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요약

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

초록

면역 세포 특성화는 무 겁 게 차동 식 표면 표식에 따라 모집단을 식별 하기 위해 여러 가지 빛깔 cytometry에 의존 합니다. 클래식 멀티 컬러 패널의 설치에는 최고급 악기, 사용자 지정 레이블이 지정 된 항 체, 및 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 주의 깊은 연구 디자인 필요 합니다. 우리 주요 면역 인구를 식별 하는 multiparametric 분석 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 두 형광을 사용 하 여 7 개의 혈통 마커를 결합 하 여 말 초 혈액에서. 우리의 전략은는 혈통 마커 독특한 조합에 각 세포 인구에 의해 표현 됩니다 끊임없이 관찰을 기반으로 합니다. 항 체의 주의 적정와 함께이 정보를 결합 하 여 대부분 교류 cytometers의 광학 제한 확대 5 추가 마커를 기록 하는 조사 수 있습니다. 머리 비교 시연 주변 혈액에서 면역 세포 인구의 대다수 우리의 방법과 고전적인 "한 형광 색소 1 마커 접근", 사이 대 등 한 정확도로 나타낼 수 있다 비록 후자는 여전히 NKT 세포 등 γ T 세포 인구를 식별 하는 데 더 정확 하다 두 형광을 사용 하 여 7 개의 마커를 결합 하 여 복잡 한 면역 세포 인구와 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers, 그리고 한정 된 자원 가진 지역에서 2-3 형광 색소 필드 악기에도 임상 샘플의 분석에 대 한 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 달성 하기 위해 여분의 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 여러 세포 인구를 심사 적합 합니다.

서문

Cytometry 이벤트 두 번째1당 몇 천의 속도로 단일 입자에 여러 매개 변수를 분석 하에 개발 된 기술입니다. 표본 cytometry 분석의 예는 포함 되지만 셀, 구슬, 박테리아, 소포 및 염색체에 국한 되지 않습니다. 유체 시스템 어디 하나 이상의 레이저와 그것의 경로 교차 하는 각 입자 및 여러 매개 변수는 추가 분석을 위해 기록 됩니다 심문 지점에서 입자를 지시 합니다. 앞으로 및 측면 살포, 순수한 레이저 빛의 산란에 의해 생성 된 대상 인구를 식별 하 고 각각 상대적인 크기와 입자의 내부 복잡성/단위에 대 한 정보를 검색 하는 데 사용 됩니다. 모든 다른 매개 변수, 흐름 cytometric 분석에서 데이터의 대부분을 담당 하는 형광 색소 표시 된 조사는 인식 하 고 바인딩할 특정 대상의 입자에 의해 파생 됩니다.

Cytometry 면역학 연구 특성화 세포 인구를 식별 하는 기본 도구입니다. 면역 시스템의 복잡성을 해 부하 다 색 패널은 세포 인구1의 깊은 immunophenotyping 동시에 기록 하는 마커의 수를 확장할 끊임없이 진화 된다. 이것은 20 형광 매개 변수를 초과 하는 최근 하이 엔드 흐름 cytometers 형광, 및 더 많은 능력의 개발을 선도 합니다. 이 결과 형광 색소 스펙트럼 중복으로 인해 복잡 한 연구 디자인 및 사용자 지정 항 체 라벨 및 숙련 된 연산자와 관련 된 높은 비용. 여러 인스턴스, 복잡성 및 비용 다른 세포 인구에 대 한 마커의 별도 패널을 사용 하 여 감소 된다. 그러나이 방법은, 오류가 발생 하기 쉬우며, 각 패널에 정보를 감소 이며 세포의 제한 된 수의 샘플에 적용 하기 어려울 수 있습니다. 또한, 적은 형광 매개 변수를 가진 계기에 깊은 immunophenotyping을 걸로 하겠습니다 마커 수 증가. 우리는 이전 주요 면역 인구를 식별 하는 얼룩 프로토콜을 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 7 혈통 마커를 사용 하 여 결합 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 7 대신만 두 형광 전통적인 "한 형광 색소 1 마커" 접근 (www.hcdm.org)2,3를 사용 하 여 필요 합니다. 우리의 초기 보고서 탐색 하 고 깊은 immunophenotyping에 대 한 두 가지 형광에 7 개의 마커를 결합의 개념을 확인. 이 보고서에서 우리는 단계에 의해 단계 프로토콜을 분리 하 고 주변 혈액 세포, 얼룩를 제시 하는 실용적인 측면에 초점을 맞추고 및 성공적인 얼룩을 달성 하는 단계를 문제 해결.

