Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans

Resumen

El nematodo Caenorhabditis elegans es un excelente modelo para disecar interacciones huésped-patógeno. Se describe aquí es un protocolo para infectar el gusano con los miembros de los estreptococos del grupo mitis y determinar la activación de la respuesta de estrés oxidativo contra H₂O₂ producido por este grupo de organismos.

Resumen

Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo de vida libre, se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El protocolo presentado utiliza este modelo para determinar la patogenicidad causada por los estreptococos del grupo mitis a través de la producción de H₂O₂. Los estreptococos del grupo mitis son una amenaza emergente que causan muchas enfermedades en humanos tales como bacteremia, endocarditis y celulitis orbitaria. Se describe aquí es un protocolo para determinar la supervivencia de estos gusanos en respuesta a H₂O₂ producido por este grupo de patógenos. Usando la codificación de skn-1 gen para un factor de transcripción de respuesta de estrés oxidativo, se muestra que este modelo es importante para la identificación de genes de host que están esenciales contra la infección estreptocócica. Además, está demostrado que la activación de la respuesta de estrés oxidativo se puede supervisar en presencia de estos patógenos utilizando una cepa de gusano reportero transgénicos, en la que SKN-1 está fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP). Estos ensayos ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta de estrés oxidativo a H₂O₂ derivado de una fuente biológica como contraposición a exógeno agregado fuentes de oxígeno reactivo (ROS) las especies.

Introducción

Estreptococos del grupo mitis son humanos comensales de la cavidad bucofaríngea¹. Sin embargo, estos organismos pueden escapar de este lugar y causar una variedad de enfermedades invasivas². Las infecciones causadas por estos microorganismos incluyen bacteriemia, endocarditis y celulitis orbitaria^2,3,4,5,6. Por otra parte, ellos surgen como agentes de infecciones del torrente sanguíneo en neutropénicos, inmunodeprimidos y pacientes con cáncer que han sufrido quimioterapia^5,7,8,9 .

Los mecanismos de patogénesis de grupo mitis subyacente es ocultar, porque se han identificado algunos factores de virulencia. El grupo mitis se conoce para producir H₂O₂, que ha demostrado que juegan un papel importante en las comunidades microbianas orales¹⁰. Más recientemente, varios estudios han puesto de manifiesto una función de H₂O₂ como una citotoxina que induce muerte de células epiteliales^11,12. Neumonía por S. que pertenece a este grupo, se ha demostrado para producir altos niveles de H₂O₂ que induce daño en el ADN y la apoptosis en células alveolares¹³. Utilizando un modelo animal de neumonía aguda, los mismos investigadores demostraron que la producción de H₂O₂ por las bacterias confiere una ventaja de virulencia. Estudios sobre la meningitis neumocócica también han demostrado que derivados del patógeno H₂O₂ actúa sinérgicamente con inmunoprotectores para accionar la célula neuronal muerte¹⁴. Estas observaciones establecen claramente que H₂O₂ producido por este grupo de bacterias es importante para su patogenicidad.

Curiosamente, también ha sido demostrado que miembros de la mitis grupo S. mitis y S. oralis causa muerte de los nematodos C. elegans mediante la producción de H₂O₂^15,16. Este nematodo de vida libre se ha utilizado como un modelo simple, genéticamente manejable para el estudio de muchos procesos biológicos. Más recientemente, el gusano ha emergido como un modelo para el estudio de^17,de las interacciones huésped-patógeno¹⁸. Además, varios estudios han puesto de relieve la importancia de estudiar el estrés oxidativo mediante este organismo^19,20,21. Su ciclo de vida corto, capacidad de precipitación genes de interés por ARNi y el uso de la proteína verde fluorescente (GFP)-Reporteros fundidos para monitorizar la expresión génica son algunos de los atributos que lo convierten en un sistema modelo atractivo. Más importante aún, las vías que regulan el estrés oxidativo y la inmunidad innata en el gusano están muy conservadas con mamíferos^20,22.

