אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

Maria Letizia Giardino Torchia; Raffaello Cimbro

doi:10.3791/58955

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4⁺ ו CD8⁺ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

Abstract

איפיון תאים חיסוניים מסתמך בכבדות על cytometry זרימה ססגוניות לזהות subpopulations מבוסס על ביטוי דיפרנציאלי של סמני פני השטח. ההתקנה של לוח ססגוניות הקלאסי דורש כלים באיכות גבוהה, נוגדנים עם תוויות מותאמות אישית ועיצוב ללמוד בזהירות כדי למזער חפיפה ספקטרלי. פיתחנו ניתוח multiparametric לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4⁺ ו CD8⁺ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בדם היקפי על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות fluorochromes רק שני. האסטרטגיה שלנו מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני כל הזמן לידי ביטוי שילוב ייחודי לכל אוכלוסיית תאים. שילוב של מידע זה עם טיטור זהיר של הנוגדנים מאפשרת החוקרים להקליט חמישה סמנים נוספים, להרחיב את מגבלת אופטי של רוב cytometers זרימה. השוואה עפות הוכיח כי ניתן לאפיין את הרוב המכריע של אוכלוסיות תאים חיסוניים בדם היקפי עם דיוק השוואה בין השיטה שלנו קלאסי "סמן fluorochrome-אחד אחד הגישה", למרות שהאחרון הוא עדיין מדויקת יותר לזיהוי אוכלוסיות כגון NKT תאים ותאים γδ T. שילוב של שבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes מאפשר הניתוח של אוכלוסיות תא החיסון מורכבות ודוגמאות קליניים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, וכן 2-3 fluorochrome כלי נגינה שדה באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד לסינון מספר אוכלוסיות תאים במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

Introduction

Cytometry זרימה היא טכניקה שפותחה כדי לנתח פרמטרים מרובים על חלקיקי יחיד בשיעור של אלפי אירועים לכל השני¹. דוגמאות של דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה כוללים, אך אינם מוגבלים, תאים, חרוזים, חיידקים, שלפוחית, כרומוזומים. מערכת fluidic מנחה את החלקיקים בשלב החקירה שבו כל חלקיק חותך הנתיב שלו עם לייזרים אחד או יותר, פרמטרים מרובים נרשמים לצורך ניתוח נוסף. קדימה ואת הצד בסורקים, שנוצר על ידי פיזור של האור לייזר טהור, משמשים כדי לזהות אוכלוסית היעד ולאחזר מידע על גודלו היחסי פנימיות מורכבות צפיפות החלקיקים, בהתאמה. כל הפרמטרים האחרים, זה חשבון עבור רוב הנתונים בניתוח cytometric זרימה, נגזרים על ידי הגששים התווית על-ידי fluorochrome מזהה, לאגד מטרות ספציפיות על החלקיקים עניין.

Cytometry זרימה הוא כלי ראשי ללימודי אימונולוגי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים. לנתח את המורכבות של מערכת החיסון, לוחות ססגוניות מתפתחים כל הזמן כדי להרחיב את מספר סמנים שנרשם בו-זמנית עבור immunophenotyping עמוק של אוכלוסיות תא¹. זה מוביל להתפתחות של fluorochromes, והכלים כשרוני עם האחרונים cytometers זרימה באיכות גבוהה העולה על 20 פרמטרים פלורסנט. התוצאה היא תכנון המחקר מורכבים בשל חפיפה ספקטרלי fluorochrome, עלויות גבוהות יותר הקשורים עם מפעילי labelling ומיומנים נוגדנים מותאמים אישית. במספר מקרים, מורכבות ועלויות מופחתים באמצעות לוחות נפרדים של סמנים עבור אוכלוסיות תאים שונים. גישה זו, עם זאת, מועדת לשגיאות, מפחית את המידע בחלונית כל אחד, יכול להיות קשה להחיל על דגימות עם מספר מצומצם של תאים. יתר על כן, הגדלת מספר סמנים מונע עמוק immunophenotyping על מכשירים עם פרמטרים פלורסנט פחות. קודם לכן פיתחנו פרוטוקול מכתימים לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4⁺ ו CD8⁺ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בתוך תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות רק שני fluorochromes במקום ה-7 הנדרש באמצעות המסורתי "סמן אחד fluorochrome אחד" הגישה (www.hcdm.org)²^,³. הדו ח הראשוני שלנו חקר ואומת הרעיון של שילוב סמני שבע שני fluorochromes עבור immunophenotyping עמוק. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול צעד צעד-מאת לבודד, כתם כדוריות דם היקפיים, התמקדות בהיבט המעשי ופתרון צעדים כדי להשיג מכתים מוצלחת.

פרוטוקול זה מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני יש ביטוי קבוע על פני התא, כי האוכלוסייה בכל תא יש שילוב בלעדי של שושלת היוחסין סמנים. ב- PBMCs, ביטוי CD3 subdivides תאים חיסוניים לשתי קטגוריות עיקריות: CD3-חיובי T לימפוציטים ותאי CD3-שלילי. בתוך קבוצת חיובית CD3, CD4⁺, CD8⁺ γδ T תאים יכולים להיות מופרדים באמצעות נוגדנים המיועדים אך ורק CD4, CD8, הקולטן γδ. באופן דומה, בתוך קבוצת שלילי CD3, בתאי B, תאי NK, ומונוציטים יכול להיות ייחודי מזוהה באמצעות נוגדנים נגד CD19, CD56 ו- CD14, בהתאמה. בגישה fluorochrome-אחד סמן סטנדרטי אחד, נגד-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ו- TCR נוגדנים γδ מזוהים עם שבעה fluorochromes שונים. הגישה שלנו משלבת אנטי CD3-CD56, ו- - TCR נוגדנים γδ אחד fluorochrome (הנקראת עבור נוחות fluorochrome A), אנטי-CD4,-CD8, - CD14 ו- CD19 נוגדנים בבית fluorochrome שונים (fluorochrome B). הדבר אפשרי ע י שילוב של נוגדן טיטור וביטוי אנטיגן דיפרנציאלית. CD4 בשני⁺ ו CD8⁺ T תאים הן חיוביות עבור נוגדן anti-CD3 ב- fluorochrome A, אבל הם יכולים להיות מופרדים ב- fluorochrome B למקסם את הביטוי של האות CD8 תוך הצבת, עם טיטור אד הוק, האות CD4 בין CD8, התאים חיובי-CD4/CD8 כפול שלילי CD3. תאי T γδ מבטא רמה גבוהה יותר של CD3 מאשר CD4 ו CD8, ולכן הם יכולים להיות מזוהה CD3 גבוהה⁴. האות הזה הוא מועלה על ידי תיוג γδ תאי T ב- fluorochrome A עם נוגדנים γδ anti-TCR, ובכך לשפר את ההפרדה בין תאי T נמוך CD3 CD3 גבוהה γδ T תאים. בתאי B יכול להיות מזוהה CD3^– ב fluorochrome A ו- CD19⁺ ב- fluorochrome B. כדי להפריד CD3 שליליים תאי NK מתאי B, נוגדן anti-CD56 שימש ב- fluorochrome A האנטי-CD3. דבר זה אפשרי משום CD56 הביע על תאי NK ברמה נמוכה יותר מאשר CD3 על תאי T⁵. לבסוף, ומונוציטים ניתן לזהות באמצעות שילוב של מאפיינים לפנים לצד פיזור וביטוי של CD14 ב- fluorochrome B.

הרעיון של שילוב עד ארבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes יש ניסיון כבר בהצלחה לפני⁶^,⁷^,⁸, נעשה שימוש ב פרוטוקול קליני כדי לזהות אוכלוסיות לימפוציטית ממאיר⁹. הדוח הקודם גם משולב 7 סמנים (עם ירידה לפרטים שונים של הסמנים פעם בפרוטוקול שלנו) באמצעות שתי fluorochromes, אך גישה זו התבססה על תוויות מתחם של כל נוגדן עם כמות משתנה של fluorochrome¹⁰. זהו לעומת השיטה שלנו, אשר משתמשת נוגדנים זמינים מסחרית, ניתן להתאים את תצורת המכשיר והוא יכול לנצל הדור החדש של פולימר fluorochromes.

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להרחיב את הגבולות אופטי של רוב cytometers זרימה המאפשר ההקלטה של חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבים. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוח אימונולוגי מתקדמים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, 2-3 fluorochrome שדה מכשירים ניתן להשיג תוצאות יוצא דופן באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה כדי ליצור זרימה מודולרי cytometric לוחות מיקוד מספר שושלות באותו הזמן¹¹. זה יכול באופן פוטנציאלי להפחית את מספר לוחות המשמשים cytometry זרימה immunophenotyping מודולרית, להפחית עלויות, שגיאות זמן טיפול. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

Protocol

כל המחקרים חומרים אנושיים אושרו על-ידי ג'ונס הופקינס מוסדיים ועדת הבדיקה תחת ביטוח בריאות ניידות דין וחשבון. דוגמאות החולה ושליטה היו de-מזוהה. PBMCs ודם מפני פקדי בריא התקבלו על ידי הסכמה מדעת.

הערה: פרוטוקול זה נבדק על טריות או קפואות מבודדות תאי דם היקפיים, דם מלא.

1. תא הכנה

בידוד תאי דם היקפיים (PBMC) של דם מלא
1. דם צינור ירוק-top 10 מ"ל המכיל הפארין נתרן. אחרי הצינור התמלא דם, מיד היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי למנוע קרישה.
  הערה: צינורות המכיל קרישה אחרים כגון חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) או סודיום ציטרט יכול לשמש עם תוצאות דומות. אם כמות שונה של דם נאסף, השלבים הבאים בפרוטוקול יותאם בהתאם.
2. להעביר בזהירות הדם נמשך לתוך צינור חרוטי 50 מ. לדלל את הדם עם כמות שווה של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ללא סידן ומגנזיום.
3. להוסיף 15 מ"ל של צפיפות בינונית מעבר הצבע (לדוגמה, Ficoll) החלק התחתון של צינור חרוטי 50 מ ל, בזהירות כיסוי הדם מדולל על צפיפות בינונית הדרגתיות, הימנעות מכל ערבוב בין צפיפות בינונית הדרגתיות דם מדולל.
  הערה: זהו צעד קריטי עבור הפרדה נאותה של PBMCs של תאי דם אדומים.
4. צנטריפוגה ב x 400 g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT), עם בלי בלמים כדי למנוע הפרעה של הממשק.
5. לאחר צנטריפוגה, בזהירות וארוקן את השכבה העליונה בעזרת פיפטה ולמחוק את זה, תשומת לב מסירה תאים על הממשק בין פלזמה וצפיפות צבע המדיום, זה איפה PBMCs stratifies. איסוף תאים רבים ככל האפשר מתוך הממשק בלי לגעת בגדר תא אדום בחלק התחתון של צינור חרוטי 50 מ ל, העברת צינור חרוטי 50 מ.
6. הוסף PBS כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 25 מ ל, היפוך מספר פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב RT עם הבלמים על כדי להסיר כל זיהום בינוני הדרגתיות צפיפות התליה תא.
7. בזהירות תשאף תגובת שיקוע ללא גלולה תא מטרידה. הוסף PBS כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 25 מ ל, היפוך מספר פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה ב x 200 גר' 10 דקות ב RT עם הבלמים על הסר טסיות.
8. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר התא. Resuspend PBMCs ב 1 מ"ל של אזיד הנתרן PBS/0.1%. אזיד הנתרן מפחיתה מיצוי, שפיכת, הפנמה של נוגדנים, וכן עלייה תא התאוששות, אך שלה רעילות עלול לפגום תא הכדאיות. מסיבה זו, אזיד הנתרן להימנע כל השלבים אם התאים תרבותי לניסויים הבאים. תא בידוד, צביעת ללא אזיד הנתרן נתן תוצאות דומות מכתים שבוצעו בנוכחות אזיד הנתרן.