이 프로토콜은 그 혈통 마커 상수 식 세포 표면에 있고 각 셀 인구는 혈통 마커의 독점 조합 관찰을 기반으로 합니다. PBMCs에서 CD3 식 다시 나눈다 면역 세포 두 가지 주요 범주로: CD3 양성 T 림프 톨 및 CD3-부정적인 세포. CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여. 표준 한 형광 색소 1 마커 접근, 안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-7 다른 형광 CD19-CD56, TCR-γ 항 체는 검출. 우리의 접근 방식, 결합 한 안티-CD3-CD56, 그리고 한 형광 색소 (형광 색소 편의 A에 대 한 분류) 및 안티-CD4-TCR γ 항 체-CD8,-CD14와-CD19 항 체에 다른 형광 색소 (형광 색소 B). 이 항 체 적정 및 차동 항 식의 조합에 의해 가능 하다. 두 CD4+ 와 CD8+ T 세포에 형광 색소, 안티-CD3 항 체에 대 한 긍정적인 하지만 형광 B는 CD8 사이 CD4 신호를 ad hoc 적정으로 배치 하면서 CD8 신호 표현의 극대화 색소에서 분리 될 수 있다 고 CD3 이중 부정 긍정적인-CD4/CD8 세포. Γ T 세포 표현 보다는 c d 4와 CD8, CD3의 높은 수준 그리고 그러므로 그들은 CD3 높은4로 식별할 수 있습니다. 이 신호는 라벨 γ 형광 색소 A CD3 낮은 T 세포와 CD3 높은 γ T 세포 구분 개선 한 안티 TCR γ 항 체와 T 세포에 의해 더 밀어 주었다. B 세포는 c d 3로 확인 될 수 있다- 형광 색소 A와 CD19+ 형광 색소 나에 CD3 부정적인 NK 세포 B 세포에서 분리, 안티 CD56 항 체는 형광 색소 A에에서 안티-CD3으로 사용 되었다. CD56 CD3 T 세포5보다 훨씬 낮은 수준에서 NK 세포에 표현 했기 때문에 이것이 가능 합니다. 마지막으로, monocytes는 앞으로 사이드 분산형 속성 및 형광 색소 B. CD14의 식의 조합을 통해 확인할 수 있습니다.

2 형광을 사용 하 여 최대 4 개의 마커를 결합의 아이디어6,7,8, 전에 이미 성공적으로 시도 하 고 악성 림프 인구9 식별 하는 임상 프로토콜에 사용 되었습니다. . 이전 보고서는 또한 7 개의 마커를 결합 (다른 특이성 표식에서와 우리가 우리의 프로토콜에서 사용 하는 보다) 다양 한 양의 형광 색소10각 항 체의 복잡 한 라벨에 의존 2 개의 형광, 하지만이 방법을 사용 하 여. 이 대조적으로 우리의 메서드는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하 여 악기 구성에 적용할 수 있습니다 하 고 고분자 형광의 새로운 세대를 활용할 수 있습니다.

이 방법론의 전반적인 목표 대부분 교류 cytometers 복잡 한 세포 인구가 5 추가 마커의 녹음에 대 한 수의 광학 한계를 확장 하는 것입니다. 결과적으로, 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers에 고급 면역학 분석을 수행할 수 있습니다 그리고 2-3 형광 색소 필드 악기 한정 된 자원 가진 지역에서 놀라운 결과 얻을 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 수행 하 고 동일한 시간11에서 여러 계보를 대상으로 하는 cytometric 패널 모듈형 흐름을 만들려면 추가 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 잠재적으로 모듈형 immunophenotyping cytometry에 사용 되는 패널의 수를 감소 하 고 비용, 오류 및 처리 시간을 줄일 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 적합 합니다.

