İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Özet

Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut⁺ ve CD8⁺ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.

Özet

Bağışıklık hücre karakterizasyonu ağır çok renkli Akış Sitometresi yüzey işaretlerinin fark ifadeye dayalı altgrupları tanımlamak için kullanır. Klasik bir çok renkli panel kurulumu high-end aletleri, özel etiketli antikorlar ve spektral örtüşme en aza indirmek için dikkatli bir çalışma tasarım gerektirir. Büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için multiparametric bir analiz geliştirdiğimiz (CD4⁺ ve CD8⁺ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) sadece iki fluorochromes kullanarak yedi sülale işaretleri birleştirerek periferik kan içinde. Bizim strateji lineage işaretleri sürekli her hücre nüfus tarafından benzersiz bir bileşimini ifade edilir gözlem temel alır. Bu antikorlar dikkatli bir titrasyon ile birleştirme müfettişler çoğu akışı cytometers optik sınırını genişletme beş ek işaretleri kaydetmek izin verir. Hala ikinci olmasına rağmen kafa kafaya karşılaştırma bağışıklık hücre popülasyonlarının periferik kan içinde büyük çoğunluğu bizim yöntem ve klasik "bir fluorochrome bir işareti yaklaşım", arasında karşılaştırılabilir doğruluk ile karakterize edilebilir gösterdi nüfus NKT hücreleri ve γδ T hücreleri gibi tanımlamak için daha kesin. Karmaşık bağışıklık hücre popülasyonlarının ve klinik örnekler uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers ve hatta 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynakları ile çözümlenmesi için yedi işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme sağlar. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi birkaç hücre popülasyonlarının hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler durumunda eleme için uygundur.

Giriş

Akış Sitometresi birden çok parametre birkaç bin olaylar başına ikinci¹oranında tek parçacıklar analiz etmek için geliştirilmiş bir tekniktir. Akış Sitometresi tarafından analiz örnekleri örnekleri içerir, ancak hücreleri, boncuk, bakteri, veziküller ve kromozomlar için sınırlı değildir. Sıvı sistemi sorgulama nerede her parçacık yolunda bir veya daha fazla lazerler ile kesişiyor ve birden çok parametre daha fazla çözümleme için kaydedilir noktada parçacıklar yönlendirir. Ön ve yan scatter, saf lazer ışık saçılma tarafından oluşturulan hedef popülasyon tanımlamak ve sırasıyla göreli boyutu ve iç karmaşıklık/parçalı yapı parçacıkları, hakkında bilgi almak için kullanılır. En-in veri akış sitometrik analizinde için hesap, tüm diğer parametreler, tanıyıp faiz parçacıkların spesifik hedeflere bağlamak fluorochrome etiketli probları tarafından türetilmiştir.

Akış Sitometresi belirlemek ve hücre popülasyonlarının karakterize immünolojik araştırmalar için temel bir araçtır. Çok renkli panelleri bağışıklık sisteminin karmaşıklığı incelemek için sürekli aynı anda hücre nüfus¹derin immunophenotyping için kaydedilen işaretleri sayısını artırmak için gelişmektedir. Bu 20 floresan parametreleri aşan son yüksek kaliteli akışı cytometers ile fluorochromes ve daha yetenekli aygıtlar gelişimine lider. Bu fluorochrome spektral çakışma nedeniyle karmaşık çalışma tasarım ve özel antikor etiketleme ve vasıflı operatörler ile ilgili daha yüksek maliyetler ile sonuçlanır. Birkaç durumlarda, karmaşıklığı ve maliyeti için farklı hücre popülasyonlarının işaretleri ayrı paneller kullanılarak azaltılır. Bu yaklaşım, ancak, hata eğilimli olduğunu, her panel bilgileri azaltır ve sınırlı sayıda hücre örnekleri uygulamak zor olabilir. Ayrıca, işaretçileri sayısını artırarak daha az floresan parametreleri ile aletleri üzerinde derin immunophenotyping engellemektedir. Daha önce büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için bir boyama protokol geliştirdiğimiz (CD4⁺ ve CD8⁺ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) yedi sülale işaretçileri kullanarak birleştirerek periferik kan mononükleer hücrelere (PBMCs) Sadece iki fluorochromes yedi yerine geleneksel "bir fluorochrome bir işareti" yaklaşım (www.hcdm.org)^2,3kullanarak gerekli. Bizim ilk rapor araştırdı ve derin immunophenotyping için iki fluorochromes içinde yedi işaretleri birleştirme fikri doğrulanmış. Bu raporda, pratik yönü üzerinde odaklanan ve sorun giderme adımları başarılı bir boyama elde etmek için yalıtmak ve periferik kan hücreleri, leke için bir adım adım iletişim kuralı mevcut.

Bu iletişim kuralı gözlem lineage işaretleri hücre yüzeyinde bir sabit ifade var ve her hücre nüfus lineage işaretleri özel bir kombinasyonu vardır üzerinde temel alır. PBMCs içinde CD3 ifade subdivides bağışıklık hücreleri iki kategoriye ayrılır: CD3 pozitif T lenfositler ve CD3-negatif hücreleri. CD3 pozitif alt grubu, CD4 içinde⁺, CD8⁺ ve γδ T hücreleri CD4 ve CD8 γδ reseptör yalnızca hedef antikorları kullanarak ayrılabilir. Benzer bir şekilde, CD3 negatif alt grubu içinde B hücreler, NK hücreleri ve monosit benzersiz CD19, CD56 ve CD14, karşı antikor sırasıyla kullanarak tanımlanabilir. Standart bir fluorochrome bir işaretleyici yaklaşım, anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ve - TCR γδ antikorlar ile yedi farklı fluorochromes tespit edildi. Anti-CD3, - CD56 ve - TCR γδ antikorlar bir fluorochrome (kolaylık fluorochrome A için etiketli) ve anti-CD4, bizim yaklaşım birleştirir-CD8, - CD14 ve - farklı fluorochrome (fluorochrome B) CD19 antikor. Bu antikor titrasyonu ve diferansiyel antijen ifade birleşimi ile mümkündür. Her iki CD4⁺ ve CD8⁺ T hücre fluorochrome A anti-CD3 antikor pozitif olmakla birlikte, fluorochrome CD8 sinyal ifade yerleştirerek, bir geçici titrasyon ile CD4 sinyal CD8 arasında ise en üst düzeye çıkarma B ayrılmış ve CD3 pozitif-CD4/CD8 çift negatif hücreleri. γδ T hücreleri CD4 ve CD8 daha yüksek düzeyde CD3 ifade eder ve bu nedenle CD3 yüksek⁴tanımlanabilir. Bu sinyal daha da γδ T hücreleri fluorochrome A böylece CD3 düşük T hücreleri ile CD3 yüksek γδ T hücreleri arasındaki mesafeyi artırmak bir anti-TCR γδ antikorlar ile etiketleme tarafından artırdı. B hücreleri CD3 tanımlanan^- fluorochrome A ve CD19⁺ fluorochrome d. içinde CD3 negatif NK hücreleri B hücreleri birbirinden ayırmak için bir anti-CD56 antikor fluorochrome A anti-CD3 kullanıldı. CD56 NK hücre CD3 T hücreleri⁵daha fazla alt düzeyde ifade edilen bu olanak sağlanır. Son olarak, monosit ileri tarafı dağılım özellikleri ve CD14 ifade fluorochrome B. içinde bir arada üzerinden tespit edilebilir

En çok dört işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme fikri^6,7,8daha önce başarıyla denedi ve klinik protokolünde Malign lenfositik nüfus^{9 tanımlamak için kullanılan} . Önceki bir rapor da yedi işaretleri kombine (veri işaretleyicilerini üzerinden farklı özgüllük ile daha bizim iletişim kuralında kullanılan) iki fluorochromes ama bu yaklaşım kullanarak dayanıyordu bir karmaşık her antikor fluorochrome¹⁰değişen miktarda, etiketleme üzerinde. Bu piyasada bulunan antikor kullanan bizim yöntemi aksine ve enstrüman yapılandırma için adapte edilebilir ve polimer fluorochromes yeni nesil yararlanabilirsiniz.

Bu metodoloji genel amacı karmaşık hücre popülasyonlarının sorguya çekmek için beş ek işaretleyiciler kayıt için izin çoğu akışı cytometers optik sınırlarını genişletmektir. Sonuç olarak, uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers üzerinde gelişmiş immünolojik analizi gerçekleştirilebilir ve 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynaklara sahip çarpıcı sonuçlar elde edebilirsiniz. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ve modüler akış sitometrik paneller aynı saat¹¹birkaç soy hedefleme için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu potansiyel olarak modüler immunophenotyping Akış Sitometresi içinde kullanılan panellerin sayısını azaltmak ve maliyeti, hataları ve işlem süresi azaltır. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler söz konusu olduğunda uygundur.

Protokol

İnsan malzemelerin tüm çalışmaları Johns Hopkins kurumsal inceleme kurulu sağlık, sigorta taşınabilirlik ve Accountability Act altında tarafından kabul edildi. Hasta ve kontrol de-tespit edildi. PBMCs ve sağlıklı kontrol kan Onam tarafından elde edilmiştir.

Not: Bu protokol üzerinde taze test veya izole dondurulmuş periferik kan hücreleri ve tam kan.

1. hücre hazırlık

1. Yalıtım tam kan periferik kan hücre (PBMC)
   1. Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
      Not: Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) veya sodyum sitrat gibi diğer antikoagülan içeren tüpler ile karşılaştırılabilir sonuçlar kullanılabilir. Farklı bir miktar kan toplanır, iletişim kuralı aşağıdaki adımlarda buna göre ölçekli olmalıdır.
   2. Özenle çizilmiş kan 50 mL konik tüp içine aktarın. Kalsiyum ve magnezyum fosfat tamponlu tuz (PBS) eşit miktarda kanla sulandırmak.
   3. Yoğunluk gradient orta (örneğin, Ficoll) 15 mL yeni 50 mL konik tüp altýna ekleyin ve dikkatlice yerleşimi herhangi bir karıştırma kaçınarak degrade Orta yoğunluk, üstüne seyreltilmiş kan yoğunluk gradient orta ve seyreltilmiş kan arasında.
      Not: Bu PBMCs uygun bir ayırma kırmızı hücreleri için kritik bir adımdır.
   4. 400 x g (RT), oda sıcaklığında 30 dakika, arabirimin bozulma önlemek için fren yok santrifüj kapasitesi.
   5. Santrifüjü sonra dikkatle bir pipet kullanarak üst katmanı Aspire edin ve, nerede PBMCs stratifies olduğunu plazma ve yoğunluk gradient orta arasında arayüz hücreleri değil çıkarmak için dikkat. Çok sayıda hücre 50 mL konik tüp ve yeni bir 50 mL konik tüp transfer altındaki kırmızı hücre Pelet dokunmadan arabirimden mümkün olduğunca toplamak.
   6. PBS son hacim için 25 mL getirmek ve karıştırmak için birkaç kez ters çevir'i ekleyin. 300 x g 10 dk RT az fren için de üzerinde herhangi bir yoğunluk gradient orta kirlenme--dan hücre süspansiyon kaldırmak için santrifüj kapasitesi.
   7. Dikkatli bir şekilde rahatsız edici hücre Pelet olmadan süpernatant Aspire edin. PBS son hacim için 25 mL getirmek ve karıştırmak için birkaç kez ters çevir'i ekleyin. Vasıl 200 x g üstünde-e doğru çıkarmak trombosit fren RT, 10 dk santrifüj kapasitesi.
   8. Dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. PBMCs PBS/0.1% sodyum azid 1 mL resuspend. Sodyum azid kapatma, dökülme, antikorlar ve artış hücre kurtarma içselleştirilmesi azaltır, ancak onun toksisite hücre canlılığı zarar verebilir. Hücreleri için sonraki deneyler kültürlü Eğer bu nedenle, sodyum azid tüm adımlarını kaçınılmalıdır. Hücre izolasyon ve sodyum azid boyama sodyum azid huzurunda gerçekleştirilen boyama için benzer sonuçlar verdi.
      Uyarı: Sodyum azid merkezi sinir sistemini etkileyen tarafından ölüme neden olabilir. İletişim yanıklar deri ve göz için neden.
   9. PBMCs 30 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde aktararak sayımı için hücreleri oranında seyreltin. Sonra PBS 120 µL ve Trypan mavi cep telefonu numarasını ve canlılığı belirlemek için 150 µL ekleyin (1:10 hücre seyreltme). Dikkatli bir şekilde resuspend.
   10. 10 µL bir hemasitometre hücreleri buna göre için kullanılan sayım odası ve hücrelerin sayısını belirlemek sayısı aktarın. Hücrelerin = mavi negatif hücre x 10 (Bu protokol için kullanılan seyreltme faktörü) toplam Trypan sayısı x 10⁴.
       Not: Üstünde ortalama, 7-15 10 x⁶ PBMCs 10 mL kan toplanan.
   11. 10 x 10 mL PBS/0.1% sodyum azid⁶ hücre resuspend
       Not: PBMC donmuş ve uzun bir süre için sıvı azot içinde depolanır. Ancak, ifade işaretleri Kemokin reseptörleri gibi bu yordam tarafından değiştirilebilir.
2. Donmuş PBMC hücrelerden hazırlanması
   Not: farklı dondurucu yordamlar hücre kurtarma ve canlılığı¹²etkileyebilir. PBMCs bu deneyler için özel olarak formüle edilmiş dondurucu medya ve fetal sığır serum (FBS)/10% Dimetil sülfoksit (DMSO) benzer sonuçlarla. donduruldu
   Uyarı: DMSO inhalasyon (akciğer tahriş edici) durumunda biraz tehlikeli, iletişim (tahriş edici, permeator), göz teması (tahriş edici), sindirim, Cilt.
   1. Donmuş PBMC sıvı azot kaldırmak ve Buza koyun. Cryovial buz doğrudan 37 ° C su banyosu aktarın. Cryovial su yüzeyde tutmak ve küçük buz Pelet kalıncaya kadar şişeleri yavaşça çalkalanır. Cryovial buz aktarın.
   2. Herhangi bir su bir % 70 etanol püskürtülür bezle kaldırın. Yavaş yavaş PBS/0.1% sodyum azid 1 mL 4 ° C'de ekleyin ve dikkatlice hücreyi 15 mL konik tüp aktarın. Yavaş yavaş soğuk PBS/0.1% sodyum azid 4 ° C de 15 mL son hacmi ulaşmak için ekleyin.
   3. 10 dakika süreyle santrifüj 300 x g de dikkatli bir şekilde çıkarın süpernatant, resuspend hücreleri PBS/0.1% sodyum azid 1 mL.
      Not: Hücreleri de RPMI içinde resuspended % 10 FBS benzer sonuçlar ile.
   4. PBMCs 30 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde aktararak sayım için hücreye sulandırmak. Sonra PBS 120 µL ve Trypan mavi cep telefonu numarasını ve canlılığı belirlemek için 150 µL ekleyin (1:10 hücre seyreltme). Dikkatli bir şekilde resuspend.
   5. 10 µL bir hemasitometre hücreleri buna göre için kullanılan sayım odası ve hücrelerin sayısını belirlemek sayısı aktarın. Hücrelerin = mavi negatif hücre x 10 (Bu protokol için kullanılan seyreltme faktörü) toplam Trypan sayısı x 10⁴.
   6. 10 x 10 mL PBS/0.1% sodyum azid⁶ ' daki hücrelere resuspend.
3. Tam kan hücrelerinden hazırlanması
   1. Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
      Not: EDTA veya sodyum sitrat ile karşılaştırılabilir sonuçlar kullanılabilir gibi diğer antikoagülan içeren tüpler. Farklı bir miktar kan toplanır, iletişim kuralı aşağıdaki adımlarda buna göre ölçekli olmalıdır.
   2. 12 x 75 şapkalı mm tüp için tam kan 200 µL aktarmak, sodyum azid ve hafifçe 2 için girdap 2 µL ekleyin s.

2. hücre boyama

Not: Fluorochromes ile hemen hemen Hayır spektral örtüşme çiftlerini seçerek veri bir fluorochrome diğer fluorochrome Dedektör içinde yüksek yayılma nedeniyle yayılmasını azaltmak önemlidir. Al en uygun tanımlamasını hücre alt kümeleri elde etmek için fluorochromes bir yüksek kuantum verim ile antikor çiftleri PE-BV421 ve PE-APC gibi kullanılmalıdır.

1. Taze ve donmuş PBMC boyama
   1. PBMC (1 x 10⁶ hücreleri) 100 µL bir 96-şey V-alt plaka aktarın.
      Not: Hücreleri 1 x 10⁶ ' dan daha düşük herhangi bir sayıda benzer sonuçlar²ile kullanılabilir.
   2. Vasıl 350 x g RT, 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. PBS ile ücretsiz Amin proteinler ölü hücreleri etiketlemek 10 dakika için üzerinde tepki verir canlı/ölü tamir edilebilir bir boya içeren her şey 100 µL ekleyin.
   3. Tüm antikorlar içeren bir karışım için her örnek 30 µL hazırlamak (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorchrome A ve anti-CD4, CD8, CD19, fluorchrome B CD14). Antikorlar konsantrasyon Tablo 1 ve Tablo 2belirtilir. Bu aşamada, titre antikorlar karşı farklı hedef molekülleri ve farklı fluorochromes de eklenebilir (örneğin, Tablo 3).
      Not: Antikorlar konsantrasyon üretici ve lot numarası bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, en iyi sinyal elde etmek için Ön testler yapılmalıdır. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% sodyum azid veya PBS/0.5% BSA/0.1% sodyum azid benzer sonuçlar veren antikorlar²sulandırmak için kullanılmıştır. Hücre de lekeli cilt zaten varolan bu metodoloji kolayca tümleştirmek için 30 µL farklı protokolleri boyama.
   4. Vasıl 350 x g RT, 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. Her şey için antikor kokteyl ekleyin ve dikkatle kabarcıkları oluşmadan resuspend. RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya.
      Not: Benzer sonuçlar ile 4 ° C'de örnekleri leke mümkündür.
   5. 350 x g RT, 3 dk de boyama arabellek ve santrifüj 150 µL ekleyin ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. PBS 200 µL hücrelerde resuspend ve veri akış sitometresi üzerinde elde etmek. Boyama birimleri değiştirdiyseniz, lütfen en az bir 20-fold seyreltme antikor fazlalığı yıkamak için kullanılan özgün antikor Mix emin olun.
      Not: Lekeli hücreleri ile PBS/2% paraformaldehyde sabit, gecede bir buzdolabı 4 ° C'de muhafaza ve ertesi gün bir Akış Sitometresi satın aldı.
      Uyarı: Paraformaldehyde yuttu ve cilt tahrişine neden olabilir zararlı olduğunu
2. Tam kan boyama
   1. Her 12 x 75 şapkalı mm tüp için antikorlar kokteyl ekleyin (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorochrome A ve anti-CD4, CD8, CD19, fluorochrome CD14 B) ve RT RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya. Antikorlar konsantrasyon Tablo 4' te belirtilir. Bu aşamada farklı hedef molekülleri karşı antikor titre ve farklı fluorochromes de eklenebilir. Antikor konsantrasyon üretici ve lot numarası bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, en iyi sinyal elde etmek için Ön testler yapılmalıdır.
      Not: Örnekleri benzer sonuçlar ile 4 ° C'de leke mümkündür.
   2. Vasıl 350 x g RT, 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. 1 x çözüm üretici talimatları kırmızı kan hücre lizis arabelleği olun.
      Not: Lizis çözüm RT kullanmadan önce olmalıdır.
   3. 1 kırmızı kan hücre lizis arabellek x 2.0 mL her tüpün ekleyin, de kap ve karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Folyo ile kapatın ve 15 dakika için oturup bekleyin.
   4. 5 dk. dikkatle Aspire için süpernatant hücre Pelet rahatsız etmeden de 300 x g spin aşağı.
   5. PBS ve santrifüj 2 mL 300 x g 5 min için de ekleyin.
      Not: Bu noktada, bir soluk beyaz renklendirme başarılı kırmızı kan hücre lizis gösteren hücre Pelet olmalıdır. Dikkatli bir şekilde hücre Pelet rahatsız etmek süpernatant Aspire ve yavaşça PBS 200 µL hücrelerde resuspend.
   6. 12 x 75 mm tüpler hücre toplamları kaldırmak ve veri akış sitometresi üzerinde edinmek için 40 µm filtre kapakları ile hücreleri süzün.

3. antikor titrasyonu

Not: Antikor titrasyonu yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veri elde etmek için en kritik bir adımdır. Anti-CD3, titrasyon-CD8,-CD14, - CD19 ve - TCR γδ izler hangi tarafından en iyi şekilde pozitif ve negatif doruklarına ayırmak için antikor konsantrasyonu ile maksimum dizin^13,14boyama elde Standart prosedür. Dilutions tepe veya leke dizin eğri yükselen tarafındaki tepe daha yakın olmalıdır (Şekil 1A-C) seçili. CD4 pozitif nüfus CD3 tek olumlu nüfus ve CD3 arasında zirvesine yerleştirmek için anti-CD4 antikor titre +/ CD8 + T hücreleri, daha yakın daha iyi CD8dim nüfusu (CD8 + γδ T hücreleri ve NK T hücreleri) ayırımcılık CD3 tek olumlu sinyal için. Aynı hat boyunca CD56 titrasyon amaçları⁺ konuma NK CD56 hücrelerin CD3 arasında⁺ ve CD3^- nüfus.

1. En fazla leke dizin eğrisi
   Not: anti-CD3, titrasyon-CD8,-CD14, - CD19 ve - TCR γδ izler hangi tarafından en iyi şekilde pozitif ve negatif doruklarına ayırmak için antikor konsantrasyonu ile bir maksimum dizin eğrisi¹⁵boyama elde Standart prosedür. Diğer işaretleri karşı antikor Masası'na eklediyseniz, aynı zamanda en fazla bir boyama dizin eğrisi ile titre gerek.
   1. Logosuna 2 kat antikor seyreltme arabellek boyama 40 µL ile 96-şey plaka 10 kuyu doldurarak hazırlayın. İlk iyi 80 µL boyama arabelleği için son hacim artırmak ve antikor ilgi bir konsantrasyon 4 kez konsantrasyon üretici tarafından önerilen ekleyin.
   2. İyice karıştırın ve ikinci 40 µL iyi transfer. Mix iyi ve tüm diğer kuyuları için bu adımı yineleyin.
   3. 10 örnekleriyle daha önce açıklanan protokol sonrası antikor 10 farklı logosuna 2 kat dilutions 30 µL PBMC veya tam kan lekesi.
   4. Veri akış sitometresi ile elde etmek ve her seyreltme (şekil 1A) sinyalini arsa.
   5. Negatif ve pozitif nüfusu her antikor yoğunlaşması kapıda. Antikorlar konsantrasyonu artırmak için daha yüksek bir arka plan yol açabilir. Bu nedenle, negatif kapı buna göre yeniden boyutlandırın.
   6. Her antikor konsantrasyon için medyan ve standart sapma için negatif nüfus floresan yoğunluğu ve olumlu nüfus floresan yoğunluğu için ortanca hakkında bilgi ayıklamak. Her antikor konsantrasyon için leke endeksi bu formül ile hesaplanır: (pozitif nüfusun ortanca floresan yoğunluğu — negatif nüfusun ortanca floresan yoğunluğu) ÷ (2 x standart sapması floresan yoğunluğu «negatif nüfus) (şekil 1B).
   7. Leke dizin vs. antikor seyreltme kesir olarak ifade edilen antikor konsantrasyon Arsa (örneğin, 1:10 seyreltme = 0.1) ve en fazla leke dizin değeri (şekil 1 c) ile antikor konsantrasyonu belirlemek.
2. Anti-CD4 ve - CD56 antikor titrasyonu
   Not: ve Anti-CD4 - CD56 antikor titrasyonu dayanır önceki titrasyon iki-fluorochrome Masası'ndaki diğer işaretleri. Titrasyon amaçlamaktadır anti-CD4 yerleştirerek adlı anti-CD4 antikor için çift CD8 arasında sinyal⁺/CD3⁺ tek sinyal ve CD3 pozitif nüfus (şekil 1 d).
   1. CD4 ayırmak için izin arasında ince konsantrasyon aralığı tanımlamak için ek konsantrasyonları ekleme anti-CD4 ve daha önce de açıklandığı gibi bir logosuna 2 kat seyreltme strateji ile CD56 antikor titre⁺ T hücreleri ve NK hücreleri diğer hücreden nüfus.
   2. Çift Kişilik CD8 arasında anti-CD4 sinyal yerleştirerek anti-CD4 antikor titre⁺/CD3⁺ tek sinyal ve CD3 pozitif nüfus (şekil 1 d).
      Not: Özel bakım açıkça CD4 ayırmak için yapılması gereken⁺ T hücreleri CD8⁺ dim nüfus.
   3. NK hücrelerin CD3-negatif ve CD3 pozitif nüfus arasında yerleştirerek anti-CD4 antikor titrasyonu için benzer bir strateji takip anti-CD56 antikor titre.

4. gating strateji

1. Lenfositik ve Monositik hücre popülasyonlarının belirlemek ve ölü hücreleri ve kalan kırmızı kan hücreleri çoğunu analiz kaldırmak.
   1. Lenfositler ve monosit ileri vs yan dağılım alana dayalı içeren tüm popülasyonun seçin (FSC-A vs SSC-A). Hücre toplamları ileri dağılım yükseklik vs ileri dağılım genişliği (FSC-H vs FSC-W) üzerinden analiz ve yan dağılım yükseklik vs yan dağılım genişliği (SSC-H vs SSC-W) çıkarın.
   2. Bir canlı/ölü ayrımcılık marker parlak pozitif ölü hücreleri ve kalan kırmızı kan hücreleri çözümleme dışı bırakmak için kullanın. Kapı lenfositler ve monosit farklı FSC-BIR ve SSC profiline dayalı.
2. İki-fluorochrome 7-marker lenfositik nüfus gating stratejisi.
   Not: CD3 pozitif alt grubu, CD4 içinde⁺, CD8⁺ ve γδ T hücreleri CD4 ve CD8 γδ reseptör yalnızca hedef antikorları kullanarak ayrılabilir. Benzer bir şekilde, CD3 negatif alt grubu içinde B hücreler, NK hücreleri ve monosit benzersiz CD19, CD56 ve CD14, karşı antikor sırasıyla kullanarak tanımlanabilir.
   1. Lenfosit kapısı seçin ve her eksen bu protokol (şekil 2B) için kullanılan iki fluorochromes biri üzerinde bir nokta komplo ile oluşturun.
   2. CD8 kapıya⁺ T hücrelerin CD3 tanımlanan⁺/CD8⁺ çift pozitif hücrelerinin üst sağ köşedeki nokta-Arsa (şekil 2B). NKT hücre içerebilen loş CD8 nüfus hariç. CD4 kapıya⁺ T hücreleri CD8 arasında nüfus olarak tanımlanan⁺ T hücreleri ve CD3 tek olumlu nüfus. γδ T hücreleri yüksek CD3 hücreleri olarak tanımlanan kapıda. γδ T hücreleri CD8 pozitif ve negatif CD8 alt bölümlere.
   3. NK hücrelerin CD3 pozitif arasında nüfus olarak tanımlanan ve CD3-negatif hücre kapısı. NK hücreleri CD8 pozitif ve negatif CD8 alt bölümlere. CD3-negatif CD19 tanımlanan B hücreleri kapıya⁺ sağ alt köşedeki nüfusu nokta arsa.
   4. Monosit gates seçin ve her eksen bu protokol (şekil 2C) için kullanılan iki fluorochromes biri üzerinde bir nokta komplo ile oluşturun. CD3 kapıya^-/CD14⁺ nüfus.

Sonuçlar

Kurulum ve bir Akış Sitometresi deney insan periferik kan hücrelerinin analizini lekeli yedi sülale işaretleri ile (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ve - TCR γδ antikorları) sadece iki fluorochromes sunulmaktadır.

Anti-CD8 ve CD56 antikor titrasyonu için - temsilcisi sonuçları açıklanmıştır. Her antikor için (Bu örnekte, anti-CD8), on ardışık logosuna 2 kat dilutions verilerden bir leke dizin eğris...

Tartışmalar

Burada sunulan Protokolü oldukça esnek ve duyarsız arabellek, sıcaklık ve periferik kan hücresi hazırlık lineage işaretleri hücre yüzeyindeki yüksek ifadesi nedeniyle boyama değişiklikler göstermiştir. Yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veri elde etmek için en kritik antikor titrasyonu adımdır. Antikor titrasyonu her zaman bir akış sitometrik panel kurulumu sırasında gerçekleştirilmesi gereken bu yana belirtmek gerekirse bizim iki fluorochrome yaklaşım için ekstra tezgah-zaman bu adımı ekleme...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3	BD Biosciences	562426	Antibody for staining RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Antibody for staining RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Antibody for staining RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Antibody for staining RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Antibody for staining RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Antibody for staining RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Antibody for staining RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Antibody for staining RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Antibody for staining RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Antibody for staining RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Antibody for staining RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Antibody for staining RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Antibody for staining RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Antibody for staining RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Antibody for staining RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Antibody for staining RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Antibody for staining RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Antibody for staining RRID: AB_2744293
Dead cells	Life technologies	L-23105	Live/dead discrimination
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube	BD Bioscience	352001	to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo fisher	12648010	Freezing cells
96-well V-bottom plate	Thermo fisher	249570	plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences		Flow cytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS analysis
Graphpad Prism	GraphPad software		Data analysis