  התראה: אזיד הנתרן יכולים לגרום למוות על ידי המשפיעים על מערכת העצבים המרכזית. איש קשר עשוי לגרום כוויות העור והעיניים.
9. לדלל את התאים עבור סופר על ידי העברת 30 µL של PBMCs בשפופרת 1.5 mL microcentrifuge. לאחר מכן להוסיף µL 120 ל- PBS ו- 150 µL של Trypan blue כדי לקבוע את המספר ואת הכדאיות (1:10 תא דילול). Resuspend בזהירות.
10. להעביר 10 µL hemocytometer, ספירת התאים בהתאם הספירה בשימוש קאמרית, לקבוע את מספר התאים קיימא. התאים קיימא = מספר Trypan כחול התאים שלילי סך x 10 (הגורם דילול בשימוש פרוטוקול זה) x 10⁴.
  הערה: על ממוצע, 7-15 x 10⁶ של PBMCs צריך להיות שנאספו מ 10 מ"ל של דם.
11. Resuspend התאים 10 x 10⁶ לכל מיליליטר אזיד הנתרן PBS/0.1%
  הערה: PBMC יכול להיות קפוא ומאוחסנים חנקן נוזלי לתקופה ממושכת של זמן. עם זאת, ביטוי של סמנים כגון קולטנים כימוקין יכולים להשתנות לפי נוהל זה.
הכנה של תאים PBMC קפוא
הערה: והקפאת הליכים שונים יכולים להשפיע על התא השחזור ואת הכדאיות¹². PBMCs עבור ניסויים אלה היו קפוא במיוחד ניסח קפוא מדיה או סרום שור עוברית (FBS)/10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) עם תוצאות דומות.
התראה: דימתיל סולפוקסיד יכול להיות מעט מסוכנת במקרה של שאיפה (ריאות מגרה) העור, מגע (גירוי, permeator), של קשר עין (גירוי), של בליעה.
1. הסר PBMC הקפוא של חנקן נוזלי ומניחים על קרח. להעביר את cryovial מן הקרח ישירות לתוך אמבט מים 37 ° C. לשמור את cryovial על פני המים ומנערים בעדינות את הבקבוקונים עד להישאר גלולה קרח קטנים. להעביר את cryovial חזרה על קרח.
2. הסר מים עם מגבון מותז של אתנול 70%. לאט לאט להוסיף 1 מ"ל של אזיד הנתרן PBS/0.1% ב 4 ° C ולהעביר בזהירות את התא צינור חרוטי 15 מ"ל. לאט לאט להוסיף אזיד הנתרן PBS/0.1% קר ב 4 ° C כדי להגיע נפח סופי של 15 מ"ל.
3. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 10 דקות הסר בזהירות resuspend supernatant, התאים ב 1 מ"ל של אזיד הנתרן PBS/0.1%.
  הערה: גם יכול להיות resuspended את התאים ב- RPMI 10% FBS עם תוצאות דומות.
4. לדלל את התא עבור ספירה על ידי העברת 30 µL של PBMCs בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL. לאחר מכן להוסיף µL 120 ל- PBS ו- 150 µL של Trypan blue כדי לקבוע את המספר ואת הכדאיות (1:10 תא דילול). Resuspend בזהירות.
5. להעביר 10 µL hemocytometer, ספירת התאים בהתאם הספירה בשימוש קאמרית, לקבוע את מספר התאים קיימא. התאים קיימא = מספר Trypan כחול התאים שלילי סך x 10 (הגורם דילול בשימוש פרוטוקול זה) x 10⁴.
6. Resuspend התאים 10 x 10⁶ לכל מ ל אזיד הנתרן PBS/0.1%.
הכנה של תאים דם מלא
1. דם צינור ירוק-top 10 מ"ל המכיל הפארין נתרן. אחרי הצינור התמלא דם, מיד היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי למנוע קרישה.
  הערה: צינורות שמכיל נוגד קרישה אחרים כמו EDTA או סודיום ציטרט ניתן להשתמש עם תוצאות דומות. אם כמות שונה של דם נאסף, השלבים הבאים בפרוטוקול יותאם בהתאם.
2. 200 µL של דם מלא להעביר צינור 12 מ"מ x 75 מ"מ כתרים, להוסיף 2 µL של אזיד הנתרן, מערבולת בעדינות עבור 2 s.

2. התא מכתים

הערה: בחירת זוגות של fluorochromes עם חפיפה כמעט לא ספקטרלי חשוב לצמצם את התפשטות נתונים מאחר והתאמת גבוהה של fluorochrome בעוד הגלאי fluorochrome אחרים. כדי להשיג זיהוי אופטימלית של al תת-קבוצות תא, fluorochromes עם תשואה גבוהה קוונטית אמור לשמש כגון הנוגדן זוגות PE-BV421 ו- PE-APC.

כתמים טריים וקפואים PBMC
1. להעביר 100 µL PBMC (1 x 10⁶ תאים) של צלחת V-התחתון 96-ובכן.
  הערה: ניתן להשתמש בכל מספר התאים נמוך יותר עונה 1 פרק 10⁶ עם תוצאות דומות².
2. צנטריפוגה ב x 350 גרם במשך 3 דקות-RT, תשאף היטב את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא. להוסיף כל µL טוב 100 ל- PBS המכיל צבע חי/מת שניתן לתקן את זה מגיב עם אמין חינם על חלבונים 10 דקות להדביק תווית תאים מתים.
3. להתכונן לכל µL מדגם 30 של תערובת המכילה את כל הנוגדנים (anti-CD3.-CD56, TCRγδ ב fluorchrome A ו- anti-CD4, CD8, CD19, CD14 ב fluorchrome B). ריכוז של נוגדנים מסומנים ב טבלה 1 ו Table2. בשלב זה, טיטרציה נוגדנים כנגד מולקולות יעד שונים, fluorochromes שונים ניתן להוסיף גם כן (למשל, טבלה 3).
  הערה: ריכוז נוגדנים יכול להשתנות בהתאם יצרן ומספר רבים. לכן, בדיקות מקדימות צריך להיעשות כדי להשיג את האות האופטימלי. PBS, PBS/0.5% BSA, אזיד הנתרן PBS/0.2% או אזיד הנתרן PBS/0.5% BSA/0.1% שימשו כדי לדלל נוגדנים²עם תוצאות דומות. גם יכול להיות מוכתם תא כרכים שונה µL 30 להשתלב בקלות מתודולוגיה זו שכבר קיימים מכתים פרוטוקולים.
4. צנטריפוגה ב x 350 גרם במשך 3 דקות-RT, תשאף היטב את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא. להוסיף את הקוקטייל נוגדן מכל קידוח, resuspend בזהירות מבלי ליצור בועות. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT בחושך.
  הערה: זה אפשרי להכתים את הדגימות ב 4 ° C עם תוצאות דומות.
5. להוסיף 150 µL של המאגר מוכתמים, צנטריפוגה ב x 350 גרם במשך 3 דקות-RT, תשאף היטב את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא. Resuspend תאי µL 200 ל- PBS ולרכוש על cytometer זרימת נתונים. אם אמצעי אחסון מכתימים משתנים, נא ודא לפחות 20-fold לדילול המיקס נוגדנים המקורית נהגו לרחוץ את העודפים של נוגדנים.
  הערה: תאים מוכתם יכול להיות קבוע עם PBS/2% paraformaldehyde, שמרו על מקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ונרכשה ואז על cytometer זרימה למחרת.
  התראה: Paraformaldehyde הוא מזיק אם בלע והוא יכול לגרום לגירוי העור
כתמים של דם מלא
1. כדי כל שפופרת 12 מ"מ x 75 מ"מ כתרים, הוסף את הקוקטייל של נוגדנים (anti-CD3.-CD56, TCRγδ ב fluorochrome A ו- anti-CD4, CD8, CD19, CD14 ב fluorochrome B) ו דגירה-RT למשך 30 דקות ב- RT בחושך. ריכוז של נוגדנים מסומנים בטבלה4. בשלב זה, טיטרציה נוגדנים נגד מולקולות יעד אחר, ב- fluorochromes שונים ניתן להוסיף גם כן. ריכוז נוגדן יכול להשתנות בהתאם יצרן ומספר רבים. לכן, בדיקות מקדימות צריך להיעשות כדי להשיג את האות האופטימלי.
  הערה: זה אפשרי כתם דגימות ב 4 ° C עם תוצאות דומות.
2. צנטריפוגה ב x 350 גרם במשך 3 דקות-RT, תשאף היטב את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא. להפוך את פתרון 1 x המאגר פירוק תאי הדם האדומים בעקבות הוראות היצרן.
  הערה: הפתרון פירוק צריך להיות RT לפני השימוש.
3. להוסיף מ 2.0 ל 1 x תא דם אדום פירוק מאגר כל שפופרת, קאפ. ובכן, היפוך מספר פעמים כדי לערבב. לכסות בנייר כסף ואפשר לשבת למשך 15 דקות.
4. ספין למטה ב x 300 גרם במשך 5 דק תשאף היטב את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר התא.
5. להוסיף 2 מ"ל של PBS, צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
  הערה: בשלב זה, בגדר התא צריך של צבע לבן חיוור המציינת פירוק תאי הדם האדומים מוצלחת. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע כדי לא להפריע בגדר תא, בעדינות resuspend תאי µL 200 ל- PBS.
6. מסננים את התאים דרך צינורות 12 מ"מ x 75 מ"מ עם 40 כמוסות מסנן מיקרומטר להסיר תא אגרגטים ולרכוש על cytometer זרימת נתונים.