프로토콜

인간의 물질의 모든 연구는 건강 보험 이동성 및 책임에 관한 법률에서 존스 홉킨스 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 환자 및 제어 샘플 드 확인 했다입니다. PBMCs와 건강 한 컨트롤에서 혈액은 동의 의해 얻은 했다.

참고: 이 프로토콜에 갓 테스트 되거나 고립 된 냉동 주변 혈액 세포와 전체 혈액.

1. 세포 준비

  1. 전체 혈액에서 주변 혈액 세포 (PBMC)의 절연
    1. 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
      참고: 튜브 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 또는 나트륨 시트르산 등 다른 응고 제를 포함 하는 비교 결과 함께 사용할 수 있습니다. 혈액의 다른 금액을 수집 하는 경우 프로토콜에는 다음 단계 따라 조절 한다.
    2. 신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브로 그려진된 혈액 전송. 칼슘과 마그네슘 없이 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 동일한 금액으로 혈액을 희석.
    3. 새로운 50 mL 원뿔 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체 (예: Ficoll)의 15 mL를 추가 하 고 신중 하 게 피하는 어떤 혼합 밀도 그라데이션 매체 위에 희석된 혈액 오버레이 밀도 그라데이션 매체와 희석된 혈액 사이.
      참고: 이것은 적혈구에서 PBMCs의 적절 한 분리에 대 한 중요 한 단계 이다.
    4. 인터페이스의 혼란을 피하기 위해 아무 브레이크 (RT), 실 온에서 30 분 400 x g 에서 원심.
    5. 원심, 후 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여 상위 계층을 발음 하 고 플라즈마 및 밀도 그라데이션 매체, PBMCs stratifies는 그 사이의 인터페이스에서 세포를 제거 하지 주목, 그것을 폐기. 50 mL 원뿔 튜브와 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 하단에 레드 셀 펠 릿을 건드리지 않고 인터페이스에서 가능한 많은 세포 수집 합니다.
    6. 하 마지막 볼륨 25 ml를 섞어 여러 번 반전 PBS를 추가 합니다. 세포 현 탁 액에서 밀도 그라데이션 중간 오염을 제거 하에 브레이크 RT에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심.
    7. 신중 하 게 방해 셀 펠 릿 없이 상쾌한 발음. 하 마지막 볼륨 25 ml를 섞어 여러 번 반전 PBS를 추가 합니다. 제거 혈소판에 브레이크와 RT에 10 분 동안 200 x g 에서 원심.
    8. 조심 스럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 mL에 PBMCs를 resuspend. 나트륨 아 지 드 상한, 흘리기, 항 체, 및 증가 세포 복구, 국제화 줄어들지만 그 독성 세포 생존 능력을 손상 할 수 있다. 이러한 이유로, 나트륨 아 지 드 피해 야 한다 모든 단계에 경우 셀 후속 실험에 대 한 경작 될 것 이다. 셀 고립과 나트륨 아 지 드 없이 얼룩 착 나트륨 아 지 드의 수행에 비슷한 결과 주었다.
      주의: 나트륨 아 지 드 중앙 신 경계에 영향을 미치는 죽음을 발생할 수 있습니다. 연락처는 피부와 눈에 화상을 일으킬 수 있습니다.
    9. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 PBMCs의 30 µ L를 전송 하 여 계산에 대 한 셀을 희석. 그런 다음 추가 PBS의 120 µ L의 휴대폰 번호 및 생존 능력 결정 Trypan 블루 150 µ L (1시 10분 희석 셀). 신중 하 게 resuspend.