En este protocolo, se demuestra cómo utilizar C. elegans para dilucidar la patogenicidad causada por estreptococos derivados H₂O₂. Se muestra un análisis de supervivencia modificado, y los miembros del grupo mitis son capaces de matar los gusanos rápidamente a través de la producción de H₂O₂. Con miembros del grupo mitis, una fuente biológica sostenida de especies reactivas del oxígeno (ROS) cuenta, a diferencia de fuentes químicas que inducen estrés oxidativo en los gusanos. Además, las bacterias son capaces de colonizar rápidamente, los gusanos que permite H₂O₂ a dirigirse directamente a las células intestinales (en comparación con otras fuentes que tienen que cruzar varias barreras). El ensayo es validado o 1) por determinación de la supervivencia de la cepa mutante de skn-1 o 2) por derribar skn-1 utilizando RNAi en gusanos en relación con el N2 de tipo salvaje y vector control tratado gusanos. SKN-1 es un factor de transcripción importante que regula la respuesta al estrés oxidativo en C. elegans^23,24,25. Además de análisis de supervivencia, una cepa de gusano expresando un reportero transgénico SKN-1B/C::GFP se utiliza para controlar la activación de la estrés oxidativo respuesta a través de la producción de H₂O₂ por el grupo mitis.

Protocolo

1. preparación de tus placas de Agar (Extracto de levadura de Todd-Hewitt)

1. Para 1 L de media, agregue 30 g de polvo de Todd-Hewitt, 2 g de extracto de levadura y 20 g de agar a un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Agregar 970 mL de agua desionizada para el contenido del matraz e incluir una barra de agitación. Autoclave de los medios de comunicación a una temperatura de 121 ° C y presión de 15 lb/pulgada² por 30 min. Después de eso, establecer los medios de comunicación en una placa de agitación y permiten para enfriamiento con agitación suave.
2. Vierta los medios de comunicación en platos de Petri estériles tamaño adecuado (platos de 100 mm x 15 mm para el crecimiento y mantenimiento de las bacterias, platos 35 x 10 mm para matar a ensayos) bajo un flujo laminar. Permitir que los medios de comunicación se seque por 2 h debajo de la campana laminar. Después de eso, las placas pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.

2. preparación de medio de cultivo nematodos (NGM) y ARNi alimentación placas (NGM ARNi)

1. Utilizando una barra de agitación, disolver 2,5 g de peptona y 3 g de NaCl en 970 mL de agua desionizada en un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Añadir 20 g de agar a los medios de comunicación. Autoclave de los medios a una temperatura de 121 ° C y presión de 15 lb/pulgada² por 30 minutos establece los medios de comunicación en una placa de agitación y permiten enfriamiento con agitación suave.
2. Agregar las siguientes soluciones a los medios de comunicación para la preparación de planchas NGM: 25 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol al 95%) , 1 mL de nistatina (10% v/w en etanol) y 1 mL de estreptomicina 25 mg/mL.
3. Agregar las siguientes soluciones a los medios de comunicación para la preparación de RNAi de NGM placas de alimentación: 25 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol al 95%) , 1 mL de nistatina (10% v/w en etanol) 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL y 1 mL de IM IPTG.
4. Vierta la media 60 x 15 mm placas de Petri estériles bajo flujo laminar. Permitir que los medios de comunicación se seque por 2 h debajo de la campana laminar. Posteriormente, las placas pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.

3. mantenimiento de C. elegans

1. Semilla de las planchas NGM por telescopio 50 μl de la noche a la mañana crecido OP50 de e. coli en el centro de las placas. La cultura de e. coli se prepara previamente en medio Luria-Bertani (LB) y almacenada a 4 ° C durante varios meses. Cubrir las placas y déjelos secar durante 24 h. bajo una campana de laminar y después almacenar las placas en contenedor de poliestireno.
2. Bajo un microscopio de disección, 10 a 12 adultos grávidos mediante una selección de gusano estéril de recogida y transferencia de los gusanos a una e. coli OP50 semillas placa de NGM. Incubar las placas a 20 ° C durante la noche.
3. Al día siguiente, retirar a los adultos con un pick de gusano estéril y dejar los embriones desarrollar a las larvas L4 a 20 ° C (~2.5 días).

