JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein hervorragendes Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen zu zergliedern. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zu infizieren den Wurm mit den Mitgliedern der Gruppe Streptokokken Mitis und Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion gegen H2O2 produziert von dieser Gruppe von Organismen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Caenorhabditis Elegans (C. Elegans), eine freilebende Nematode, entstanden als ein attraktives Modell für Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen. Die vorgestellte Protokoll verwendet dieses Modell um die Pathogenität von Mitis Gruppe Streptokokken über die Herstellung von H2O2verursacht zu bestimmen. Mitis Gruppe Streptokokken sind eine neue Bedrohung, die vielen menschlichen Krankheiten wie Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone verursachen. Hier beschriebenen entsteht ein Protokoll, um das Überleben dieser Würmer als Reaktion auf H2O2 festzustellen durch diese Gruppe von Krankheitserregern. Mithilfe der gen Skn-1 Codierung für einen Transkriptionsfaktor oxidativen Stress Reaktion, wird es gezeigt, dass dieses Modell wichtig ist für die Identifizierung von Host-Genen, die gegen Streptokokken-Infektion sind. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion in Gegenwart dieser Erreger mit einem transgenen Reporter Wurm Stamm, in der SKN-1, grün fluoreszierendes Protein (GFP) verschmolzen wird überwacht werden kann. Diese Tests bieten die Möglichkeit, die oxidativen Stress-Reaktion auf H2O2 abgeleitet von einer biologischen Quelle im Gegensatz zu exogen studieren reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Quellen hinzugefügt.

Einleitung

Mitis Gruppe Streptokokken sind menschliche Kommensalen der oropharyngealen Hohlraum1. Diese Organismen können jedoch diese Nische zu entkommen und eine Vielzahl von invasiven Erkrankungen2verursachen. Infektionen durch diese Mikroorganismen gehören Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone2,3,4,5,6. Darüber hinaus entstehen sie als Erreger von Infektionen der Blutbahn in immungeschwächten, neutropenisch und Krebspatienten, die Chemotherapie5,7,8,9 durchlaufen haben .

Die Mechanismen, die zugrunde liegenden Mitis Gruppe Pathogenese ist dunkel, weil einige Virulenzfaktoren identifiziert wurden. Mitis Gruppe ist bekannt, H2O2, zu produzieren, die gezeigt hat, eine wichtige Rolle in oralen mikrobiellen Lebensgemeinschaften10spielen. Mehrere Studien haben vor kurzem eine Rolle für H2O2 als ein Zytotoxin hervorgehoben, die Epithelzelle Tod11,12induziert. S. Lungenentzündung, die zu dieser Gruppe gehört hat gezeigt, dass hohe Konzentrationen von H2O2 zu produzieren, die DNA-Schädigung und Apoptose in alveoläre Zellen13induziert. Mit einer akuten Lungenentzündung Tiermodell, zeigten die gleichen Forscher, dass die Produktion von H2O2 von den Bakterien einen Virulenz Vorteil verschafft. Studien über Pneumokokken Meningitis haben auch gezeigt, dass dieser Erreger abgeleitet H2O2 wirkt synergistisch mit Pneumolysin neuronale Zelle Tod14auslösen. Diese Beobachtungen stellen klar, dass H2O2 produziert von dieser Gruppe von Bakterien für wichtig, dass ihre Pathogenität.

Interessanterweise hat sich auch gezeigt, dass Mitglieder der Mitis S. Mitis und S. Oralis verursachen Tod von den Nematoden C. Elegans über die Herstellung von H2O215,16. Diese freilebenden Nematoden diente als ein einfaches, genetisch gefügig Modell, viele biologische Prozesse zu studieren. Vor kurzem hat der Wurm ein Modell zur Wirt-Pathogen Interaktionen17,18entwickelt. Mehrere Studien haben darüber hinaus die Bedeutung des Studiums oxidativen Stress mit diesem Organismus19,20,21hervorgehoben. Seine kurzen Lebenszyklus, Knockdown Gene des Interesses von RNAi und Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-fused Reporter, Genexpression zu überwachen sind einige der Attribute, die eine attraktives Modellsystem machen. Noch wichtiger ist, sind die Wege, die Regulierung von oxidativem Stress und angeborene Immunität in der Wurm mit Säugetieren20,22hoch konserviert.