    10. 10 µ L hemocytometer, 수를 셀 따라 사용 계산을 챔버 가능한 셀의 수를 결정에 전송. 실행 가능한 세포 Trypan 블루 부정적인 세포 총 x 10 (이 프로토콜에 사용 되는 희석 요소)의 수 = x 104.
      참고: 에 평균, 7-15 x 106 PBMCs의 혈액 10 mL에서 수집 한다.
    11. PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 mL 당 10 x 106 셀 resuspend
      참고: PBMC 냉동 고 시간의 연장된 기간에 대 한 액체 질소에 저장 될 수 있습니다. 그러나, 마커 chemokine 수용 체 등의 표현이이 절차에 의해 변경할 수 있습니다.
  2. 냉동된 PBMC에서 셀의 준비
    참고:     다른 동결 절차 셀 복구 및 생존12에 영향을 미칠 수. 이러한 실험에 대 한 PBMCs 미디어 또는 소 태아 혈 청 (FBS)/10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 비슷한 결과 특별히 공식화 냉동.
    주의: DMSO는 흡입 (폐 자극)의 경우 약간 위험할 피부 접촉 (자극성, permeator), 섭취 (자극), 눈 접촉의 수 있습니다.
    1. 액체 질소에서 냉동된 PBMC를 제거 하 고 얼음에. 37 ° C 물 욕조에 직접 얼음에서는 cryovial를 전송. 수 면에는 cryovial를 유지 하 고 작은 얼음 펠 릿 남아 때까지 부드럽게 튜브를 흔들. 얼음에는 cryovial를 전송 합니다.
    2. 70% 에탄올 스프레이 지우기 모든 물을 제거 합니다. 4 ° C에서 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 mL를 천천히 추가 하 고 신중 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 셀을 전송. 천천히 15 mL의 최종 볼륨에 도달을 4 ° C에서 찬 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드를 추가 합니다.
    3. 10 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기 조심 스럽게 제거 표면에 뜨는, resuspend 셀 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 ml.
      참고: 셀 RPMI에 resuspended도 수 10 %FBS 비슷한 결과 함께.
    4. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 PBMCs의 30 µ L를 전송 하 여 계산에 대 한 셀을 희석. 그런 다음 추가 PBS의 120 µ L의 휴대폰 번호 및 생존 능력 결정 Trypan 블루 150 µ L (1시 10분 희석 셀). 신중 하 게 resuspend.
    5. 10 µ L hemocytometer, 수를 셀 따라 사용 계산을 챔버 가능한 셀의 수를 결정에 전송. 실행 가능한 세포 Trypan 블루 부정적인 세포 총 x 10 (이 프로토콜에 사용 되는 희석 요소)의 수 = x 104.
    6. PBS/0.1% 나트륨 아 지 드에 mL 당 10 x 106 셀 resuspend
  3. 전체 혈액에서 세포의 준비
    1. 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
      참고: 나트륨 구 연산 염 또는 EDTA 비교 결과 함께 사용할 수 있습니다와 같은 다른 응고 제를 포함 하는 튜브. 혈액의 다른 금액을 수집 하는 경우 프로토콜에는 다음 단계 따라 조절 한다.
    2. 12 x 75mm 출장 관에, 나트륨 아 지 드와 부드럽게 2에 대 한 소용돌이의 2 µ L을 추가 전체 혈액의 200 µ L s.