4. preparación de edad población sincrónica de gusanos

1. Lavar a adultos grávidos de dos a cuatro placas NGM usando M9W y recoger en un tubo cónico de 15 mL.
   1. M9W de preparar: mezclar 3 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄y 3 g de KH₂PO₄ y disolver en un volumen final de 1 L de agua desionizada. Autoclave de la solución y añadir 1 mL de 1 M de MgSO₄.
2. Girar el tubo a 450 x g durante 1 min, luego decantar el sobrenadante asegurando que los pellets de lombriz permanece intacto.
3. Añadir 400 μL de 8.25% hipoclorito sódico (lejía doméstica) y 100 μl de 5 N NaOH para preparar la solución de lisis de gusano. Añadir la solución de lisis a la pelotilla de gusano y mezclar el contenido agitando el tubo de hasta 70% de los gusanos adultos son lisis. Observar periódicamente el contenido del tubo con un microscopio de disección para asegurar que no es no overbleaching de los huevos.
4. Diluir la mezcla de lejía añadiendo 10 mL de M9W y el contenido del tubo cónico.
5. Girar el tubo en 450 x g durante 1 minuto decantar sobrenadante, luego añadir 10 mL de M9W.
6. Repita el paso 4.5 dos veces más.
7. Resuspender el precipitado de huevo resultante en 3-5 mL de M9W. Coloque el tubo en un tubo de los rotadores. Permita que los tubos giren a una velocidad de 18 rpm a temperatura ambiente (RT) durante la noche.
8. Al día siguiente, girar el tubo a 450 x g durante 1 min para que sedimenten las larvas L1. Eliminar la mayor parte de M9W por aspiración, dejando 250 μl de líquido en el tubo. Suspender las larvas L1 y gotas de lugar tres 5 μl de la suspensión de gusano sobre una tapa de caja Petri, entonces la estimación del número de lombrices por μl utilizando un microscopio de disección.

5. inducción de RNAi en gusanos

1. Usando un estéril del lazo o recoger, racha a las cepas deseadas de RNAi que contiene e. coli de las existencias congeladas (bibliotecas Ahringer y Vidal) en placas de agar de 100 x 15 mm LB que contiene 50 carbenicilina μg/mL y 15 μg/mL de la tetraciclina. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h.
2. Recoger e inocular una colonia aislada de la tensión deseada de ARNi en tubos cónicos de 15 mL estéril conteniendo 2 mL de LB suplementado con 50 carbenicilina μg/mL. Incubar los tubos a 37 ° C por 16 h en un agitador orbital a 150 rpm.
3. Al día siguiente, extensión 150 μL del cultivo crecido durante la noche sobre placas de alimentación del ARNi NGM de 65 x 15 mm utilizando un esparcidor estéril. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h.
4. Permita que las placas se enfríe a RT después de la incubación a 37 ° C. Añadir un volumen adecuado de M9W que contienen larvas L1 de ~ 200 (obtenidas de la población en edad de sincrónica de pasos de gusanos) a la e. coli sembrado NGM ARNi placas de alimentación. Incubar las placas a 20 ° C hasta que las larvas alcancen la etapa de L4 (~2.5 días).

6. preparación de los estreptococos del grupo Mitis para infección

1. La raya hacia fuera deseadas cepas de estreptococos en la 100 x 15 mm tu agar (si las placas fueron almacenadas a 4 ° C, caliente previamente las placas a 37 ° C antes de rayar las cepas respectivas), luego incubar las placas a 37 ° C durante la noche (~ 18 h) en un bote de vela proporcionando un microaerofílicas en eliminaciòn para el crecimiento de estreptococos (las placas veteadas pueden guardarse durante una semana a 4 ° C).
2. Para propagar cepas clínicas de estreptococos, utilizar agar sangre de soja tríptico. Incubar las placas a 37 ° C en un frasco de la vela durante la noche (~ 18 h).
3. Al día siguiente, quitar las placas del frasco de la vela y escoja colonias aisladas utilizando un asa estéril. Inocular tubos cónicos estériles de 15 mL que contiene 2 mL de caldo de tu. Para propagar cepas clínicas de estreptococos, complementar el tu caldo con v/v del 5% de sangre de carnero. Cierre las tapas apretadas e incubar los tubos a 37 ° C en condiciones estáticas.

