiparamétrico para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4⁺ y CD8⁺ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en sangre periférica mediante la combinación de siete marcadores de linaje utilizando sólo dos fluorocromos. Nuestra estrategia se basa en la observación que los marcadores de linaje se expresan constantemente en una combinación única por cada población celular. Combinando esta información con una cuidadosa titulación de los anticuerpos permite a los investigadores grabar cinco marcadores adicionales, ampliando el límite óptico de la mayoría los citómetros de flujo. Comparación directa demostró que la gran mayoría de las poblaciones de células inmunitarias en la sangre periférica puede ser caracterizada con precisión comparable entre nuestro método y el "un marcador fluorocromo y un enfoque clásico", aunque este último sigue siendo más precisos para la identificación de las poblaciones, como las células NKT y células de T del γδ. La combinación de siete marcadores con dos fluorocromos permite el análisis de poblaciones celulares inmunes complejos y muestras clínicas en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 e incluso en 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo. Este enfoque es también muy adecuado para la detección de varias poblaciones de la célula en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.

Introducción

Citometría de flujo es una técnica que fue desarrollada para analizar varios parámetros en solas partículas a una velocidad de varios miles de sucesos por segundo¹. Ejemplos de muestras analizadas por citometría de flujo incluyen, pero no se limitan a, las células, los granos, bacterias, vesículas y cromosomas. Un sistema fluídico dirige las partículas en el punto de interrogación donde cada partícula cruza su camino con uno o más láseres, y varios parámetros son grabados para su posterior análisis. Scatter delantero y lateral, generado por la dispersión de la luz láser puro, se utiliza para identificar la población objetivo y recuperar información sobre el tamaño relativo y la complejidad interna/granularidad de las partículas, respectivamente. Todos los otros parámetros, que representan la mayor parte de los datos en un análisis de citometría de flujo, se derivan por sondas marcadas con el fluorocromo que reconocen y se unen a objetivos específicos en las partículas de interés.

Citometría de flujo es una herramienta primaria para estudios inmunológicos identificar y caracterizar poblaciones celulares. Para diseccionar la complejidad del sistema inmune, paneles multicoloras evolucionan constantemente para ampliar el número de marcadores simultáneamente grabada para profunda Inmunofenotipificación de poblaciones de células¹. Esto conduce al desarrollo de los instrumentos más capaces y fluorocromos, con citómetros de flujo gama alta reciente superior a 20 parámetros fluorescentes. El resultado en el diseño de estudio complejo debido a la superposición espectral fluorocromo y en costes más altos asociados con encargo anticuerpo etiquetado y calificados operadores. En varios casos, complejidad y los costes se reducen mediante el uso de distintos paneles de marcadores de diferentes poblaciones celulares. Este enfoque, sin embargo, es propenso a errores, reduce la información en cada panel y puede ser difícil de aplicar a las muestras con número limitado de células. Por otra parte, aumentar el número de marcadores excluye immunophenotyping profunda en los instrumentos con menos parámetros fluorescentes. Previamente hemos desarrollado un protocolo de tinción para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4⁺ y CD8⁺ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la combinación de siete marcadores de linaje mediante sólo dos fluorocromos en lugar de los siete necesarios usando el tradicional "un marcador fluorocromo y un" enfoque (www.hcdm.org)^2,3. Nuestro informe inicial había explorado y había validado la noción de combinar siete marcadores de dos fluorocromos de immunophenotyping profundo. En este informe, presentamos un protocolo paso a paso para aislar y la tinción de células sanguíneas periféricas, centrándose en el aspecto práctico y solución de problemas de pasos para lograr una acertada coloración.

Este protocolo se basa en la observación que marcadores de linaje tienen una expresión constante en la superficie celular y que cada población celular tiene una exclusiva combinación de marcadores de linaje. En PBMCs, expresión de CD3 subdivide las células inmunes en dos categorías principales: los linfocitos T CD3-positive y células CD3 negativas. Dentro del subgrupo positivo de CD3, CD4⁺, CD8⁺ y las células de T del γδ se pueden separar utilizando anticuerpos dirigidos exclusivamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera similar, dentro del subgrupo negativo CD3, las células B, células NK y monocitos pueden identificarse unívocamente usando los anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente. En un enfoque de un fluorocromo marcador uno estándar, anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-CD19, CD56 y - TCR γδ los anticuerpos se detectan con siete diferentes fluorocromos. Nuestro enfoque combina anti-CD3, CD56 y - TCR γδ anticuerpos en un fluorocromo (designada para el fluorocromo de conveniencia A) y anti-CD4,-CD8, CD14 y - CD19 anticuerpos en un fluorocromo diferente (fluorocromo B). Esto es posible por una combinación de valoración de anticuerpos y antígeno diferencial expresión. Ambos CD4⁺ y CD8⁺ T las células son positivas para el anticuerpo anti-CD3 en fluorocromo A, pero se pueden separar en fluorocromo B maximizar la expresión de la señal de CD8 colocando con una titulación especial, la señal de CD4 entre el CD8 y las células de CD3 positivo-CD4/CD8 dobles negativas. Las células de T del γδ expresa mayor nivel de CD3, CD4 y CD8, y por lo tanto pueden ser identificados como CD3 alto⁴. Esta señal es impulsada más por etiquetado γδ células de T en fluorocromo A con un anti-TCR γδ los anticuerpos, mejorando la separación entre células T baja de CD3 y células Tγδ alta T de CD3. Las células de B pueden identificarse como CD3^– en el fluorocromo A y CD19⁺ en fluorocromo B. Para separar las células NK negativo CD3 de células B, fue utilizado un anticuerpo anti-CD56 en fluorocromo A como anti-CD3. Esto es posible porque expresa CD56 de células NK en un nivel mucho más bajo que el CD3 en células T⁵. Finalmente, los monocitos pueden ser identificados mediante una combinación de propiedades de dispersión hacia delante-lateral y expresión de CD14 en fluorocromo B.

La idea de combinar hasta cuatro marcadores con dos fluorocromos se ha intentado con éxito antes de^6,7,8y se ha utilizado en un protocolo clínico para identificar poblaciones linfocíticas malignas⁹ . Un informe anterior también combinado siete marcadores (con diferente especificidad de los marcadores que utilizamos en nuestro protocolo) usando dos fluorocromos, pero ello dependía de un complejo etiquetado de cada anticuerpo con diferente cantidad de fluorocromo¹⁰. Esto está en contraste con el método que utiliza anticuerpos comercialmente disponibles y puede ser adaptado a la configuración del equipo y puede tomar ventaja de la nueva generación de fluorocromos de polímero.

El objetivo general de esta metodología es ampliar los límites ópticos de mayoría citómetros de flujo, permitiendo la grabación de cinco marcadores adicionales para interrogar a las poblaciones de la célula compleja. Como consecuencia, análisis inmunológicos avanzado pueden realizarse en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 y 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo pueden lograr resultados notables en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo y crear flujo modular cytometric paneles dirigidos a varios linajes en el mismo tiempo¹¹. Esto puede potencialmente reducir el número de paneles utilizados en citometría de flujo immunophenotyping modular y reducir los costos, errores y tiempo de manipulación. Este enfoque es también muy adecuado en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.

Protocolo

Todos los estudios de materiales humanos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Johns Hopkins bajo la Health Insurance Portability y Accountability Act. Muestras de paciente y control fueron anónima. PBMCs y sangre de controles sanos se obtuvieron mediante consentimiento informado.

Nota: Este protocolo ha sido probado en recién o congeladas aisladas células de sangre periféricas y sangre entera.

1. preparación de la célula

1. Aislamiento de células de sangre periféricas (PBMC) de sangre entera
   1. Extraer la sangre en un tubo de tapa verde 10 mL que contiene heparina sódica. Después de que el tubo se ha llenado de sangre, inmediatamente para invertir el tubo varias veces para prevenir la coagulación.
      Nota: Tubos con otros anticoagulantes como el ácido etilendiaminotetracético (EDTA) o citrato de sodio pueden ser utilizados con resultados comparables. Si se recoge una cantidad diferente de la sangre, los siguientes pasos en el protocolo deben adaptarse en consecuencia.
   2. Cuidadosamente transfiera sangre dibujada en un tubo cónico de 50 mL. Diluir la sangre con la misma cantidad de tampón fosfato salino (PBS) sin calcio y magnesio.
   3. Añadir 15 mL de medio de gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll) a la parte inferior de un tubo cónico de 50 mL nuevo y cuidadosamente recubierto la sangre diluida en la parte superior medio de gradiente de densidad, evitando cualquier mezcla entre el medio de gradiente de densidad y la sangre diluida.
      Nota: Este es un paso fundamental para una adecuada separación de PBMCs de glóbulos rojos.
   4. Centrifugar a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT), con ningún freno para evitar la interrupción de la interfaz.
   5. Después de la centrifugación, cuidadosamente aspirar la capa superior con una pipeta y descartarlo, prestando atención para no eliminar las células en la interfase entre el plasma y densidad gradiente medio, que es donde PBMCs laminadas. Recoger tantas células como sea posible desde la interfaz sin tocar el sedimento de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo cónico de 50 mL y transferencia a un nuevo tubo cónico de 50 mL.
   6. Añadir PBS para llevar el volumen final de 25 mL e invertir varias veces para mezclar. Centrifugar a 300 x g por 10 min a temperatura ambiente con el freno en para eliminar cualquier contaminación medio gradiente de densidad de la suspensión de células.
   7. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin inquietante el sedimento celulares. Añadir PBS para llevar el volumen final de 25 mL e invertir varias veces para mezclar. Centrifugue a 200 x g durante 10 min a temperatura ambiente con el freno a quitar las plaquetas.
   8. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Resuspender PBMCs en 1 mL de PBS/0.1% de azida de sodio. Azida sódica reduce tapado, vertimiento, internalización de los anticuerpos y aumento de la recuperación de la célula, pero su toxicidad puede afectar la viabilidad celular. Por esta razón, azida de sodio se debe evitar en todos los pasos si las células se cultivan para experimentos posteriores. Aislamiento de células y tinción sin azida de sodio dieron resultados similares a la coloración realizada en presencia de azida sódica.
      PRECAUCIÓN: Azida de sodio puede causar la muerte al afectar el sistema nervioso central. Contacto puede causar quemaduras en la piel y los ojos.
   9. Diluir las células para contar mediante la transferencia de 30 μl de PBMCs en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Luego agregar 120 μl de PBS y 150 μL de azul tripán para determinar el numero de celular y viabilidad (dilución 1:10 de la célula). Resuspender cuidadosamente.
   10. Transferir 10 μL en un hemocitómetro, conteo de las células por consiguiente a la cuenta usada cámara y determinan el número de células viables. Células viables = número de Trypan azul negativo células total x 10 (el factor de dilución utilizado en este protocolo) x 10⁴.
       Nota: En promedio, 7-15 x 10⁶ de PBMCs deben ser recogidos en 10 mL de sangre.
   11. Resuspender las células en 10 x 10⁶ / mL de PBS/0.1% de azida de sodio
       Nota: PBMC puede ser congelado y almacenado en nitrógeno líquido durante un período prolongado de tiempo. Sin embargo, la expresión de marcadores como receptores del chemokine puede modificarse por este procedimiento.
2. Preparación de células de PBMC congelado
   Nota: diversos procedimientos de congelación pueden afectar la recuperación y la viabilidad de la célula¹². PBMCs de estos experimentos fueron congelados en especialmente formulados congelación medios o suero bovino fetal (FBS)/10% dimetil sulfóxido (DMSO) con resultados similares.
   PRECAUCIÓN: DMSO puede ser ligeramente peligroso en caso de inhalación (irritante del pulmón), contacto (irritativa, permeator), de contacto con los ojos (irritante), de la ingestión de la piel.
   1. Quitar congelado PBMC de nitrógeno líquido y coloque en hielo. Transferir el cryovial de hielo directamente en el baño de agua de 37 ° C. Mantener la cryovial en la superficie del agua y agítelo suavemente los frascos hasta que queden de un pellets de hielo. Transferencia de la cryovial en el hielo.
   2. Quite el agua con un trapo rociado de etanol 70%. Lentamente agregar 1 mL de PBS/0.1% de azida de sodio a 4 ° C y transferir cuidadosamente el celular a un tubo cónico de 15 mL. Lentamente añadir azida de sodio PBS/0.1% frío a 4 ° C hasta un volumen final de 15 mL.
   3. Centrifugar a 300 x g durante 10 minutos Retire con cuidado el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL de PBS/0.1% de azida de sodio.
      Nota: Las células también pueden ser suspendidas en RPMI 10% FBS con resultados similares.
   4. Diluir el celular para contar mediante la transferencia de 30 μl de PBMCs en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Luego agregar 120 μl de PBS y 150 μL de azul tripán para determinar el numero de celular y viabilidad (dilución 1:10 de la célula). Resuspender cuidadosamente.
   5. Transferir 10 μL en un hemocitómetro, conteo de las células por consiguiente a la cuenta usada cámara y determinan el número de células viables. Células viables = número de Trypan azul negativo células total x 10 (el factor de dilución utilizado en este protocolo) x 10⁴.
   6. Resuspender las células en 10 x 10⁶ / mL en PBS/0.1% de azida de sodio.
3. Preparación de las células de la sangre entera
   1. Extraer la sangre en un tubo de tapa verde 10 mL que contiene heparina sódica. Después de que el tubo se ha llenado de sangre, inmediatamente para invertir el tubo varias veces para prevenir la coagulación.
      Nota: Tubos con otros anticoagulantes como EDTA o citrato de sodio puede ser utilizado con resultados comparables. Si se recoge una cantidad diferente de la sangre, los siguientes pasos en el protocolo deben adaptarse en consecuencia.
   2. Transfiera 200 μL de sangre entera a un tubo de 12 x 75 mm tope, añadir 2 μl de azida de sodio y agitar suavemente durante 2 s.

2. células de tinción

Nota: Elegir pares de fluorocromos con solapamiento espectral prácticamente no es importante para reducir la propagación de datos debido a la alta derrame de un fluorocromo en el otro detector de fluorocromo. Para lograr una identificación óptima de todos los subconjuntos de la célula, fluorocromos con un rendimiento de alto cuántico puede usarse como anticuerpo pares PE-BV421 y PE-APC.

1. Tinción de PBMC fresco y congelado
   1. Transferir 100 μl de PBMC (1 x 10⁶ células) a una placa de 96 pocillos fondo V.
      Nota: Puede utilizarse cualquier número menor que 1 x 10⁶ células con similares resultados².
   2. Centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Añadir a cada pozo 100 μl de PBS con un tinte live/dead fijable que reacciona con la amina libre de proteínas durante 10 min a las células muertas de la etiqueta.
   3. Preparar para cada muestra 30 μl de una mezcla que contiene todos los anticuerpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ en fluorchrome A y anti-CD4, CD8, CD19, CD14 en fluorchrome B). Concentración de anticuerpos se indican en el cuadro 1 y cuadro 2. En esta etapa, titulados anticuerpos contra moléculas diferentes y en diferentes fluorocromos se pueden agregar así (p. ej., tabla 3).
      Nota: Concentración de anticuerpos puede variar dependiendo del fabricante y número de lote. Por lo tanto, las pruebas preliminares deben hacerse para lograr la óptima de la señal. PBS, PBS/0.5% BSA, azida de sodio PBS/0.2% o PBS/0.5% BSA/0.1% de azida de sodio se utilizaron con resultados similares para diluir anticuerpos². Celular también puede ser teñido en volúmenes diferentes de 30 μL integrar fácilmente esta metodología ya existentes protocolos de tinción.
   4. Centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Añadir el cóctel de anticuerpos a cada pocillo y resuspender cuidadosamente sin generar burbujas. Incubar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      Nota: Es posible teñir las muestras a 4 ° C con resultados similares.
   5. Añadir 150 μL de tampón de tinción y centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Resuspender las células en 200 μL de PBS y adquirir datos en un citómetro de flujo. Si se cambian los volúmenes de tinción, asegúrese de que al menos una dilución de 20-fold de la mezcla original de anticuerpo utilizada para lavar el exceso de anticuerpos.
      Nota: Células pueden fijo con en PBS/2% paraformaldehido, guardadas en un refrigerador a 4 ° C durante la noche y luego adquiridas en un citómetro de flujo al día siguiente.
      PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es dañino si es ingerido y puede causar irritación de la piel
2. Manchas de sangre
   1. Añadir a cada tubo de 12 x 75 mm tope, el cóctel de anticuerpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorocromo A, y anti-CD4, CD8, CD19, CD14 en fluorocromo B) e incubar a temperatura ambiente por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Concentración de anticuerpos se indican en la tabla 4. En esta etapa, contiene anticuerpos contra moléculas diferentes y en diferentes fluorocromos pueden añadirse también. Concentración de anticuerpo puede variar dependiendo del fabricante y número de lote. Por lo tanto, las pruebas preliminares deben hacerse para lograr la óptima de la señal.
      Nota: Es posible teñir las muestras a 4 ° C con resultados similares.
   2. Centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Hacer una solución de 1 x del buffer de lisis de glóbulos rojos siguiendo las instrucciones del fabricante.
      Nota: La solución de lisis debe ser a temperatura ambiente antes de usar.
   3. Añadir 2,0 mL de 1 x de tampón de lisis de eritrocitos a cada tubo, tapa bien e invertir varias veces para mezclar. Cubrir con papel aluminio y dejar reposar durante 15 minutos.
   4. Desactivación a 300 x g por 5 minutos cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares.
   5. Añadir 2 mL de PBS y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
      Nota: en este punto, el precipitado de células debe tener una coloración blanco pálida indicando una lisis de eritrocitos exitoso. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante para no perturbar el sedimento celulares y resuspender suavemente las células en 200 μL de PBS.
   6. Colar las células a través de tubos de 12 x 75 mm con tapas de filtro de 40 μm para remover agregados de células y adquirir datos en un citómetro de flujo.

3. titulación de anticuerpos

Nota: Titulación de anticuerpos es el paso más crítico para la obtención de datos de alta calidad, reproducibles. La titulación de anti-CD3-CD8,-CD14, CD19 y - TCR γδ sigue el procedimiento estándar por el cual la concentración de anticuerpos óptimo separar picos positivos y negativos se deriva de máxima tinción índice^13,14. Diluciones en el pico o cerca del pico en el lado ascendente de la curva de índice de mancha deben ser seleccionada (Figura 1A-C). El anticuerpo anti-CD4 se titula para colocar el pico de la población positivo CD4 entre poblaciones positivo solo CD3 y CD3 + / CD8 + T células, más cerca a la señal positiva solo CD3 para discriminar mejor las poblaciones de CD8dim (células T NK y CD8 + células de T del γδ). En la misma línea, las células CD56 titulación pretende posición NK CD56⁺ entre el CD3⁺ y el CD3^– población.

1. Curva de índice máximo de la mancha
   Nota: la titulación de anti-CD3-CD8,-CD14, CD19 y - TCR γδ sigue el procedimiento estándar por el cual la concentración de anticuerpos óptimo separar picos positivos y negativos se deriva tinción índice curva¹⁵como máximo. Si se añaden anticuerpos contra otros marcadores en el panel, también deba titularse con una máxima curva de índice tinción.
   1. Preparar una dilución del anticuerpo 2 veces llenando 10 pocillos de una placa de 96 pocillos con 40 μl de tampón de tinción. En el primer pozo, aumentar el volumen final a 80 μl de tampón de tinción y añadir el anticuerpo de interés en una concentración 4 veces la concentración sugerida por el fabricante.
   2. Mezcle bien y transfiera 40 μl al segundo pocillo. Mezcla bien y repita este paso para los todos los otros pozos.
   3. Mancha de 10 muestras de sangre entera o de PBMC con 30 μl de las diluciones de 2 dobleces diferentes 10 de anticuerpos siguiendo el protocolo descrito antes.
   4. Adquirir datos con un citómetro de flujo y la trama de la señal de cada dilución (figura 1A).
   5. Puerta en las poblaciones de positivas y negativas para cada concentración de anticuerpo. Aumento de la concentración de anticuerpos puede conducir a un mayor fondo. Por lo tanto, cambiar el tamaño de la puerta negativa en consecuencia.
   6. Para cada concentración de anticuerpo, extraer información de la mediana y la desviación estándar para la intensidad fluorescente de la población negativa y la mediana de la intensidad fluorescente de la población positivo. Calcular para cada concentración de anticuerpo el índice de la mancha con esta fórmula: (mediana intensidad fluorescente de la población positiva: mediana intensidad fluorescente de la población negativa) ÷ (2 x desviación estándar de la intensidad fluorescente de la negativo de población) (figura 1B).
   7. Parcela las mancha índice vs. la concentración de anticuerpo expresada como fracción de la dilución del anticuerpo (por ejemplo, 1:10 dilución = 0.1) y determinar la concentración de anticuerpo con el valor del índice máximo de la mancha (figura 1).
2. Titulación de anticuerpo anti-CD4 y - CD56
   Nota: titulación de anticuerpos Anti-CD4 y - CD56 basa en la titulación anterior los otros marcadores en el panel de dos fluorocromo. Para el anticuerpo anti-CD4 la titulación tiene como objetivo colocar el anti-CD4 de señal entre el CD8 doble⁺/CD3⁺ señal y el CD3 solo población positiva (figura 1).
   1. Valorar el anti-CD4 y CD56 anticuerpos con una estrategia de dilución 2 veces como descrito antes, añadiendo concentraciones adicionales en medio para finalmente identificar el rango de concentración que permiten separar CD4⁺ T las células y las células NK de la otra célula poblaciones.
   2. Valorar el anticuerpo anti-CD4 colocando la señal anti-CD4 entre CD8 doble⁺/CD3⁺ señal y el CD3 solo población positiva (figura 1).
      Nota: Cuidado especial se debe hacer para separar claramente CD4⁺ T células de CD8⁺ dim poblaciones.
   3. Valorar el anticuerpo anti-CD56 siguiendo una estrategia similar a la valoración de anticuerpos anti-CD4, colocando las células NK entre el CD3 negativo y las poblaciones de CD3-positive.

4. estrategia de control

1. Identificar poblaciones de la célula monocítica y linfocítica y eliminar las células muertas y la mayoría de los eritrocitos residuales del análisis.
   1. Seleccionar toda la población que contiene linfocitos y monocitos basadas en el área de dispersión hacia adelante vs lado (FSC-A vs SSC-A). Remover agregados de células desde el análisis a través de dispersión hacia adelante vs scatter delantero ancho (FSC-H vs FSC-W) y lado dispersión vs lado dispersión ancho (SSC-H vs SSC-W).
   2. Use un marcador vivo o muertos discriminación excluir brillantes positivo células muertas y glóbulos rojos residuales del análisis. Puerta en linfocitos y monocitos basados en los diferentes perfiles A de FSC y SSC-A.
2. Dos fluorocromo marcador siete estrategia bloquea de la población linfocítica.
   Nota: en el subgrupo positivo de CD3, CD4⁺, CD8⁺ y las células de T del γδ se pueden separar utilizando anticuerpos dirigidos exclusivamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera similar, dentro del subgrupo negativo CD3, las células B, células NK y monocitos pueden identificarse unívocamente usando los anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente.
   1. Seleccione la puerta de linfocito y crear una trama de punto con en cada eje de dos fluorocromos utilizados en este protocolo (figura 2B).
   2. Puerta en CD8⁺ T células identificadas como CD3⁺/CD8⁺ dobles células positivas en la esquina superior derecha de la trama de puntos (figura 2B). Excluir la población CD8 dim que podría contener las células NKT. Puerta en CD4⁺ T células identificadas como población entre CD8⁺ T las células y el CD3 solo poblaciones positivo. Puerta en las células de T del γδ identificado como células CD3 alta. Subdividen a las células de T del γδ en CD8 positivo y CD8 negativo.
   3. Puerta de las células NK identificadas como la población entre CD3-positive y células CD3 negativas. Subdividen a las células NK CD8 positivo y CD8 negativo. Puerta en las células de B identificado como CD19 CD3 negativo⁺ población en la esquina derecha inferior de la trama de punto.
   4. Seleccionar las puertas de monocito y crear una trama de punto con en cada eje de dos fluorocromos utilizados en este protocolo (figura 2). Puerta en el CD3^–/CD14⁺ población.

Resultados

Configuración y análisis de un experimento de citometría de flujo de células humanas de sangre periféricas teñidas con siete marcadores de linaje (anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-anticuerpos de CD19, CD56 y - TCR γδ) usando sólo dos fluorocromos se presentan.

Se describen resultados representativos para anti-CD8 y - CD56 titulación de anticuerpos. Para cada anticuerpo (en este ejemplo, anti-CD8), se registraron datos de diez ...

Discusión

El protocolo presentado aquí se ha demostrado para ser bastante flexible e insensible a los cambios en la coloración de tampón, la temperatura y la preparación de células de sangre periférica debido a la alta expresión de marcadores de linaje en la superficie celular. El paso más crítico para obtener datos reproducibles y de alta calidad, es la titulación de anticuerpos. De la nota, ya que la titulación de anticuerpos debe realizarse siempre durante la instalación de un panel de citometría de flujo, este pas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3	BD Biosciences	562426	Antibody for staining RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Antibody for staining RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Antibody for staining RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Antibody for staining RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Antibody for staining RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Antibody for staining RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Antibody for staining RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Antibody for staining RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Antibody for staining RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Antibody for staining RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Antibody for staining RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Antibody for staining RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Antibody for staining RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Antibody for staining RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Antibody for staining RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Antibody for staining RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Antibody for staining RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Antibody for staining RRID: AB_2744293
Dead cells	Life technologies	L-23105	Live/dead discrimination
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube	BD Bioscience	352001	to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo fisher	12648010	Freezing cells
96-well V-bottom plate	Thermo fisher	249570	plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences		Flow cytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS analysis
Graphpad Prism	GraphPad software		Data analysis