2. 세포 얼룩

참고: 사실상 더 스펙트럼 중복 형광의 쌍을 선택 하는 것이 다른 형광 색소 검출기에 형광 색소의 높은 파급으로 인해 데이터의 확산을 줄이기 위해 중요 합니다. 위해 알의 최적의 식별 셀 하위 집합, 높은 양자 수율과 형광 항 체 쌍 PE BV421와 PE APC 사용 되어야 한다.

  1. 신선 하 고 냉동 PBMC의 얼룩
    1. 96-잘 V-하단 플레이트에 PBMC (1 x 106 셀)의 100 µ L를 전송 합니다.
      참고: 비슷한 결과2셀 1 x 106 보다 낮은 수를 사용할 수 있습니다.
    2. RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 죽은 세포를 10 분 동안 단백질에 자유로운 아민과 반응 하는 라이브/죽은 고칠 수 염료를 포함 하는 PBS의 각 잘 100 µ L를 추가 합니다.
    3. 모든 항 체를 포함 하는 혼합의 각 샘플 30 µ L에 대 한 준비 (안티-CD3.-CD56, fluorchrome A, 및 안티-CD4, CD8, CD19, fluorchrome B에에서 CD14 TCRγδ). 항 체의 농도 표 1 과 테이블 2에 표시 됩니다. 이 단계에서 다른 표적 분자와 다른 형광에 적정 한 항 체도 추가 될 수 있다 (예를 들어, 표 3).
      참고: 항 체 농도 및 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 예비 테스트 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행 되어야 합니다. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% 나트륨 아 지 드 또는 PBS/0.5% BSA/0.1% 나트륨 아 지 드 항 체2희석 비슷한 결과 함께 사용 되었다. 셀도 쉽게 통합이 방법론에 이미 30 µ L에서 다른 볼륨에 얼룩이 질 수 있다 얼룩 프로토콜.
    4. RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 각 잘 하 항 체 칵테일을 추가 하 고 거품을 생성 하지 않고 신중 하 게 resuspend. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어.
      참고: 그것은 비슷한 결과와 4 ° C에서 샘플 얼룩 수 있습니다.
    5. RT에 3 분 동안 350 x g 에서 얼룩 버퍼 및 원심 분리기의 150 µ L을 추가 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. PBS의 200 µ L에서 세포를 resuspend 하 고 데이터 흐름 cytometer에. 얼룩 볼륨 변경 되 면 항 체의 과잉을 세척 하는 데 사용 하는 원래 항 체 혼합의 적어도 20-fold 희석을 확인 하십시오.
      참고: 스테인드 세포는 PBS/2% paraformaldehyde에 고정, 4 ° C에서 냉장고에 하룻밤 보관 고 교류 cytometer에 취득 다음 날 될 수 있습니다.
      주의: Paraformaldehyde가 이다 삼 하 고 피부 자극을 일으킬 수 있는 유해
  2. 전체 혈액의 얼룩
    1. 각 12 x 75mm 출장 관 추가 항 체의 칵테일 (안티-CD3.-CD56, 형광 색소 A, 및 안티-CD4, CD8, CD19, 형광 색소에 CD14 TCRγδ B)와 RT에 RT에 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 항 체의 농도 표 4에 표시 됩니다. 이 단계에서 다른 표적 분자에 대하여 항 체를 적정 하 고 다른 형광에 추가할 수 있습니다 뿐만 아니라. 항 체 농도 및 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 예비 테스트 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행 되어야 합니다.
      참고: 그것은 비슷한 결과와 4 ° C에서 샘플 얼룩 수 있습니다.
    2. RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 제조업체의 지침에 따라 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 1 x 솔루션을 확인 합니다.
      참고: 세포의 용 해 솔루션 RT 사용 하기 전에 해야 합니다.
    3. 각 관에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1의 2.0 mL를 추가 하 고 잘 모자를 섞어 여러 번 반전. 호 일 커버 하 고 15 분 동안 앉아 보자.
    4. 5 분은 신중 하 게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 발음에 대 한 300 x g 에 아래로 회전 합니다.
    5. 5 분에 대 한 300 x g 에서 PBS 및 원심 분리기의 2 개 mL를 추가 합니다.
      참고:이 시점에서, 셀 펠 릿 있어야 성공적인 적혈구 세포를 나타내는 창백한 백색 채색 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 렛을 방해 하지를 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 PBS의 200 µ L에서 세포를 resuspend.
    6. 40 µ m 필터 캡 셀 집계를 제거 하 고 데이터 흐름 cytometer에 12 m m x 75 m m 튜브를 통해 세포를 변형.

3. 항 체 적정

참고: 항 체 적정 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계입니다. 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스13,14얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크에 가까이에 희석 되어야 합니다 (그림 1A-C)을 선택. 안티-CD4 항 CD3 단일 긍정적인 인구와 CD3 CD4 긍정적인 인구의 피크를 적정 + CD8 + T 세포, 더 가까이 더 나은 CD8dim 인구 (CD8 + γ T 세포와 NK T 세포)를 차별 CD3 단일 긍정적인 신호. 같은 라인을 따라 위치 NK CD56 CD56 적정 목표+ 는 CD3 사이 세포+ 그리고에서 CD3- 인구.

  1. 최대 얼룩 인덱스 곡선
    참고:     안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스 곡선15얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 다른 표식에 대 한 항 체는 패널에 추가 하는 경우 그들은 또한 최대 얼룩 인덱스 곡선으로 적정 해야 합니다.
    1. 2-fold 항 체 희석 버퍼 얼룩의 40 µ L로 96 잘 접시의 10 웰 스를 작성 하 여 준비 합니다. 첫 번째 잘에서 얼룩 버퍼의 80 µ L 최종 볼륨을 증가 하 고 농도 4 회 집중 제조 업체에 의해 제안에 관심의 항 체를 추가 합니다.
    2. 잘 혼합 하 고 두 번째 40 µ L을 잘 전송. 잘 혼합 하 고는 모든 다른 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다.
    3. 10 샘플 PBMC 또는 전체 혈액의 항 체 전에 설명 하는 프로토콜을 다음의 10 가지 2-fold 희석의 30 µ L 얼룩.
    4. 교류 cytometer와 데이터를 수집 하 고 각 희석 (그림 1A)에서 신호 플롯.
    5. 각 항 체 농도 대 한 부정적이 고 긍정적인 인구에 게이트. 항 체의 농도 증가 하는 것은 높은 배경 귀 이어질 수 있습니다. 따라서, 그에 따라 부정적인 게이트를 크기 조정 합니다.
    6. 각 항 체 농도 대 한 중간 및 부정적인 인구의 형광 강도 대 한 표준 편차 및 긍정적인 인구의 형광 강도 대 한 중간에 대 한 정보를 추출 합니다. 이 수식 사용 하 여 얼룩 인덱스 각 항 체 농도 대 한 계산: (긍정적인 인구의 중간 형광 강도-부정적인 인구의 중간 형광 강도) ÷ (2 x 표준 편차의 형광 강도 네거티브 인구) (그림 1B).
    7. 얼룩 인덱스 vs. 항 체 희석의 분수로 표현 하는 항 체 농도 플롯 (예, 1시 10분 희석 = 0.1), 최대 얼룩 인덱스 값 (그림 1C)와 항 체의 농도 확인 하 고.
  2. 안티-c d 4와-CD56 항 체 적정
    참고:     이전 적정 2 형광 색소 패널에 다른 마커 의존 안티-c d 4와-CD56 항 체 적정. 적정 배치 안티-CD4 목표로 안티 CD4 항 체에 대 한 이중 CD8 사이 신호+/CD3+ 신호와 CD3 단일 긍정적인 인구 (그림 1D).
    1. 적정 안티 CD4 및 이전에 설명한 대로 2-fold 희석 전략 CD56 항 체 CD4 분리를 허용 하는 가늘게 농도의 범위를 식별 하는 사이 추가적인 농도 추가+ T 세포 및 NK 세포는 다른 세포에서 인구입니다.
    2. 이중 CD8 사이 안티 CD4 신호를 배치 하 여 안티-CD4 항 체를 적정+/CD3+ 신호와 CD3 단일 긍정적인 인구 (그림 1D).
      참고: 특별 한 주의 CD4 명확 하 게 분리 할 수+ T부터 CD8 세포+ 인구를 흐리게.
    3. 다음 전략 비슷합니다-안티-CD4 항 체 적정, CD3-부정과 CD3 양성 인구 사이 NK 세포를 배치 하 여 안티 CD56 항 체 적정

4. 제어 전략

  1. 림프 및 monocytic 세포 인구를 식별 하 고 분석에서 죽은 세포 및 잔여 적혈구의 대부분을 제거 합니다.
    1. 림프 톨, monocytes 앞으로 대 면 산포 지역에 기반을 포함 하는 전체 인구를 선택 (FSC-A vs SSC-A). 앞으로 살포 높이 대 앞으로 분산형 폭 (FSC-H 대 FSC-W)를 통해 분석 및 측면 분산형 높이 대 측 분산형 폭 (SSC-H 대 SSC W)에서 셀 집계를 제거 합니다.
    2. 라이브/죽은 차별 마커를 사용 하 여 밝은 긍정적인 죽은 세포 및 잔여 적혈구는 분석에서 제외. 림프 톨, monocytes 다른 FSC-A와 SSC-A 프로 파일에 따라에 게이트.
  2. 2 형광 색소 7-마커 림프모구 인구의 제어 전략.
    참고:     CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여.
    1. 림프 구 게이트를 선택 하 고이 프로토콜 (그림 2B)에 사용 되는 두 개의 형광 중 각 축에 점이 음모를 만들.
    2. 게이트에 CD8+ T CD3 됨으로 셀+/CD8+ 더블 도트-줄거리 (그림 2B)의 오른쪽 상단 모서리에 긍정적인 세포. Dim CD8 인구 NKT 세포 포함 될 수를 제외 합니다. CD4에 게이트+ T 세포 CD8 사이 인구로 식별+ T 세포와는 CD3 단일 긍정적인 인구. Γ T 세포 높은 CD3 셀으로 식별에 게이트. Γ CD8 긍정적인 부정적인 CD8 T 세포를 분할 합니다.
    3. CD3 양성 사이 인구로 식별 하는 NK 세포와 CD3-부정적인 셀에 게이트. CD8 긍정적인 및 부정적인 CD8 NK 세포를 분할 합니다. 문 CD3 음수가 CD19로 식별 하는 B 세포에+ 점 플롯의 오른쪽 하단 모서리에 인구.
    4. Monocyte 게이츠를 선택 하 고이 프로토콜 (그림 2C)에 사용 되는 두 개의 형광 중 각 축에 점이 음모를 만들. 게이트는 c d 3에-/CD14+ 인구.

결과

설정 및 인간 주변 혈액 세포의 흐름 cytometry 실험의 분석 물 7 혈통 마커 (안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-CD19-CD56, TCR-γ 항 체)만 두를 사용 하 여 형광 표시 됩니다.

한 안티 CD8-CD56 항 체 적정 대표적인 결과 설명 합니다. 각 항 체에 대 한 (이 예제에서는 안티-CD8), 10 연속 2-fold 희석에서 데이터 얼룩 인덱스 곡선 (그림 1A-C)을 계...

토론

여기에 제시 된 프로토콜 매우 유연 하 고 변화 버퍼, 온도 및 셀 표면에 혈통 마커의 높은 표현으로 인해 주변 혈액 세포 준비 얼룩에 구분 표시 되었습니다. 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계는 항 체 적정. 주의 때문에 항 체의 적정 흐름 cytometric 패널의 설치 하는 동안 항상 수행 해야이 단계 추가 하지 않습니다 여분 벤치 타임 우리의 2-형광 색소 접근. 안티-CD3의 적정...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 연구는 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal와 피부 질환에 의해 지원 되었다 < https://www.niams.nih.gov/>, 보너스 번호 P30-AR053503; 스 테 블러 재단, www.stablerfoundation.org; 국립 연구소의 알레르기와 전염병, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; 니 나 아일랜드 프로그램 폐 건강 (NIPLH)에 대 한 https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

자료

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Dead cellsLife technologiesL-23105Live/dead discrimination
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap capBD Bioscience352235to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tubeBD Bioscience352001to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo fisher12648010Freezing cells
96-well V-bottom plateThermo fisher249570plate for staining
FACSAria IIu Cell SorterBD BiosciencesFlow cytometer
FCS Express 6De Novo SoftwareFACS analysis
Graphpad PrismGraphPad softwareData analysis

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