7. supervivencia de ensayos

Nota: Los pasos involucrados en este ensayo se muestran en la figura 1. Para demostrar que el H₂O₂ derivado de la mitis grupo es responsable de la muerte del gusano, complementar los medios de comunicación con la catalasa o la cepa mutante ΔspxB y complemento cepa ΔspxB; spxB + de S. gordonii puede ser utilizado. SpxB codifica para una oxidasa piruvato, que es responsable de la producción de H₂O₂ en el grupo mitis.

1. Caliente previamente 35 x 10 mm tus placas a 37 ° C. Añadir 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de las deseada cepas de estreptococos y trasmitir las bacterias totalmente a través de la superficie del agar utilizando un esparcidor estéril. Incubar las placas a 37 ° C en un frasco de la vela durante la noche (~ 18 h). Como control, placas de NGM semilla dos de 35 x 10 mm con 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de e. coli OP50. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
2. Para confirmar que el H₂O₂ producido por el grupo mitis es responsable de la muerte de los gusanos, añada de 50 μl que contiene 1.000 unidades de catalasa c sobre el tu placa. Distribuir la solución de catalasa utilizando un esparcidor estéril y dejar las planchas a seco en el flujo laminar durante 30 minutos semillas las placas después de eso con las cepas de streptococcus respectivas tal como se describe en el paso 7.1.
3. Al día siguiente, quitar las placas del frasco de la vela y permite elegir las placas que se enfríe a RT durante 10-15 minutos utilizando un gusano estéril, 30 las larvas L4 de la NGM o ARNi NGM alimentación platos para el estreptococo transferencia semillas tus placas. Use dos sembrados tus placas con un total de 60 lombrices por cepa de estreptococo. Incubar las placas a 25 ° C.
4. Usando un microscopio de disección, contar el número de las larvas L4 de vivos y muertos en cada plato en varios puntos de tiempo. Inicialmente, anotar los gusanos como muerto o vivo cada 30 minutos. Después de eso, cuando gusanos rápidamente comienzan a morir, les cuenta a intervalos de 15 minutos. Utilice la selección de gusano estéril suavemente prod los gusanos y determinar si están vivos o muertos. Un gusano se considera a muerto si no hay ningún movimiento en respuesta a la insistencia.
5. El ensayo llevará a 5-6 horas para completar. Repetir el experimento dos veces más. Después de la terminación del ensayo, los datos de las dos placas de la piscina. Introduzca los datos de cada grupo, comparar las curvas de supervivencia y realizar análisis de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando software estadístico.

8. preparación de agarosa almohadillas para microscopía

1. Calentando la solución en el microondas, disolver 2% peso/volumen de agarosa en agua desionizada. Un volumen de 5 mL de solución es adecuado para preparar 20 diapositivas.
2. Pegar cinta de laboratorio longitudinalmente a lo largo de dos laminas de vidrio. Esto determinará el espesor de las pastillas de agarosa. Colocar un portaobjetos de vidrio limpio entre los dos portaobjetos con cinta.
3. Coloque 100 μl de la agarosa fundida en el centro de la diapositiva limpia. Inmediatamente coloque otro vaso limpio en la parte superior la agarosa fundida y presione suavemente hacia abajo para hacer un cojín. Permita que la agarosa solidificar y posteriormente eliminar la diapositiva superior. La almohadilla de agarosa está lista para usar.

9. observación de SKN-1 localización en respuesta a la infección por Streptococcus

Nota: Los pasos involucrados en este ensayo se muestran en la figura 2. Localización de SKN-1 se determinó utilizando la cepa de gusano transgénico SKN-1B/C::GFP. Fueron utilizados demostrar la localización de SKN-1 debido a la producción de H₂O₂ por el grupo mitis, wild-type (WT), ΔspxB y el complemento cepa ΔspxB; spxB + de S. gordonii . Además, la técnica de interferencia ARNi y cepa transgénica reportero SKN-1B/C::GFP fueron utilizados para demostrar que los componentes de la vía MAPK p38 regulan la localización de SKN-1.

1. Caliente previamente 35 x 10 mm tus placas a 37 ° C. Añadir 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de las deseada cepas de estreptococo y trasmitir las bacterias totalmente a través de la superficie del agar utilizando un esparcidor estéril. Incubar las placas a 37 ° C en un frasco de la vela durante la noche (~ 18 h). Como control, placas de NGM semilla tres de 35 x 10 mm con 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de e. coli OP50. Incubar las placas a 37 ° C para h ~ 18.
2. Al día siguiente, saque el frasco de la vela y permitir que las placas se enfríe a RT durante 10-15 min lavado L4 larvas usando M9W de NGM y placas alimentación NGM ARNi. Recoja los gusanos en tubos cónicos de 15 mL.
3. Hacer girar los tubos a 450 x g durante 1 minuto, decantar el sobrenadante y añadir 10 mL de M9W.
4. Repita el paso 9.3 tres veces más.
5. Suspender los gusanos en 250 μl de M9W y lugar gotas tres 5 μl de la suspensión de gusano sobre una tapa de caja de Petri limpia y estimar el número de lombrices por μl utilizando un microscopio de disección.
6. Agregar las larvas L4 de ~ 100 a cada uno tu estreptococo semillas y sembrado de NGM e. coli placas. Utilizar tres platos por cepa de bacterias. Incubar las placas durante 2 a 3 horas a 25 ° C.
7. Después de eso, quite las placas de la incubadora, lavarlos con M9W y recoger los gusanos en tubos cónicos de 15 mL.
8. Lavar los gusanos 3 x como se describe en 9.3 los pasos.
9. Eliminar la mayor parte de la M9W por aspiración y agregar 500 μl de M9W conteniendo 2 mM sodio azida o 2 mM clorhidrato de tetramisole para la pelotilla de gusano. Esto va anestesiar los gusanos, asegurando que ningún movimiento se produce cuando reflejada bajo el microscopio.
   PRECAUCIÓN: Utilice equipo de protección personal (PPE) al manipular azida de sodio. Preparar la solución de azida debajo de una campana química.
10. Incubar las pelotillas de gusano a TA durante 15 minutos. Entonces, punto 15 μl de la suspensión de gusano en una almohadilla de agarosa preparado. Coloque suavemente un cubreobjetos no. 1.5 sobre la almohadilla de agarosa que contiene los gusanos anestesiados.
11. Usando un microscopio de fluorescencia, visualizar la localización de SKN-1 utilizando filtros DAPI y FITC. Imagen gusanos en 10 x y 20 aumentos x.
12. Puntuación de los gusanos basados en el nivel de localización de SKN-1. No hay localización nuclear, localización de SKN-1B/C::GFP en el anterior o posterior del gusano y localización nuclear de SKN-1B/C::GFP en todas las células intestinales se clasifican como bajo, medio y alto nivel de localización, respectivamente.
13. Después de marcar las imágenes fluorescentes, determinar las diferencias estadísticas de chi-cuadrado y pruebas exactas de Fisher utilizando software estadístico.

Resultados

Grupo de miembros de la mitis S. mitis, S. oralis y S. gordonii rápidamente mataron a los gusanos, a diferencia de S. mutans, S. salivarius y no patógenas e. coli OP50 (figura 3A). La mediana de la supervivencia de S. mitisy S. oralis, S. gordonii era 300 min y 300 min min 345, respectivamente. Para determinar si el asesinato fue mediado por H₂O_...

Discusión

Los métodos descritos pueden ser utilizados para otras bacterias patógenas tales como Enterococcus faecium, que también produce H₂O₂ en anaerobios o microaerofílicos condiciones²⁶. Por lo general, para más patógenos, lleva varios días a semanas para completar el análisis de supervivencia. Sin embargo, debido a la robusta producción de H₂O₂ por miembros del grupo mitis, estos ensayos podrían completarse dentro de 5-6 h en las condicione...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
Bacto peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated	Fisher Scientific	B11947
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood)	Fisher Scientific	R01200
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP26481
Catalase	Sigma Aldrich	C1345-1G
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
Tetracyclin	Sigma Aldrich	87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride	Sigma Aldrich	L9756
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-100A
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
N2	C. elegans wild isolate		CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell