Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4⁺ e CD8⁺ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.

Resumo

Caracterização de células imunes depende fortemente de citometria de fluxo multicolor para identificar subpopulações baseadas na expressão diferencial de marcadores de superfície. A instalação de um painel multicolor clássico exige instrumentos high-end, anticorpos etiquetados personalizados e cuidadoso estudo design para minimizar a sobreposição espectral. Desenvolvemos uma análise Multiparamétrico para identificar grandes populações imunes humanas (CD4⁺ e CD8⁺ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) no sangue periférico pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas dois fluorochromes. Nossa estratégia é baseada na observação de que marcadores de linhagem constantemente são expressos em uma combinação única de cada população de células. Combinar essas informações com uma titulação cuidadosa dos anticorpos permite que os investigadores gravar cinco marcadores adicionais, ampliando o limite óptico da maioria dos citômetros. Head-to-comparação demonstrou que a grande maioria das populações de células imunes no sangue periférico pode ser caracterizada com precisão comparável entre nosso método e a clássico "abordagem um fluorocromo-um marcador", embora este último ainda é mais precisos para a identificação de populações, tais como células NKT e γδ T células. Combinar sete marcadores usando dois fluorochromes permite a análise de populações de células imunes complexos e amostras clínicas em 6-10 acessível fluorocromo citômetros e até mesmo em instrumentos de campo 2-3 fluorocromo em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda. Essa abordagem também é muito bem adequada para a seleção de várias populações de células, no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.

Introdução

Citometria de fluxo é uma técnica que foi desenvolvida para analisar vários parâmetros em partículas simples a uma taxa de vários milhares de eventos por segundo¹. Exemplos de espécimes analisados por citometria de fluxo incluem, mas não estão limitados a, células, miçangas, bactérias, vesículas e cromossomos. Um sistema fluídico direciona as partículas no ponto de interrogação, onde cada partícula cruza seu caminho com lasers de um ou mais, e vários parâmetros são gravados para posterior análise. Espalha para a frente e lateral, gerada pela dispersão da luz do laser puro, é usadas para identificar a população-alvo e recuperar informações sobre o tamanho relativo e a complexidade interna/granularidade de partículas, respectivamente. Todos os outros parâmetros, que representam a maioria dos dados em uma análise do fluxo cytometric, são derivados pelo fluorocromo-rotulado de sondas que reconhecem e ligam para alvos específicos das partículas de interesse.

Citometria de fluxo é uma principal ferramenta para estudos imunológicos identificar e caracterizar as populações de células. Para dissecar a complexidade do sistema imunológico, multicoloridos painéis estão constantemente evoluindo para ampliar o número de marcadores simultaneamente gravada para immunophenotyping profunda da célula populações¹. Isso está levando ao desenvolvimento de instrumentos mais capazes e fluorochromes, com recentes citômetros high-end, excedendo 20 parâmetros fluorescentes. Isso resulta em projeto de estudo complexo devido à sobreposição espectral fluorocromo e em custos mais elevados associados com operadores qualificados e rotulagem de anticorpo personalizado. Em vários casos, complexidade e os custos são reduzidos usando painéis separados de marcadores para populações de células diferentes. Esta abordagem, no entanto, está sujeita a erros, reduz as informações em cada painel e pode ser difícil de aplicar a amostras com um número limitado de células. Além disso, aumentar o número de marcadores impede profunda immunophenotyping em instrumentos com menos parâmetros fluorescentes. Anteriormente desenvolvemos um protocolo de coloração para identificar grandes populações imunes humanas (CD4⁺ e CD8⁺ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) pela combinação de sete marcadores de linhagem usando apenas duas fluorochromes em vez dos sete necessário usando o tradicional "um fluorocromo-um marcador" abordagem (www.hcdm.org)^2,3. Nosso relatório inicial explorado e validado a noção da combinação de sete marcadores em dois fluorochromes para immunophenotyping profundo. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo passo a passo para isolar e manchar as células do sangue periféricas, enfocando o aspecto prático e solução de problemas etapas para alcançar uma coloração bem sucedida.

Este protocolo é baseado na observação de que os marcadores de linhagem tem uma expressão constante na superfície das células e que cada população de células tem uma exclusiva combinação de marcadores de linhagem. Em PBMC, CD3 expressão subdivide as células imunes em duas categorias principais: linfócitos T CD3 positivo e células CD3-negativo. Dentro do subgrupo positivo CD3, CD4⁺, CD8⁺ e células γδ T podem ser separadas usando anticorpos que se destinam exclusivamente a CD4, CD8 e o receptor do γδ. De forma comparável, dentro do subgrupo negativo CD3, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente. Em uma abordagem padrão um fluorocromo-um marcador, anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e - TCR γδ anticorpos são detectados com sete diferentes fluorochromes. Nossa abordagem combina anti-CD3 - CD56 e anticorpos de - TCR γδ em um fluorocromo (rotulada para fluorocromo conveniência A) e anti-CD4,-CD8, - CD14 e - CD19 anticorpos em um fluorocromo diferente (fluorocromo B). Isto é possível por uma combinação de titulação de anticorpos e expressão diferencial do antígeno. Ambos os CD4⁺ e CD8⁺ T células são positivas para o anticorpo anti-CD3 em fluocromo A, mas eles podem ser separados em fluorocromo B maximizar a expressão do sinal CD8 ao colocar, com uma titulação ad hoc, o sinal de CD4 entre o CD8 e as células de CD3 positivo-CD4/CD8 dupla negativa. As pilhas de T do γδ expressa o nível superior de CD3 CD4 e CD8, e, portanto, eles podem ser identificados como CD3 alta⁴. Este sinal é ainda mais impulsionado pela rotulagem γδ células T em fluocromo A com um anticorpos anti-TCR γδ, melhorando assim, a separação entre as pilhas de T CD3 baixas e as células de alta γδ T CD3. As células B podem ser identificadas como CD3^– no fluocromo A e CD19⁺ em fluorocromo B. Para separar pilhas NK CD3 negativas de células B, um anticorpo anti-CD56 foi usado em fluocromo A como o anti-CD3. Isso é possível porque o CD56 expressa na célula NK em um nível muito inferior CD3 na T células⁵. Finalmente, os monócitos podem ser identificados através de uma combinação de propriedades de dispersão de lado para a frente e expressão de CD14 em fluorocromo B.

A ideia de combinar até quatro marcadores usando dois fluorochromes tem sido tentada já com êxito antes de^7,6,8e tem sido usada em um protocolo clínico para identificar populações linfocítica malignas⁹ . Um relatório anterior combinada também sete marcadores (com diferente especificidade dos marcadores do que usamos em nosso protocolo) usar dois fluorochromes, mas esta abordagem baseou-se em um complexo de rotulagem de cada anticorpo com quantidade variável de fluorocromo¹⁰. Isto está em contraste com o nosso método que utiliza anticorpos comercialmente disponíveis e pode ser adaptado para a configuração do instrumento e pode tirar proveito da nova geração de fluorochromes de polímero.

O objetivo geral desta metodologia é expandir os limites ópticos da maioria dos citômetros, permitindo a gravação de cinco marcadores adicionais para interrogar populações de células complexas. Como consequência, avançado análise imunológica pode ser realizada em 6-10 acessível fluorocromo citômetros, e instrumentos de campo 2-3 fluorocromo podem alcançar resultados notáveis em áreas com recursos limitados. Instrumentos high-end podem também beneficiar esta abordagem usando fluorochromes extras para realizar análise de citometria de fluxo mais profunda e criar modular fluxo cytometric painéis como alvo várias linhagens no mesmo tempo¹¹. Potencialmente, isso pode reduzir o número de painéis utilizados em citometria de fluxo immunophenotyping modular e reduzir custos, erros e tempo de manuseio. Essa abordagem também é muito bem adequada no caso de amostras clínicas, com número limitado de células.

Protocolo

Todos os estudos de materiais humanos foram aprovados pela Johns Hopkins institucional Review Board sob o Health Insurance Portability and Accountability Act. Amostras do paciente e controle foram de identificados. PBMC e sangue de controles saudáveis foram obtidos pelo consentimento informado.

Nota: Este protocolo foi testado em fresco ou congelado isoladas células de sangue periféricas e sangue total.

1. preparação da pilha

1. Isolamento de células de sangue periféricos (PBMC) de sangue total
   1. Tirar sangue em um tubo de verde-top 10 mL contendo heparina de sódio. Depois que o tubo foi preenchido com sangue, imediatamente inverta o tubo várias vezes para evitar a coagulação.
      Nota: Tubos contendo outro anticoagulante como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou citrato de sódio podem ser usados com resultados comparáveis. Se uma quantidade diferente de sangue é coletada, as seguintes etapas no protocolo devem ser dimensionadas em conformidade.
   2. Transferi cuidadosamente desenhada de sangue em um tubo cónico de 50 mL. Dilua o sangue com uma quantidade igual de solução salina tamponada fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio.
   3. Adicionar 15 mL de meio de gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll) para o fundo de um novo tubo cónico de 50 mL e cuidadosamente o sangue diluído em cima médio gradiente de densidade, evitando qualquer mistura de sobreposição entre o médio gradiente de densidade e o sangue diluído.
      Nota: Este é um passo crítico para uma separação adequada de PBMC de células vermelhas.
   4. Centrifugar a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente (RT), com nenhum freio para evitar o rompimento da interface.
   5. Após a centrifugação, cuidadosamente Aspire a camada superior, usando uma pipeta e descartá-lo, prestando atenção para não remover células na interface entre o plasma e densidade gradiente meio, que é onde PBMCs estratifica. Recolha o maior número de células possível através da interface sem tocar o pellet de células vermelhas na parte inferior do tubo cónico de 50 mL e transferência para um novo tubo cónico de 50 mL.
   6. Adicione PBS para trazer o volume final de 25 mL e inverter várias vezes para misturar. Centrifugar a x g durante 10 minutos a RT com o freio para remover qualquer contaminação médio gradiente de densidade da suspensão celular.
   7. Cuidadosamente Aspire o sobrenadante sem perturbar centrifugado. Adicione PBS para trazer o volume final de 25 mL e inverter várias vezes para misturar. Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos a RT com o freio para remover as plaquetas.
   8. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Resuspenda PBMCs em 1 mL de PBS/0.1% de azida de sódio. Azida de sódio reduz tampando, derramamento, internalização dos anticorpos e aumento celular de recuperação, mas sua toxicidade pode prejudicar a viabilidade celular. Por esta razão, azida de sódio deve ser evitada em todas as etapas se as células vão ser cultivadas para experiências posteriores. Cela de isolamento e coloração sem azida sódica deram resultados semelhantes à mancha realizada na presença de azida de sódio.
      Atenção: Azida de sódio pode causar a morte por afetar o sistema nervoso central. Contato pode causar queimaduras de pele e olhos.
   9. Dilua as células de contagem através da transferência de 30 µ l de PBMC em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Em seguida, adicione 120 µ l de PBS e 150 µ l de Trypan azul para determinar o número de telemóvel e viabilidade (diluição de pilha 01:10). Resuspenda cuidadosamente.
   10. Transferi 10 µ l para um hemocytometer, contagem de células em conformidade para a contagem usado câmara e determinar o número de células viáveis. Células viáveis = número de Trypan azuis células negativas total x 10 (o fator de diluição usado neste protocolo) x 10⁴.
       Nota: Em média, 7-15 x 10⁶ de PBMC devem ser coletadas de 10 mL de sangue.
   11. Ressuspender as células em 10 x 10⁶ de PBS/0.1% de azida de sódio por mL
       Nota: PBMC pode ser congelado e armazenado em nitrogênio líquido, por um período prolongado de tempo. No entanto, a expressão de marcadores, tais como receptores de chemokine pode ser alterada por este procedimento.
2. Preparação de células de PBMC congelado
   Nota: diferentes procedimentos de congelamento podem afetar¹², de recuperação e viabilidade celular. PBMC por estas experiências foram congelado especialmente formulado de congelação mídia ou soro fetal bovino (FBS)/10% dimetilsulfóxido (DMSO) com resultados semelhantes.
   Atenção: DMSO pode ser um pouco perigoso em caso de inalação (irritante pulmonar), contato (irritativa, permeator), de olhos (irritante), de ingestão de pele.
   1. Remover PBMC congelado de nitrogênio líquido e coloque no gelo. Transferi o cryovial do gelo diretamente em banho-maria a 37 ° C. Manter o cryovial na superfície da água e agite-os frascos até que uma bola de gelo pequenas permanecem. Transferi o cryovial volta no gelo.
   2. Remova toda a água com uma toalhita de pulverizado de etanol 70%. Lentamente, adicione 1 mL de PBS/0.1% de azida de sódio a 4 ° C e transferir cuidadosamente a célula para um tubo cônico de 15 mL. Adicione lentamente o frio PBS/0.1% de azida de sódio a 4 ° C, para alcançar um volume final de 15 mL.
   3. Centrifugar x g por 10 min. Retire cuidadosamente o sobrenadante, Ressuspender as células em 1 mL de PBS/0.1% de azida de sódio.
      Nota: As células também podem ser resuspended em RPMI 10% FBS com resultados semelhantes.
   4. Dilua a célula para a contagem através da transferência de 30 µ l de PBMC em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Em seguida, adicione 120 µ l de PBS e 150 µ l de Trypan azul para determinar o número de telemóvel e viabilidade (diluição de pilha 01:10). Resuspenda cuidadosamente.
   5. Transferi 10 µ l para um hemocytometer, contagem de células em conformidade para a contagem usado câmara e determinar o número de células viáveis. Células viáveis = número de Trypan azuis células negativas total x 10 (o fator de diluição usado neste protocolo) x 10⁴.
   6. Ressuspender as células em 10 x 10⁶ / mL em PBS/0.1% de azida de sódio.
3. Preparação de células de sangue total
   1. Tirar sangue em um tubo de verde-top 10 mL contendo heparina de sódio. Depois que o tubo foi preenchido com sangue, imediatamente inverta o tubo várias vezes para evitar a coagulação.
      Nota: Tubos contendo anticoagulante outro como EDTA ou citrato de sódio pode ser usado com resultados comparáveis. Se uma quantidade diferente de sangue é coletada, as seguintes etapas no protocolo devem ser dimensionadas em conformidade.
   2. Transferência de 200 µ l de sangue total para um tubo 12 x 75 mm tampado, adicionar 2 µ l de azida de sódio e vórtice delicadamente por 2 s.

2. coloracao celular

Nota: Escolher os pares de fluorochromes com sobreposição praticamente não espectral é importante para reduzir a propagação de dados devido a alta repercussões de um fluorocromo no outro detector fluorocromo. Para conseguir uma identificação ideal da al os subconjuntos de célula, fluorochromes com um rendimento quântico alta devem ser usados como pares de anticorpo BV421-PE e PE-APC.

1. Coloração de PBMC fresco e congelado
   1. Transferi 100 µ l de PBMC (1 x 10⁶ células) para uma placa de V-fundo de 96 poços.
      Nota: Qualquer número de células inferiores a 1 x 10⁶ pode ser usado com resultados similares².
   2. Centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Adicione a cada bem 100 µ l de PBS contendo um corante fixável ao vivo/morto que reage com a amina livre em proteínas para 10 min rotular as células mortas.
   3. Prepare-se para cada μL de amostra 30 de uma mistura que contém todos os anticorpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ na fluorchrome e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 em fluorchrome B). Concentração de anticorpos são indicadas na tabela 1 e tabela2. Nesta fase, titulação de anticorpos contra moléculas-alvo diferentes e em diferentes fluorochromes podem ser adicionados também (por exemplo, a tabela 3).
      Nota: Concentração de anticorpos pode variar dependendo do fabricante e número de lote. Portanto, testes preliminares devem ser feitos para conseguir o melhor sinal. PBS, PBS/0.5% BSA, azida sódica PBS/0.2% ou PBS/0.5% BSA/0.1% azida foram utilizados com resultados semelhantes para diluir a anticorpos². Célula pode também ser manchada em volumes diferentes de 30 µ l de facilmente integrar esta metodologia para já existentes protocolos de coloração.
   4. Centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Adicione o cocktail de anticorpo a cada poço e ressuspender cuidadosamente sem gerar bolhas. Incube durante 30 min à RT no escuro.
      Nota: É possível manchar as amostras a 4 ° C, com resultados semelhantes.
   5. Adicionar 150 µ l de buffer de coloração e centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Ressuspender as células em 200 µ l de PBS e aquisição de dados em um citômetro de fluxo. Se coloração volumes forem alterados, por favor certifique-se de pelo menos uma 20-fold diluição do anticorpo mix original usada para lavar o excesso de anticorpos.
      Nota: Células coradas podem ser corrigidas com em PBS/2% paraformaldeído, conservadas no frigorífico a 4 ° C durante a noite e depois, no dia seguinte, adquiridas em um citômetro de fluxo.
      Atenção: Paraformaldeído é prejudicial se ingerido e pode causar irritação da pele
2. Mancha de sangue total
   1. A cada tubo 12 x 75 mm tampado, adicionar o coquetel de anticorpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ na fluorocromo e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 em fluorocromo B) e incubar a RT por 30 min em RT no escuro. Concentração de anticorpos são indicadas na tabela 4. Nesta fase, titulação de anticorpos contra moléculas-alvo diferentes e em diferentes fluorochromes podem ser adicionados também. Concentração de anticorpo pode variar dependendo do fabricante e número de lote. Portanto, testes preliminares devem ser feitos para conseguir o melhor sinal.
      Nota: É possível ficar manchado amostras a 4 ° C, com resultados semelhantes.
   2. Centrifugar a 350 x g por 3 min em RT e Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. Fazer uma solução de 1x da lise de células vermelhas do sangue, seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: A solução de lise de RT deve atingir antes de usar.
   3. Adicionar 2,0 mL de 1x tampão de lise de células vermelhas do sangue a cada tubo, tampe bem e inverter várias vezes para misturar. Cubra com papel alumínio e deixe descansar por 15 min.
   4. Spin para baixo a 300 x g por 5 min. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
   5. Adicione 2 mL de PBS e centrifugar a 300 x g por 5 min.
      Nota: neste ponto, o centrifugado deve ter uma coloração branca pálida, indicando uma lise de sucesso células vermelhas do sangue. Aspire cuidadosamente o sobrenadante para não perturbar o centrifugado e suavemente Ressuspender as células em 200 µ l de PBS.
   6. Coe as células através de tubos de 12 x 75 mm com 40 µm tampões de filtro para remover agregados de células e aquisição de dados em um citômetro de fluxo.

3. titulação de anticorpos

Nota: Titulação de anticorpos é o passo mais crítico para a obtenção de dados de alta qualidade, pode ser reproduzidos. Titulação de anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 e - TCR γδ segue o procedimento padrão pelo qual a concentração de anticorpo para separar otimamente picos positivos e negativos é derivada por máximo índice^13,14de coloração. Diluições no pico ou perto do pico do lado ascendente da curva de índice de mancha devem ser selecionado (Figura 1A-C). O anticorpo anti-CD4 é titulado para colocar o pico da população positiva entre CD3 única populações positivas e CD3 CD4 + células T CD8 +, mais perto para o CD3 único sinal positivo para melhor discriminar as populações de CD8dim (células γδ T CD8 + e células NK-T). Células ao longo da mesma linha, entre o CD3 de CD56 titulação visa posição NK CD56^{+ +} e o CD3 população^– .

1. Curva de índice máximo mancha
   Nota: titulação de anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 e - TCR γδ segue o procedimento padrão pelo qual a concentração de anticorpo para separar otimamente picos positivos e negativos é derivada por coloração índice curva¹⁵no máximo. Se os anticorpos contra outros marcadores são adicionados ao painel, eles também precisam ser titulado com uma curva de índice de coloração máxima.
   1. Prepare uma diluição 2 vezes anticorpo preenchendo 10 poços de uma placa de 96 poços com 40 µ l de tampão de coloração. No primeiro poço, aumentar o volume final de 80 µ l de tampão de coloração e adicione o anticorpo de interesse numa concentração 4 vezes a concentração sugerida pelo fabricante.
   2. Misture bem e transfira 40 µ l para o segundo bem. Misture bem e repita este passo para todos os outros poços.
   3. Mancha de 10 amostras de sangue total ou de PBMC com 30 µ l de 10 diferentes diluições 2 vezes de anticorpos seguindo o protocolo descrito antes.
   4. Aquisição de dados com um citômetro de fluxo e traçar o sinal de cada diluição (figura 1A).
   5. Portal sobre as populações de negativas e positivas para cada concentração de anticorpo. Aumento da concentração de anticorpos pode levar a um plano superior. Portanto, redimensione o portão negativo nesse sentido.
   6. Para cada concentração de anticorpo, extrair informações sobre a mediana e o desvio-padrão para a intensidade fluorescente da população negativa e a mediana para a intensidade fluorescente da população positiva. Calcular, para cada concentração de anticorpos, o índice de mancha com esta fórmula: (mediana intensidade fluorescente da população positiva — intensidade fluorescente mediana da população negativa) ÷ (desvio-padrão da intensidade fluorescente de 2 x a população de negativo) (figura 1B).
   7. Plotar a mancha índice vs. a concentração de anticorpos expressada como fração da diluição do anticorpo (por exemplo, 01:10 diluição = 0,1) e identificar a concentração do anticorpo com o valor de índice máximo mancha (Figura 1).
2. Titulação de anticorpos anti-CD4 e - CD56
   Nota: titulação de anticorpos Anti-CD4 e - CD56 baseia-se na titulação anterior os outros marcadores no painel dois-fluorocromo. Para o anticorpo anti-CD4 a titulação visa colocar o anti-CD4 do sinal entre o CD8 duplo⁺/CD3⁺ sinal e o CD3 única população positiva (Figura 1).
   1. Titula-se o anti-CD4 e CD56 anticorpos com uma estratégia de diluição 2 vezes como descrito antes, adicionando concentrações adicionais para identificar finamente o intervalo de concentração que permitem separar CD4⁺ T células e células NK da outra célula populações.
   2. Titula-se o anticorpo anti-CD4, colocando o sinal do anti-CD4 entre o CD8 duplo⁺/CD3⁺ sinal e o CD3 única população positiva (Figura 1).
      Nota: Cuidado especial deve ser feito para separar claramente CD4⁺ T células de CD8⁺ dim populações.
   3. Titula-se o anticorpo anti-CD56 seguindo uma estratégia semelhante à titulação de anticorpos anti-CD4, colocando as células NK entre o CD3-negativo e as populações de CD3-positivo.

4. estratégia de retenção

1. Identificação de populações de célula linfocítica e monocítica e remover as células mortas e a maioria das células vermelhas do sangue residuais da análise.
   1. Selecione toda a população contendo linfócitos e monócitos, baseados na área de dispersão de lado frente vs (FSC-A vs CCD-A). Remova agregados de células da análise através de dispersão frente altura vs dispersão frente largura (FSC-H vs FSC-W) e lado dispersão altura vs lado dispersão largura (SSC-H vs CCD-W).
   2. Use um marcador de discriminação ao vivo/morto para excluir brilhantes positivas células mortas e células vermelhas do sangue residuais da análise. Portão em linfócitos e monócitos, baseados no perfil FSC-A e SSC-A diferente.
2. Dois-fluorocromo sete-marcador estratégia associada das populações linfocítica.
   Nota: dentro do subgrupo positivo CD3, CD4⁺, CD8⁺ e células γδ T podem ser separadas usando anticorpos que se destinam exclusivamente a CD4, CD8 e o receptor do γδ. De forma comparável, dentro do subgrupo negativo CD3, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente.
   1. Selecione o portão de linfócitos e criar um ponto de enredo com em cada eixo, um dos dois fluorochromes usados no presente protocolo (Figura 2B).
   2. Portão em CD8⁺ T células identificadas como CD3⁺/CD8⁺ duplo células positivas no canto superior direito da trama do ponto (Figura 2B). Exclua a população de CD8 ofuscante que pode conter células NKT. Portão em CD4⁺ T células identificadas como população entre CD8⁺ T células e o CD3 único positivo das populações. Portão em pilhas de T do γδ identificados como células CD3 elevada. Subdivida as pilhas de T do γδ em CD8 positivas e negativas de CD8.
   3. Porta identificadas como a população entre CD3 positivo de células NK e células CD3-negativo. Subdivida as células NK em CD8 positivas e negativas de CD8. Portão em células B, identificado como negativo CD3 CD19⁺ população no canto inferior direito da trama do ponto.
   4. Selecione os portões de monócitos e criar um ponto de enredo com em cada eixo, um dos dois fluorochromes usados no presente protocolo (Figura 2). Portal sobre o CD3^–/CD14⁺ população.

Resultados

Configuração e análise de um experimento de citometria de fluxo das células do sangue periféricos humanos manchado com sete marcadores de linhagem (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19-CD56 e TCR - anticorpos γδ) usando apenas dois fluorochromes são apresentados.

Resultados representativos são descritos para anti-CD8 e - titulação de anticorpos CD56. Para cada anticorpo (neste exemplo, anti-CD8), dados de dez diluições ...

Discussão

O protocolo apresentado aqui tem demonstrado ser bastante flexível e insensível às mudanças de coloração, o amortecedor, a temperatura e a preparação de células do sangue periférico, devido a alta expressão de marcadores de linhagem na superfície das células. O passo mais crítico para a obtenção de dados de alta qualidade, pode ser reproduzidos é a titulação de anticorpos. Digno de nota, desde que a titulação de anticorpos deve sempre ser executada durante a instalação de um painel de fluxo cytomet...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3	BD Biosciences	562426	Antibody for staining RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Antibody for staining RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Antibody for staining RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Antibody for staining RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Antibody for staining RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Antibody for staining RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Antibody for staining RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Antibody for staining RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Antibody for staining RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Antibody for staining RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Antibody for staining RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Antibody for staining RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Antibody for staining RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Antibody for staining RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Antibody for staining RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Antibody for staining RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Antibody for staining RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Antibody for staining RRID: AB_2744293
Dead cells	Life technologies	L-23105	Live/dead discrimination
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube	BD Bioscience	352001	to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo fisher	12648010	Freezing cells
96-well V-bottom plate	Thermo fisher	249570	plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences		Flow cytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS analysis
Graphpad Prism	GraphPad software		Data analysis