3. נוגדן טיטור

הערה: נוגדן טיטור היא השלב הקריטי ביותר להשגת באיכות גבוהה, לשחזור נתונים. טיטור של אנטי-CD3,-CD8,-γδ CD14, - CD19 ו- TCR בעקבות הליך רגיל שבו ריכוז נוגדן להפריד בצורה אופטימלית פסגות חיוביים ושליליים נגזר על ידי מקסימום מכתים אינדקס¹³^,¹⁴. דילולים שיא או קרוב לשיא בצד העולה של עקומת אינדקס הכתם צריכה להיות מסומנת (איור 1 א'-C). נוגדן אנטי-CD4 הוא טיטרציה למקום הפסגה של האוכלוסייה CD4 חיובי בין אוכלוסיות חיובי יחיד CD3 CD3 + CD8 + T תאים, קרוב יותר למקור האות יחיד CD3 חיובית יותר להפלות האוכלוסיות CD8dim (γδ T תאי CD8 + ותאי NK T). לאורך אותו קו CD56 טיטור שואפת עמדה NK CD56⁺ תאים בין CD3⁺ , CD3 את האוכלוסייה^– .

כתם המרבי אינדקס עקומה
הערה: טיטור של אנטי-CD3,-CD8,-γδ CD14, - CD19 ו- TCR בעקבות הליך רגיל שבו ריכוז נוגדן להפריד בצורה אופטימלית פסגות חיוביים ושליליים נגזר על ידי מקסימום מכתים אינדקס עקומת¹⁵. אם נוגדנים נגד סמנים אחרים נוספים לחלונית ' ', הם גם צריכים להיות טיטרציה עם עקומה אינדקס ההגדלה המרבית.
1. הכן לדילול נוגדן 2-fold על ידי מילוי בארות 10 של צלחת 96-ובכן עם 40 µL של צביעת מאגר. הבאר הראשונה, להגדיל את נפח סופי כדי µL 80 מאגר מוכתמים, להוסיף הנוגדן עניין בכל ריכוז 4 פעמים את הריכוז שהוצעה על ידי היצרן.
2. מערבבים היטב ולהעביר µL 40 השנייה טוב. מערבבים היטב, חזור על שלב זה עבור כל אחרים הבארות.
3. כתם 10 דוגמאות PBMC או דם מלא עם 30 µL של 10 דילולים 2-fold שונים של נוגדנים בעקבות הפרוטוקול המתואר קודם.
4. נתוני עם cytometer זרימה, להתוות את האות של כל דילול (איור 1 א').
5. שער על האוכלוסיות שליליים או חיוביים בכל ריכוז נוגדן. הגדלת ריכוז של נוגדנים יכול להוביל רקע גבוה יותר. לכן, את גודל השער שלילי בהתאם.
6. עבור כל ריכוז נוגדן, לחלץ מידע על חציון סטיית התקן עבור פלורסנט האינטנסיביות של האוכלוסייה שלילי, החציוני עבור פלורסנט האינטנסיביות של האוכלוסייה חיובי. לחשב עבור כל ריכוז נוגדן מדד הכתם בנוסחה זו: (חציון פלורסנט בעוצמה של האוכלוסייה חיובית — החציוני פלורסנט בעוצמה של האוכלוסייה שלילי) ÷ (2 x סטיית התקן של פלורסנט עוצמת שלילי באוכלוסייה) (איור 1B).
7. להתוות את הכתם אינדקס vs. ריכוז נוגדן המבוטא שבר של דילול נוגדנים (למשל, 1:10 דילול = 0.1), ולזהות את הריכוז של נוגדנים עם ערך האינדקס המירבי הכתם (איור 1C).
טיטור נוגדן anti-CD4 ו- CD56
הערה: טיטור נוגדנים Anti-CD4 ו- CD56 מסתמך על טיטור הקודם של סמנים אחרים בחלונית ' ' 2-fluorochrome. עבור נוגדן anti-CD4 טיטרציה שמטרתה הצבת האנטי-CD4 אות בין CD8 כפול⁺/CD3⁺ אות ו של CD3 בודדת חיובית האוכלוסייה (איור 1D).
1. Titrate אנטי-CD4 של נוגדנים CD56 עם אסטרטגיה דילול 2-fold כפי שתואר לפני כן, הוספת ריכוזים נוספים בין לזיהוי דק טווח הריכוז המאפשרות להפריד CD4⁺T תאים ותאי NK מהתא האחר אוכלוסיות.
2. Titrate נוגדן anti-CD4 על-ידי הצבת האות אנטי-CD4 בין CD8 כפול⁺/CD3⁺ אות ו של CD3 בודדת חיובית האוכלוסייה (איור 1D).
  הערה: טיפול מיוחד צריך להיעשות להפריד בבירור CD4⁺ T תאים מחלון CD8⁺ דים אוכלוסיות.
3. Titrate נוגדן anti-CD56 בעקבות אסטרטגיה דומה טיטור נוגדן anti-CD4, על ידי הצבת תאי NK בין האוכלוסיות CD3-חיוביים של CD3-שלילי.

4. gating אסטרטגיה

לזהות אוכלוסיות לימפוציטית, monocytic תא, הסרת תאים מתים ורוב משקעי כדוריות דם אדומות מניתוח.
1. בחר האוכלוסייה כולה המכילה לימפוציטים ומונוציטים בהתבסס על קדימה לעומת פיזור מצידו (FSC-A vs האס-A). הסר תא אגרגטים ניתוח באמצעות פיזור קדימה גובה לעומת פיזור הקדמיים רוחב (FSC-H vs FSC-W) ואת הצד פיזור גובה לעומת הצד פיזור הרוחב (לעומת האס-H האס-W).
2. להשתמש בסמן אפליה חי/מת כדי לא לכלול בהיר חיובי תאים מתים, משקעי כדוריות דם אדומות מניתוח. שער על לימפוציטים ומונוציטים בהתבסס על הפרופיל FSC-A והאס-A שונה.
שני-fluorochrome שבע-marker אסטרטגיה חסימה של אוכלוסיות לימפוציטית.
הערה: בתוך קבוצת חיובית CD3, CD4⁺, CD8⁺ γδ T תאים יכולים להיות מופרדים באמצעות נוגדנים המיועדים אך ורק CD4, CD8, הקולטן γδ. באופן דומה, בתוך קבוצת שלילי CD3, בתאי B, תאי NK, ומונוציטים יכול להיות ייחודי מזוהה באמצעות נוגדנים נגד CD19, CD56 ו- CD14, בהתאמה.
1. בחר את השער לימפוציט וליצור מגרש נקודה בכל אחד מהצירים לאחד שני fluorochromes בשימוש פרוטוקול זה (איור 2B).
2. שער-CD8⁺ T תאים מזוהה CD3⁺/CD8⁺ להכפיל תאים חיוביים בפינה הימנית העליונה של העלילה הנקודה (איור 2B). אל תכלול את האוכלוסייה CD8 עמום העשוי להכיל תאים NKT. שער-CD4⁺ T תאים מזוהה האוכלוסייה בין CD8⁺ T תאים, של CD3 יחיד אוכלוסיות חיובי. שער על תאי T γδ מזוהה תאי CD3 גבוהה. לסעף γδ תאי T CD8 חיובי ו CD8 שלילי.
3. שער על תאי NK מזוהה האוכלוסייה בין CD3-חיובית, תאי CD3-שלילי. לסעף NK תאי CD8 חיובי ו CD8 שלילי. שער על תאי B מזוהה CD19 CD3-שלילי⁺ אוכלוסייה בפינה הימנית התחתונה של העלילה נקודה.
4. בחר את השערים מונוציט וליצור מגרש נקודה בכל אחד מהצירים לאחד שני fluorochromes בשימוש פרוטוקול זה (איור 2C). שער CD3^–/CD14⁺ האוכלוסיה.

תוצאות

הגדרה וניתוח של ניסוי cytometry זרימה תאי דם היקפיים האנושי צבעונית עם שבעה סמנים השושלת (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-נוגדנים γδ CD19, - CD56 ו- TCR) משתמשת רק בשני fluorochromes מוצגים.

התוצאות נציג מתוארים אנטי-CD8 ו- CD56 נוגדן טיטור. עבור כל נוגדן (בדוגמה זו, אנטי-CD8), נתונ...

Discussion

פרוטוקול המובאת כאן הוכח להיות די גמיש וחסר רגישות לשינויים מכתים מאגר בטמפרטורה, תא דם היקפיים הכנה בשל ביטוי גבוהה של שושלת היוחסין סמנים על פני התא. השלב הקריטי ביותר עבור קבלת נתונים באיכות גבוהה, לשחזור הוא נוגדן טיטור. ראוי לציין, מאז טיטרציה של נוגדנים תמיד להתבצע במהלך ההגדרה של לו?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים, השלד והשרירים ועל מחלות עור, < https://www.niams.nih.gov/>, פרס מספר P30-AR053503; קרן גם אני, www.stablerfoundation.org; לאומי המכון לאלרגיה, מחלות זיהומיות, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; נינה אירלנד תוכנית עבור ריאות בריאות (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3	BD Biosciences	562426	Antibody for staining RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Antibody for staining RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Antibody for staining RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Antibody for staining RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Antibody for staining RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Antibody for staining RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Antibody for staining RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Antibody for staining RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Antibody for staining RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Antibody for staining RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Antibody for staining RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Antibody for staining RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Antibody for staining RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Antibody for staining RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Antibody for staining RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Antibody for staining RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Antibody for staining RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Antibody for staining RRID: AB_2744293
Dead cells	Life technologies	L-23105	Live/dead discrimination
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube	BD Bioscience	352001	to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo fisher	12648010	Freezing cells
96-well V-bottom plate	Thermo fisher	249570	plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences		Flow cytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS analysis
Graphpad Prism	GraphPad software		Data analysis

References

Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 cytometry immunophenotyping fluorochrome multiparametric

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: