Discrimination des sept sous-ensembles de cellules immunitaires par deux-fluorochrome cytométrie en flux

Résumé

Nous présentons ici un protocole de cytométrie en flux pour identifier les CD4⁺ et CD8⁺ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et monocytes dans le sang périphérique humain en utilisant seulement deux fluorochromes au lieu de sept. Avec cette approche, cinq marqueurs additionnels peuvent être enregistrées sur la plupart des cytomètres.

Résumé

Caractérisation de cellules immunitaires dépend fortement de cytométrie multicolore pour identifier les sous-populations basées sur l’expression différentielle des marqueurs de surface. Mise en place d’un panneau multicolor classique nécessite des instruments haut de gamme, personnalisés anticorps étiquetés et conception étude attentive à minimiser le chevauchement spectrale. Nous avons développé une analyse multiparamétrique afin d’identifier les principales populations immunitaires humaines (CD4⁺ et CD8⁺ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes) dans le sang périphérique en combinant sept marqueurs de la lignée à l’aide de seulement deux fluorochromes. Notre stratégie est basée sur l’observation que les marqueurs de la lignée expriment constamment dans une combinaison unique de chaque population de cellules. Combiner cette information avec une attention titrage des anticorps permet aux enquêteurs d’enregistrer cinq marqueurs additionnels, élargissant la limite optique de la plupart des cytomètres. Comparaison entre a démontré que la grande majorité des populations de cellules immunitaires dans le sang périphérique peut être caractérisée avec une précision comparable entre notre méthode et l’approche « un fluorochrome-un marqueur » classique, même si ce dernier est toujours plus précis pour l’identification des populations, comme les cellules NKT et cellules de T de γδ. Combinant sept marqueurs à l’aide de deux fluorochromes permet l’analyse de populations de cellules immunitaires complexes et des échantillons cliniques abordables 6-10 fluorochrome cytomètres de flux et même instruments de champ fluorochrome 2-3 dans les zones disposant de ressources limitées. Instruments haut de gamme peuvent également bénéficier de cette approche à l’aide de fluorochromes supplémentaires pour accomplir plus profonde analyse en cytométrie en flux. Cette approche convient également très bien pour le dépistage de plusieurs populations de cellules dans le cas des échantillons cliniques avec un nombre limité de cellules.

Introduction

Cytométrie en flux est une technique qui a été développée pour analyser des paramètres multiples sur des particules unique à un taux de plusieurs milliers d’événements par seconde¹. Exemples d’échantillons analysés par cytométrie incluent, mais ne se limitent pas aux cellules, des perles, des bactéries, des vésicules et des chromosomes. Un système fluidique dirige des particules sur le point d’interrogation où chaque particule croise son chemin avec un ou plusieurs lasers, et plusieurs paramètres sont enregistrés pour une analyse ultérieure. Se disperse vers l’avant et latéraux, générée par la diffusion de la lumière laser pure, servent à identifier la population cible et récupérer des informations sur la taille relative et de la complexité interne/granularité des particules, respectivement. Tous les autres paramètres, qui représentent la majeure partie des données dans une analyse en cytométrie en flux, sont dérivés de sondes marquées fluorochrome qui reconnaissent et se lient à des cibles spécifiques sur les particules d’intérêt.

Cytométrie en flux est un outil de base pour les études immunologiques identifier et caractériser des populations cellulaires. Pour disséquer la complexité du système immunitaire, panneaux multicolores évoluent constamment pour augmenter le nombre de marqueurs enregistré simultanément pour profonde immunophénotypage des cellules des populations¹. C’est menant à l’élaboration d’instruments plus performants et de fluorochromes, avec la récente haut de gamme cytomètres excédant 20 paramètres fluorescents. Cela se traduit dans la conception de l’étude complexe en raison du chevauchement spectrale fluorochrome et des coûts plus élevés associés aux opérateurs qualifiés étiquetage personnalisé anticorps. Dans plusieurs cas, la complexité et les coûts sont réduits en utilisant des panneaux séparés des marqueurs pour différentes populations cellulaires. Cette approche, cependant, est source d’erreurs, réduit l’information contenue dans chaque panneau et peut être difficile à appliquer aux échantillons avec un nombre limité de cellules. En outre, augmentant le nombre de marqueurs s’oppose immunophénotypage profonde sur les instruments avec moins de paramètres fluorescents. Nous avons développé précédemment un protocole de coloration afin d’identifier les principales populations immunitaires humaines (CD4⁺ et CD8⁺ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes) en cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) en combinant sept marqueurs de la lignée à l’aide seulement deux fluorochromes au lieu de sept désiré avec le traditionnel « un fluorochrome-un marqueur » approche (www.hcdm.org)^2,3. Notre rapport initial exploré et validé l’idée de combiner sept marqueurs dans deux fluorochromes pour immunophenotyping profonde. Dans ce rapport, nous présentons un protocole étape par étape pour isoler et en détachant les cellules du sang périphérique, mettant l’accent sur l’aspect pratique et de dépannage pour obtenir une coloration réussie.

Ce protocole est basé sur l’observation que les marqueurs de la lignée ont une expression constante sur la surface de la cellule et que la population de chaque cellule a une combinaison exclusive de marqueurs de la lignée. Dans les PBMC, CD3 expression subdivise les cellules immunitaires en deux grandes catégories : les lymphocytes T CD3 positifs et cellules CD3 négatives. Dans le sous-groupe positif CD3, CD4⁺, CD8⁺ et cellules de T de γδ peuvent être séparés en utilisant des anticorps qui ciblent uniquement des CD4, CD8 et le récepteur γδ. De façon comparable, au sein du sous-groupe négatif CD3, lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes peuvent être identifiés de manière unique à l’aide d’anticorps anti-CD19, CD56 et CD14, respectivement. Dans une approche de fluorochrome-un marqueur un standard, anti-CD3-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, CD56 et TCR - γδ anticorps sont détectés avec sept fluorochromes différents. Notre approche combine anti-CD3, - TCR - γδ anticorps à un fluorochrome (étiqueté pour fluorochrome commodité A) et anti-CD4 et CD56-CD8, - CD14 et - CD19 anticorps dans un fluorochrome différent (fluorochrome B). Ceci est possible par une combinaison d’un titrage d’anticorps et d’expression de l’antigène différentielle. Les deux CD4⁺ et CD8⁺ T cellules sont positifs pour les anticorps anti-CD3 au fluorochrome A, mais ils peuvent être séparés au fluorochrome B maximisant l’expression du signal CD8 tout en plaçant, avec un titrage ad hoc, le signal de CD4 entre le CD8 et les cellules de positif-CD4/CD8 double négation CD3. Les lymphocytes T γδ exprime plus élevé du CD3 que CD4 et CD8, et donc qu’ils soient reconnaissables comme CD3 haut⁴. Ce signal est plus accentuée d’étiquetage γδ NKT au fluorochrome A avec un anticorps anti-TCR γδ afin d’améliorer la séparation entre les cellules de T faibles CD3 et cellules γδ haute T CD3. Les cellules de B peuvent être identifiés comme CD3^– A de fluorochrome et CD19⁺ au fluorochrome B. Pour séparer le CD3 les cellules NK négatives des cellules B, un anticorps anti-CD56 servait au fluorochrome A l’anti-CD3. Ceci est possible car le CD56 exprimé sur les cellules NK à un niveau beaucoup plus faible que le CD3 de cellules T⁵. Enfin, les monocytes peuvent être identifiés par une combinaison de propriétés de diffusion vers l’avant-latérale et l’expression de CD14 au fluorochrome B.

L’idée de combiner jusqu'à quatre marqueurs à l’aide de deux fluorochromes a été tentée avec succès avant^6,7,8et a été utilisée dans un protocole clinique afin d’identifier les populations lymphoïde malignes⁹ . Un précédent rapport combiné également sept marqueurs (avec différente spécificité de marqueurs que nous avons utilisé dans notre protocole) en utilisant deux fluorochromes, mais cette approche s’est appuyé sur un étiquetage complexe de chaque anticorps avec une quantité variable de fluorochrome¹⁰. Ceci est en contraste avec notre méthode qui utilise des anticorps disponibles dans le commerce et peut être adapté à la configuration de l’instrument et peut tirer parti de la nouvelle génération des fluorochromes polymère.

L’objectif global de cette méthodologie est d’élargir les limites optiques de la plupart des cytomètres permettant l’enregistrement de cinq marqueurs additionnels pour interroger des populations cellulaires complexes. En conséquence, analyse immunologique avancée peut être réalisée sur 6-10 abordable fluorochrome cytomètres, et 2-3 instruments de champ fluorochrome peuvent atteindre des résultats remarquables dans les zones disposant de ressources limitées. Instruments haut de gamme peuvent également bénéficier de cette approche à l’aide de fluorochromes supplémentaires pour accomplir plus profonde analyse en cytométrie en flux et créer écoulement dénoyé panneaux par cytométrie en flux ciblant plusieurs lignages au même temps¹¹. Cela peut potentiellement réduire le nombre de panneaux utilisés en cytométrie immunophénotypage modulaire et réduire les coûts, erreurs et le temps de manipulation. Cette approche convient également très bien dans le cas des échantillons cliniques avec un nombre limité de cellules.

Protocole

Toutes les études de matériel humain ont été approuvées par la Commission de révision institutionnelle de Johns Hopkins en vertu de la Health Insurance Portability and Accountability Act. Échantillons de patient et de contrôle ont été dépersonnalisées. Mononucléaires et le sang de sujets sains ont été obtenues par consentement éclairé.

Remarque : Ce protocole a été testé sur fraîchement ou congelé isolé les cellules du sang périphérique et le sang total.

1. préparation de la cellule

1. Isolement des cellules du sang périphérique (PBMC) du sang total
   1. Prélever du sang dans un tube de vert-dessus de 10 mL contenant de l’héparine sodique. Après avoir rempli le tube de sang, immédiatement inverser le tube plusieurs fois pour éviter la coagulation.
      Remarque : Les tubes contenant les autres anticoagulants tels que l’acide tétraacétique (EDTA) ou citrate de sodium peuvent être utilisés avec des résultats comparables. Si un montant différent de sang est recueilli, les étapes suivantes dans le protocole doivent être dimensionnées en conséquence.
   2. Transvaser avec soin dessinés de sang dans un tube conique de 50 mL. Diluer le sang avec une quantité égale de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium et magnésium.
   3. Ajouter 15 mL de milieu gradient de densité (p. ex., gradient de Ficoll) vers le bas d’un nouveau tube conique de 50 mL et superposer soigneusement le sang dilué sur le dessus de gradient moyen de densité, en évitant tout mélange entre le milieu de gradient de densité et le sang dilué.
      Remarque : Il s’agit d’une étape essentielle pour une bonne séparation des PBMC des globules rouges.
   4. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante (RT), avec aucun frein à éviter des perturbations de l’interface.
   5. Après centrifugation, aspirer la couche supérieure à l’aide d’une pipette avec précaution et jetez-le, en faisant attention à ne pas déloger les cellules à l’interface entre le milieu dégradé plasma et densité, c'est-à-dire où les PBMC stratifie. Recueillir autant de cellules que possible de l’interface sans toucher l’extrait concentré de globules rouges au fond du tube conique de 50 mL et transfert dans un nouveau tube conique de 50 mL.
   6. Ajouter PBS pour porter le volume final à 25 mL et inverser plusieurs fois pour mélanger. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à RT avec le frein sur pour supprimer toute contamination moyenne gradient de densité de la suspension cellulaire.
   7. Soigneusement aspirer surnageant sans culot inquiétante. Ajouter PBS pour porter le volume final à 25 mL et inverser plusieurs fois pour mélanger. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min à RT avec le frein à retirer les plaquettes.
   8. Soigneusement aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Remettre en suspension les PBMC dans 1 mL de l’azide de sodium PBS/0.1%. Azoture de sodium réduit le bouchage, le rejet, l’internalisation des anticorps et augmentation cellulaire récupération, mais sa toxicité peut nuire à la viabilité des cellules. Pour cette raison, l’azoture de sodium doit être évitée dans toutes les étapes si les cellules vont être mis en culture pour des expériences ultérieures. Isolement cellulaire et la coloration sans azide de sodium ont donné des résultats similaires aux taches effectuées en présence d’azide de sodium.
      Mise en garde : L’azoture de sodium peut causer la mort en affectant le système nerveux central. Contact peut causer des brûlures à la peau et les yeux.
   9. Diluer les cellules de comptage en transférant 30 µL de PBMC dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Puis ajoutez 120 µL de PBS et 150 µL de bleu Trypan pour déterminer le nombre de cellules et de la viabilité (01:10 cellules de dilution). Remettre en suspension les soigneusement.
   10. Transférer 10 µL dans un hémocytomètre, comte les cellules en conséquence le repérage utilisé de chambre et déterminant le nombre de cellules viables. Cellules viables = nombre de Trypan blues cellules négatives total x 10 (le facteur de dilution utilisé dans le présent protocole) x 10⁴.
       Remarque : En moyenne, 7-15 x 10⁶ de PBMC devraient être prélevés de 10 mL de sang.
   11. Remettre en suspension les cellules à 10 x 10⁶ millilitres de l’azide de sodium PBS/0.1%
       Remarque : PBMC peut être congelé et conservé dans l’azote liquide pendant une période prolongée de temps. Toutefois, l’expression de marqueurs tels que les récepteurs de chimiokines peut être modifiée par cette procédure.
2. Préparation des cellules de PBMC congelé
   Remarque : différentes procédures de gel peuvent affecter la cellule valorisation et viabilité¹². PBMC pour ces expériences ont été gelés spécialement formulé gel de médias ou sérum de veau fœtal (FBS)/10% diméthyl sulfoxyde (DMSO) avec des résultats similaires.
   Mise en garde : DMSO peut être légèrement dangereux en cas d’inhalation (irritant pulmonaire), contact (irritant, perméateur), avec les yeux (irritant), de l’ingestion de la peau.
   1. Retirez PBMC congelé de l’azote liquide et sur glace. Transférer le cryovial de la glace directement dans le bain-marie à 37 ° C. Gardez le cryovial à la surface de l’eau et agiter doucement le flacon jusqu'à ce qu’un granule de glace petit. Transférer le cryovial retour sur la glace.
   2. Enlever toute l’eau avec une lingette pulvérisée de l’éthanol 70 %. Ajouter lentement 1 mL de l’azide de sodium PBS/0.1% à 4 ° C et transvaser avec soin la cellule dans un tube conique de 15 mL. Ajouter lentement d’azide de sodium PBS/0.1% froid à 4 ° C pour atteindre un volume final de 15 mL.
   3. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min. Retirer délicatement le surnageant, remettre les cellules dans 1 mL de l’azide de sodium PBS/0.1%.
      Remarque : Les cellules peuvent également être charriés dans RPMI 10 % FBS avec des résultats similaires.
   4. Diluer la cellule de comptage en transférant 30 µL de PBMC dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Puis ajoutez 120 µL de PBS et 150 µL de bleu Trypan pour déterminer le nombre de cellules et de la viabilité (01:10 cellules de dilution). Remettre en suspension les soigneusement.
   5. Transférer 10 µL dans un hémocytomètre, comte les cellules en conséquence le repérage utilisé de chambre et déterminant le nombre de cellules viables. Cellules viables = nombre de Trypan blues cellules négatives total x 10 (le facteur de dilution utilisé dans le présent protocole) x 10⁴.
   6. Remettre en suspension les cellules à 10 x 10⁶ par millilitre dans l’azoture de sodium PBS/0.1%.
3. Préparation des cellules du sang total
   1. Prélever du sang dans un tube de vert-dessus de 10 mL contenant de l’héparine sodique. Après avoir rempli le tube de sang, immédiatement inverser le tube plusieurs fois pour éviter la coagulation.
      Remarque : Tubes contenant les autres anticoagulants tels que l’EDTA ou citrate de sodium peut être utilisé avec des résultats comparables. Si un montant différent de sang est recueilli, les étapes suivantes dans le protocole doivent être dimensionnées en conséquence.
   2. Transférer 200 µL de sang dans un tube de 12 mm x 75 mm plafonné, ajouter 2 µL de l’azide de sodium et vortex doucement pendant 2 s.

2. coloration de la cellule

Remarque : Choisir les paires de fluorochromes avec pratiquement aucun spectrale de chevauchement est important de réduire la propagation de données dues à un empiétement haute d’un fluorochrome dans l’autre détecteur fluorochrome. Pour réaliser une identification optimale d’al les sous-ensembles de la cellule, fluorochromes avec un rendement quantique élevée doivent être utilisés comme anticorps paires PE-BV421 et PE-APC.

1. La coloration des PBMC fraîche ou congelée
   1. Transférer 100 µL de PBMC (1 x 10⁶ cellules) dans une plaque de fond en V 96 puits.
      Remarque : N’importe quel nombre de cellules inférieures à 1 x 10⁶ peut être utilisé avec des résultats similaires².
   2. Centrifuger à 350 g pendant 3 min à RT et aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Ajouter à chaque bien 100 µL de PBS contenant un colorant fixable live/dead qui réagit avec les amines libres des protéines pendant 10 min marquer les cellules mortes.
   3. Préparer pour chaque µL de l’échantillon 30 d’un mélange contenant tous les anticorps (anti-CD3.-CD56, TCRγδ en fluorchrome A et anti-CD4, CD8, CD19, CD14 dans fluorchrome B). Concentration d’anticorps sont indiqués dans le tableau 1 et Table2. À ce stade, titré les anticorps contre les molécules cibles différentes et dans des fluorochromes différents peuvent être ajoutées ainsi (par exemple, le tableau 3).
      Remarque : Concentration d’anticorps peut varier selon le fabricant et le numéro de lot. Il faut donc des essais préliminaires pour atteindre le signal optimal. PBS, PBS/0.5% BSA, azoture de sodium PBS/0.2% ou PBS/0.5% BSA/0.1% d’azide de sodium ont été utilisés avec des résultats similaires pour diluer les anticorps². Cellule peut aussi être coloré en volumes différents de 30 µL d’intégrer facilement cette méthodologie déjà existant souillant des protocoles.
   4. Centrifuger à 350 g pendant 3 min à RT et aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Ajouter le cocktail d’anticorps dans chaque puits et remettre en suspension soigneusement sans générer des bulles. Incuber 30 min à ta dans l’obscurité.
      Remarque : Il est possible de colorer les échantillons à 4 ° C, avec des résultats similaires.
   5. Ajouter 150 µL de tampon de coloration et centrifuger à 350 x g pendant 3 min à RT et aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans 200 µL de PBS et acquisition de données sur un cytomètre en flux. Si les volumes de coloration sont modifiés, veuillez vous assurer au moins une dilution 20 fois du mélange original d’anticorps utilisé pour laver l’excès d’anticorps.
      Remarque : Cellules colorées peuvent être fixe avec du paraformaldéhyde PBS/2%, conservés au réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit et puis acquis sur un cytomètre en flux le lendemain.
      Mise en garde : Paraformaldéhyde est nocif si avalé et peut causer des irritations de la peau
2. Taches de sang
   1. Dans chaque tube de 12 mm x 75 mm plafonné, ajouter le cocktail d’anticorps (anti-CD3.-CD56, TCRγδ au fluorochrome A et anti-CD4, CD8, CD19, CD14 au fluorochrome B) et incuber 30 min à ta dans l’obscurité à RT. Concentration d’anticorps sont indiqués dans le tableau 4. À ce stade, titré les anticorps dirigés contre les molécules cibles différentes et dans des fluorochromes différents peuvent être ajoutés ainsi. Concentration en anticorps peut varier selon le fabricant et le numéro de lot. Il faut donc des essais préliminaires pour atteindre le signal optimal.
      Remarque : Il est possible de colorer des échantillons à 4 ° C, avec des résultats similaires.
   2. Centrifuger à 350 g pendant 3 min à RT et aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Préparer une solution de 1 x du tampon de lyse des globules rouges suivant les instructions du fabricant.
      Remarque : La solution de lyse devrait être à ta avant utilisation.
   3. Ajouter 2,0 mL de 1 x tampon de lyse des globules rouges dans chaque tube, cap bien et inverser plusieurs fois pour mélanger. Couvrir d’aluminium et laisser reposer pendant 15 minutes.
   4. Tournez en bas à 300 g pour 5 min. aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
   5. Ajouter 2 mL de PBS et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
      Remarque : À ce stade, le culot cellulaire devrait avoir une coloration blanche pâle indiquant une lyse réussie de globules rouges. Aspirer soigneusement le surnageant pour ne pas déranger le culot et resuspendre doucement les cellules dans 200 µL de PBS.
   6. La souche des cellules par l’intermédiaire de tubes de 12 x 75 mm à 40 µm filtre pour enlever des agrégats cellulaires et acquisition de données sur un cytomètre en flux.

3. un titrage d’anticorps

Remarque : Titrage d’anticorps neutralisants est l’étape la plus critique pour obtenir des données de qualité et reproductibles. Titrage de l’anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 et TCR - γδ suit la procédure standard par lequel la concentration d’anticorps pour séparer optimales crêtes positives et négatives est dérivée par coloration indice^13,14au maximum. Les dilutions à la pointe ou le plus près de la pointe sur la partie montante de la courbe d’indice de tache doivent être sélectionnée (Figure 1 a-C). L’anticorps anti-CD4 est titré pour placer l’apogée de la population de CD4 positif entre populations positives unique CD3 et CD3 + / cellules T CD8 +, rapprocher au CD3 seul signal positif pour mieux distinguer les populations CD8dim (CD8 + cellules de T de γδ et cellules NK T). Dans la même veine, les cellules CD56 titrage a pour but de position CD56 NK⁺ entre le CD3⁺ et le CD3^– population.

1. Courbe d’indice maximal de tache
   Remarque : titrage des anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 et TCR - γδ suit la procédure standard par lequel la concentration d’anticorps pour séparer optimales crêtes positives et négatives est dérivée par coloration indice courbe¹⁵au maximum. Si les anticorps contre les autres marqueurs sont ajoutés au panneau, ils doivent aussi être titré avec une courbe d’indice coloration maximale.
   1. Préparer une dilution 2 fois d’anticorps de 10 puits d’une plaque de 96 puits remplis de 40 µL de tampon de coloration. Dans le premier puits, augmenter le volume final à 80 µL de tampon de coloration et ajoutez l’anticorps d’intérêt à une concentration de 4 fois la concentration suggérée par le fabricant.
   2. Bien mélanger et transférer 40 µL à la seconde bien. Mélangez bien et répétez cette étape pour tous les autres puits.
   3. Tache de 10 échantillons de PBMC ou sang total avec 30 ml des différentes dilutions 2 fois 10 des anticorps suivant le protocole décrit précédemment.
   4. Acquisition de données avec un cytomètre en flux et tracer le signal de chaque dilution (Figure 1 a).
   5. Porte sur les populations de positifs et négatifs pour chaque concentration d’anticorps. Augmentation de la concentration d’anticorps peut conduire à une formation plus élevée. Par conséquent, redimensionner la grille négative en conséquence.
   6. Pour chaque concentration d’anticorps, extraire des informations sur la médiane et l’écart-type pour l’intensité de fluorescence de la population négative et la médiane de l’intensité de fluorescence de la population positive. Calculer pour chaque concentration d’anticorps de l’index de la tache avec cette formule : (intensité de fluorescence médiane de la population positive — intensité de fluorescence médiane de la population négative) ÷ (x 2 écart-type de l’intensité de fluorescence de la négative de la population) (Figure 1 b).
   7. Tracer la tache indice vs. la concentration en anticorps exprimée en fraction de la dilution de l’anticorps (par exemple, 01:10 dilution = 0,1) et déterminer la concentration d’anticorps avec la valeur d’index de coloration maximale (Figure 1).
2. Titrage d’anticorps anti-CD4 et - CD56
   Remarque : titrage des anticorps Anti-CD4 et - CD56 dépend de titrage précédent les autres marqueurs dans le panneau de deux-fluorochrome. Pour les anticorps anti-CD4 le titrage vise à placer l’anti-CD4 du signal entre le CD8 double⁺/CD3⁺ signal et le CD3 seule population positive (Figure 1).
   1. Titrer l’anti-CD4 et CD56 anticorps avec une stratégie de dilution 2 fois comme décrit auparavant, ajoutant des concentrations supplémentaires entre les deux afin d’identifier finement l’intervalle de concentration qui permettent de séparer les CD4⁺ T les cellules et les cellules NK de l’autre cellule populations.
   2. Titrer l’anticorps anti-CD4 en plaçant le signal anti-CD4 entre le CD8 double⁺/CD3⁺ signal et le CD3 seule population positive (Figure 1).
      Remarque : Soin particulier doit être fait pour séparer clairement les CD4 des cellules de⁺ T de CD8⁺ dim des populations.
   3. Titrer l’anticorps anti-CD56 suivant une stratégie similaire pour le titrage d’anticorps anti-CD4, en plaçant entre le CD3-négatif et les populations CD3 positifs, les cellules NK.

4. stratégie de blocage

1. Identifier les populations cellulaires lymphoblastique et monocytaire et enlever les cellules mortes et la plupart des globules rouges sang résiduels de l’analyse.
   1. Sélectionnez l’ensemble de la population contenant les lymphocytes et les monocytes basés sur la zone de dispersion latérale avant vs (FSC-A vs SSC-A). Enlevez agrégats cellulaires de l’analyse par l’intermédiaire de nuages de points avant hauteur vs forward scatter largeur (FSC-H vs FSC-W) et côté scatter hauteur vs côté scatter largeur (SSC-H vs SSC-W).
   2. Utilisez un marqueur de discrimination live/dead pour exclure lumineux positives cellules mortes et résiduelle de globules rouges de l’analyse. Porte sur les lymphocytes et les monocytes, compte tenus des caractéristiques différentes de FSC-A et SSC-A.
2. Deux-fluorochrome sept-marqueur stratégie de blocage des populations lymphocytaires.
   Remarque : au sein du sous-groupe positif CD3, CD4⁺, CD8⁺ et cellules de T de γδ peuvent être séparés en utilisant des anticorps qui ciblent uniquement des CD4, CD8 et le récepteur γδ. De façon comparable, au sein du sous-groupe négatif CD3, lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes peuvent être identifiés de manière unique à l’aide d’anticorps anti-CD19, CD56 et CD14, respectivement.
   1. Sélectionnez le portail lymphocytaire et créer un terrain de dot avec sur chaque axe un des deux fluorochromes utilisés dans le présent protocole (Figure 2 b).
   2. Porte de CD8⁺ T cellules identifiées comme CD3⁺/CD8⁺ double des cellules positives dans le coin supérieur droit de la parcelle-dot (Figure 2 b). Exclure la population CD8 dim qui peut contenir des cellules NKT. Porte de CD4⁺ T cellules identifiées comme population entre CD8⁺ T les cellules et le CD3 seule populations positives. Porte sur les lymphocytes T γδ identifiés comme des cellules CD3 hauts. Subdiviser les lymphocytes T γδ CD8 positifs et négatifs de CD8.
   3. Porte sur les cellules NK, identifiées comme la population entre séropositifs au CD3 et cellules CD3 négatives. Subdiviser en CD8 positifs et négatifs de CD8, les cellules NK. Porte sur les cellules B identifiés comme négatif CD3 CD19⁺ population sur le coin inférieur droit de la parcelle de dot.
   4. Sélectionnez les portes de monocytes et créer un terrain de dot avec sur chaque axe un des deux fluorochromes utilisés dans le présent protocole (Figure 2). Porte sur le CD3^–/CD14⁺ population.

Résultats

Installation et analyse d’une expérience de cytométrie de flux des cellules du sang périphérique humains colorés avec sept marqueurs de la lignée (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-anticorps γδ CD19, CD56 et - TCR) en utilisant seulement deux fluorochromes sont présentés.

Résultats représentatifs sont décrits pour anti-CD8 et - CD56 titrage d’anticorps. Pour chacun des anticorps (dans cet exemple, anti-CD8), les donn?...

Discussion

Le protocole présenté ici s’est avéré être très flexible et peu sensible aux changements de coloration de tampon, de température et de préparation de la cellule de sang périphérique en raison de la forte expression des marqueurs de la lignée sur la surface de la cellule. L’étape la plus critique pour l’obtention de données de haute qualité, reproductibles est un titrage d’anticorps. À noter, étant donné que le titrage des anticorps doit toujours être effectué lors de l’installation d’un pan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3	BD Biosciences	562426	Antibody for staining RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Antibody for staining RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Antibody for staining RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Antibody for staining RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Antibody for staining RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Antibody for staining RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Antibody for staining RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Antibody for staining RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Antibody for staining RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Antibody for staining RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Antibody for staining RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Antibody for staining RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Antibody for staining RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Antibody for staining RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Antibody for staining RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Antibody for staining RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Antibody for staining RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Antibody for staining RRID: AB_2744293
Dead cells	Life technologies	L-23105	Live/dead discrimination
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube	BD Bioscience	352001	to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo fisher	12648010	Freezing cells
96-well V-bottom plate	Thermo fisher	249570	plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences		Flow cytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS analysis
Graphpad Prism	GraphPad software		Data analysis