In diesem Protokoll wird gezeigt wie C. Elegans zu verwenden, um die Pathogenität, verursacht durch Streptokokken abgeleitet H2O2aufzuklären. Ein modifizierte überleben Assay gezeigt, und Mitglieder des Arbeitskreises Mitis sind in der Lage, schnell die Würmer zu töten über die Produktion von H2O2. Mit Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, eine nachhaltige biologische Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), im Gegensatz zu chemischen Quellen erfolgt, die oxidativen Stress in den Würmern zu induzieren. Darüber hinaus können die Bakterien besiedeln die Würmer schnell, wodurch für H2O2 direkt ausgerichtet werden, um die Darmzellen (im Vergleich zu anderen Quellen, die mehrere Hindernisse zu überqueren). Der Test wird überprüft, entweder (1) durch Bestimmung das Überleben der Mutante Skn-1 oder 2) durch Skn-1 mit RNAi in Worms im Verhältnis zu der N2 Wildtyp und Vektor-Steuerelement behandelt Würmer umzuwerfen. SKN-1 ist eine wichtige Transkriptionsfaktor, die die oxidativen Stress-Reaktion in C. Elegans23,24,25regelt. Zusätzlich zu überleben-Assays ist Wurm verwendet ein Stamm mit dem Ausdruck eines SKN-1 b/C::GFP transgenen Reporters zur Aktivierung der oxidativen Stress Reaktion über die Produktion von H2O2 Überwachung von Mitis-Gruppe.

Protokoll

1. Vorbereitung von deinem Agarplatten (Todd Hewitt Hefeextrakt)

  1. Fügen Sie für 1 L Medien 30 g Todd Hewitt Pulver, 2 g Hefeextrakt und 20 g Agar, ein 2 L-Erlenmeyerkolben hinzu. Der Inhalt des Kolbens 970 mL entionisiertem Wasser hinzu und bestehen aus einer Stir Bar. Autoklaven der Medien bei einer Temperatur von 121 ° C und Druck von 15 lb/Inch2 für 30 min. Danach legen Sie die Medien auf einem Teller rühren und zur Kühlung mit schonenden rühren lassen.
  2. Gießen Sie die Medien entsprechend dimensionierte sterile Petrischalen (100 x 15 mm Gerichte für Wachstum und Erhalt von Bakterien, 35 x 10 mm Gerichte für das Töten von Assays) unter eine laminare Strömung. Lassen Sie die Medien für 2 h unter der laminar Haube trocknen. Danach können die Platten für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.

2. Vorbereitung der Nematoden Wachstumsmedium (NGM) und RNAi Fütterung Platten (NGM RNAi)

  1. Mit einer Aufregung, lösen Sie 2,5 g Pepton und 3 g NaCl in 970 mL entionisiertem Wasser in einen 2 L-Erlenmeyer-Kolben auf. Das Medium 20 g Agar-Agar hinzufügen. Autoklaven der Medien bei einer Temperatur von 121 ° C und Druck von 15 lb/Inch2 für 30 min. Stellen Medien auf einem Teller rühren und zur Kühlung mit schonenden rühren lassen.
  2. Fügen Sie die folgenden Lösungen an die Medien für die Vorbereitung der NGM Platten: 25 mL 1 M-Kalium-Phosphat-Puffer (pH-Wert = 6,0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL in 95 % igem Ethanol) Cholesterin , 1 mL (10 % V/w im Äthanol) Nystatin und 1 mL von 25 mg/mL Streptomycin.
  3. Fügen Sie die folgenden Lösungen an die Medien für die Vorbereitung der NGM RNAi Fütterung Platten: 25 mL 1 M-Kalium-Phosphat-Puffer (pH-Wert = 6,0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL in 95 % igem Ethanol) Cholesterin , 1 mL (10 % V/w im Äthanol) Nystatin, 1 mL 50 mg/mL Carbenicillin und 1 mL IM IPTG.
  4. Gießen Sie die Medien in 60 x 15 mm sterile Petrischalen unter Laminar-Flow. Lassen Sie die Medien für 2 h unter der laminar Haube trocknen. Anschließend können Platten für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.

3. Wartung von C. elegans

  1. Samen der NGM-Platten von spotting 50 µL über Nacht gewachsen E. Coli OP50 in der Mitte der Platten. Die E. Coli -Kultur ist in Luria-Bertani (LB) Medien zuvor vorbereitet und für mehrere Monate bei 4 ° C gelagert. Deckplatten Sie die ab und lassen sie trocknen für 24 h unter laminar Haube und danach die Platten in Styropor Behälter aufbewahren.
  2. Unter dem sezierenden Mikroskop, 10 bis 12 trächtigen Erwachsene mit einem sterilen Wurm Pick Abholung und transfer der Würmer zu einem E. Coli OP50 ausgesät NGM Platte. Inkubieren Sie die Platten bei 20 ° C über Nacht.
  3. Am nächsten Tag nehmen Sie die Erwachsenen mit einem sterilen Wurm Pick und die Embryonen, L4-Larven bei 20 ° C (~2.5 Tage) zu entwickeln.

4. Vorbereitung der synchronen Bevölkerung im Alter von Worms

  1. Waschen Sie trächtigen Erwachsene zwei bis vier NGM-Platten mit M9W und sammeln sie in einem 15 mL konische Röhrchen.
    1. M9W vorbereiten: 3 g NaCl, Na2HPO46 g und 3 g KH2PO4 kombinieren und in einem Endvolumen von 1 L entionisiertem Wasser auflösen. Autoklaven die Lösung und 1 mL 1 M MgSO4.
  2. Drehen Sie das Rohr auf 450 X g für 1 min, dann Dekantieren Sie überstand dabei sicherzustellen, dass der Wurm Pellet intakt bleibt.
  3. Fügen Sie 400 µL 8,25 % Natriumhypochlorit (Haushalt Chlorid) und 100 µL 5 N NaOH, der Wurm Lyse Lösung vorzubereiten. Das Wurm-Pellet die Lyse-Lösung hinzu und mischen Sie den Inhalt durch das Rohr zu streichen, bis 70 % der Erwachsenen Würmer lysiert werden. Der Inhalt des Röhrchens unter dem sezierenden Mikroskop um sicherzustellen, dass es keine overbleaching der Eier in regelmäßigen Abständen zu beobachten.
  4. Verdünnen Sie die Bleichmittel-Mischung durch Zugabe von 10 mL M9W auf den Inhalt des konischen Rohres.
  5. Drehen Sie das Rohr auf 450 X g für 1 min. Dekantieren überstand, dann fügen Sie 10 mL M9W.
  6. Wiederholen Sie Schritt 4.5 zwei weitere Male.
  7. Das daraus resultierende Ei Pellet in 3-5 mL M9W aufzuwirbeln. Legen Sie das Rohr auf ein Rohr-Rotator. Lassen Sie die Röhrchen mit einer Geschwindigkeit von 18 u/min bei Raumtemperatur (RT) über Nacht drehen.
  8. Drehen Sie am nächsten Tag, das Rohr auf 450 X g für 1 min um die L1-Larven pellet. Entfernen Sie die meisten M9W durch Absaugen, ~ 250 µL Flüssigkeit im Rohr zu hinterlassen. Die L1-Larven Aufschwemmen und Platz drei 5 µL sinkt der Wurm Suspension auf einer Petrischale Deckel, dann die Schätzung der Anzahl der Würmer pro Mikroliter sezierenden Mikroskop.

5. Induktion von RNAi in Worms

  1. Mit einer sterilen Schleife oder abholen, Streifen, die gewünschte Stämme von RNAi-haltigen E. Coli aus gefrorenen Beständen (Ahringer und Vidal-Bibliotheken) auf 100 x 15 mm LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL Carbenicillin und 15 µg/mL Tetracyclin. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h.
  2. Wählen Sie und impfen Sie eine isolierte Kolonie aus dem gewünschten RNAi-Stamm in sterilen 15 mL konische Röhrchen mit 2 mL LB ergänzt mit 50 µg/mL Carbenicillin zu. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C 16 h in einem Orbitalschüttler bei 150 u/min.
  3. Am nächsten Tag verteilt 150 µL über Nacht gewachsenen Kultur auf 65 mm x 15 mm NGM RNAi Fütterung Teller mit einem sterilen Spreader. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h.
  4. Platten Sie die auf RT nach Inkubation bei 37 ° c abkühlen Fügen Sie eine entsprechende Volumen der M9W mit ~ 200 L1-Larven (synchrone Bevölkerung im Alter von Würmern Schritte entnommen), die E. Coli NGM RNAi Fütterung Platten ausgesät. Inkubieren Sie die Platten bei 20 ° C, bis die Larven der L4-Stadium (~2.5 Tage) erreichen.

6. Vorbereitung des Mitis Gruppe Streptokokken-Infektion

  1. Streifen, gewünschte Streptokokken-Stämme auf die 100 mm x 15 mm dein Agar (wenn Platten bei 4 ° C gelagert wurden, Vorwärmen der Platten auf 37 ° C vor dem Streifen der jeweiligen Stämme), inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C über Nacht (~ 18 h) in eine Kerze Glas bietet eine mikroaerophil En Umfeld für das Wachstum der Streptokokken (die gestreiften Platten können für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden).
  2. Verwenden Sie zur klinischen Isolaten von Streptokokken zu propagieren, tryptic Soy Blutagar. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in einem Kerze Glas über Nacht (~ 18 h).
  3. Am nächsten Tag die Platten aus dem Glas Kerze ausbauen und isolierte Kolonien mit einer sterilen Schleife wählen. 15 mL sterile konischen Röhrchen mit 2 mL deine Brühe zu impfen. Um zu klinischen Isolaten von Streptokokken zu propagieren, ergänzen die THY Brühe mit 5 % V/V Schafe Blut. Schließen Sie die Deckel fest und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C unter statischen Bedingungen.

(7) überleben Assays

Hinweis: Die Schritte in diesem Test sind in Abbildung 1dargestellt. Um nachzuweisen, dass die H2O2 durch die Mitis abgeleitet Gruppe ist verantwortlich für die Tötung des Wurms, die Medien mit Katalase oder Mutante ΔSpxB ergänzen und Ergänzung Stamm ΔSpxB; SpxB + S. Gordonii können verwendet werden. SpxB kodiert für eine Pyruvat-Oxidase, die für die Produktion von H2O2 im Gruppenrahmen Mitis verantwortlich ist.

  1. 35 mm x 10 mm Vorwärmen deine Platten auf 37 ° C. Fügen Sie 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen der gewünschten Sorten der Streptokokken und die Bakterien vollständig über die Agar-Oberfläche mit einem sterilen Spreader verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in einem Kerze Glas über Nacht (~ 18 h). Als Kontrolle Samen zwei 35 mm x 10 mm NGM Platten mit 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen von E. Coli OP50. Über Nacht inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C.
  2. Um zu bestätigen, dass H2O2 produziert von Mitis Gruppe verantwortlich für die Tötung der Würmer ist, fügen Sie 50 µL mit 1.000 Einheiten der Katalase c auf der THY Platte. Die Katalase-Lösung mit einem sterilen Spreader verteilt und die Platten zum Trocknen in die laminare Strömung für 30 min. Samen die Platten danach mit den jeweiligen Streptokokken-Stämme wie unter Punkt 7.1 beschrieben.
  3. Am nächsten Tag entfernen Sie die Platten aus dem Glas Kerze und wählen Sie die Platten auf RT für 10-15 min. mit einem sterilen Wurm abkühlen, Transfer 30 L4-Larven von der NGM oder NGM RNAi Fütterung Platten zu den Streptokokken ausgesät deine Platten. Verwendung zwei ausgesät deine Platten mit insgesamt 60 Würmer pro Stamm der Streptokokken. Inkubieren Sie die Platten bei 25 ° C.
  4. Mit einem sezierenden Mikroskop, die Anzahl der lebenden und Toten L4-Larven auf jeder Platte an mehreren Zeitpunkten. Zunächst Punkten Sie die Würmer als tot oder Leben Sie alle 30 Minuten. Danach, wenn Würmer schnell anfangen zu sterben, Punkten sie in 15 Minuten Intervallen. Verwenden Sie die sterile Wurm-Pick, um sanft prod die Würmer und festzustellen, ob sie tot oder lebendig sind. Ein Wurm ist tot betrachtet, wenn keine Bewegung als Reaktion auf das drängen.
  5. Der Test dauert ca. 5-6 h in Anspruch. Wiederhole das Experiment zwei weitere Male. Nach Abschluss des Tests bündeln Sie die Daten aus den beiden Platten. Geben Sie die Daten der einzelnen Gruppen, vergleichen Sie die Überleben Kurven und durchführen Sie Kaplan-Meier Analyse mittels statistischen Software.

8. Vorbereitung der Agarose-Pads für die Mikroskopie

  1. Lösen Sie 2 % w/V der Agarose in entionisiertem Wasser durch Erhitzen der Lösung in der Mikrowelle auf. Ein Volumen von 5 mL der Lösung ausreicht, um die 20 Folien vorzubereiten.
  2. Kleben Sie Lab-Band längs zwei Objektträger. Dies bestimmt die Dicke der Agarose-Pads. Legen Sie eine sauberes Glas Folie zwischen den zwei verschweißten Folien.
  3. Platz 100 µL der geschmolzenen Agarose auf der Mitte der Folie sauber. Legen Sie sofort ein anderes sauberes Glas auf die flüssige Agarose und drücken Sie sanft nach unten, um ein Pad zu machen. Lassen Sie die Agarose zu festigen und anschließend die obere Folie entfernen. Die Agarose-Pad ist einsatzbereit.

9. Beobachtung der SKN-1 Lokalisierung in Reaktion auf eine Streptokokken -Infektion

Hinweis: Die Schritte in diesem Test sind in Abbildung 2dargestellt. Lokalisierung von SKN-1 wurde unter Verwendung der SKN-1 b/C::GFP transgenen Wurm Belastung bestimmt. Lokalisierung von SKN-1 durch die Produktion von H2O2 Mitis Fraktion, Wildtyp (WT), ΔSpxB, und die Ergänzung Stamm ΔspxB; SpxB + S. Gordonii demonstrieren dienten. Darüber hinaus wurden die transgenen Reporter Belastung SKN-1 b/C::GFP und RNAi Störungen Technik zu demonstrieren, dass Komponenten des p38 MAPK-Signalwegs die Lokalisierung der SKN-1 regulieren verwendet.

  1. 35 mm x 10 mm Vorwärmen deine Platten auf 37 ° C. Fügen Sie 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen die gewünschte Stämme von Streptococcus und Bakterien vollständig über die Agar-Oberfläche mit einem sterilen Spreader verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in einem Kerze Glas über Nacht (~ 18 h). Als Kontrolle Samen drei 35 mm x 10 mm NGM Platten mit 80 µL über Nacht gewachsenen Kulturen von E. Coli OP50. Inkubieren Sie diese Platten bei 37 ° C für ~ 18 h.
  2. Am nächsten Tag aus dem Kerze Glas ausbauen Sie Platten und ermöglichen Sie die auf RT für 10-15 min. Waschen L4-Larven mit M9W von NGM abkühlen und NGM RNAi Fütterung Platten. Sammeln Sie die Würmer in 15 mL konische Röhrchen.
  3. Drehen Sie die Rohre bei 450 X g für 1 min. Dekantieren des Überstandes und 10 mL M9W.
  4. Wiederholen Sie Schritt 9.3 noch dreimal.
  5. Die Würmer in ~ 250 µL M9W Aufschwemmen und Platz drei 5 µL Tropfen Wurm-Suspension auf einer sauberen Petrischale Deckel und schätzen die Zahl der Würmer pro Mikroliter sezierenden Mikroskop.
  6. Jeder deiner Streptokokken ausgesät und NGM E. Coli ausgesät Platten fügen Sie hinzu ~ 100 L4-Larven. Verwenden Sie drei Platten pro Bakterienstamm. Inkubieren Sie die Platten für 2 bis 3 h bei 25 ° c
  7. Danach entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator, waschen Sie sie mit M9W und sammeln Sie die Würmer in 15 mL konische Röhrchen.
  8. Waschen Sie die Würmer 3 X im beschriebenen Schritte 9.3.
  9. Das Wurm-Pellet fügen Sie 500 µL M9W mit 2 mM Natrium-Azid oder 2 mM Tetramisole Hydrochlorid hinzu und entfernen Sie die meisten der M9W durch Absaugen. Dies wird die Würmer, um sicherzustellen, dass keine Bewegung tritt auf, wenn unter dem Mikroskop abgebildet zu betäuben.
    Vorsicht: Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), beim Umgang mit Natriumazid. Bereiten Sie die Azid-Lösung unter einer chemischen Kapuze.
  10. Inkubieren Sie die Wurm-Pellets für 15 min bei RT. Dann vor Ort 15 µL der Wurm Suspension auf einem vorbereiteten Agarose-Pad. Sanft lege einem Deckgläschen Nr. 1.5 über die Agarose-Pad mit den narkotisierten Würmer.
  11. Mit einem fluoreszierenden Mikroskop, visualisieren Sie die Lokalisierung der SKN-1 Verwendung FITC und DAPI-Filter. Bild-Würmer bei 10 X und 20 X Vergrößerungen.
  12. Punkten Sie die Würmer, die basierend auf der Ebene der Lokalisierung des SKN-1. Keine nukleare Lokalisierung, Lokalisation der SKN-1 b/C::GFP in der vorderen oder hinteren des Wurms und nukleare Lokalisierung von SKN-1 b/C::GFP in allen Darmzellen werden als niedrig, Mittel und hohes Maß an Lokalisierung, kategorisiert.
  13. Bestimmen Sie nach der Wertung der fluoreszierenden Mikrographen die statistischen Unterschiede von Chi-Quadrat und Fishers exakten Tests mit Statistiksoftware.

Ergebnisse

Mitglieder der der Mitis Gruppe S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii schnell getötet, die Würmer, im Gegensatz zu S. Mutans, S. Salivarius und nicht-pathogenen E. Coli OP50(Abbildung 3). Die mediane Überlebenszeit für S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii betrug 300 min., 300 min. bzw. 345 min.. Um festzustellen, ob die Tötung durch H2O2ve...

Diskussion

Die beschriebenen Methoden können verwendet werden, für andere pathogenen Bakterien wie Enterococcus Faecium, produziert auch H2O2 unter anaeroben angebaut oder mikroaerophil Bedingungen26. In der Regel für die meisten pathogenen Organismen dauert es mehrere Tage bis Wochen dauern die Überlebens-Assays. Jedoch konnte aufgrund der robusten Produktion von H2O2 von den Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, diese Tests innerhalb von 5-6 h unter ...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas School of Dentistry), Dr. Richard Lamont (University of Louisville, School of Dentistry) und Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) für die Bereitstellung von Labor- und klinische Stämme von Mitis Gruppe Streptokokken. Wir danken Dr. Keith Blackwell (Department of Genetics, Harvard Medical School) für die C. Elegans -Stämme. Zu guter Letzt danken wir Dr. Danielle Garsin und ihr Labor (The University of Texas, McGovern Medical School) für die Bereitstellung von Reagenzien und Wurm-Stämme zur Durchführung der Studie. Einige Stämme der Wurm erbrachten die CGC vom NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Media and chemicals
Agarose Sigma AldrichA9539-50G
Bacto peptone Fisher ScientificDF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated  Fisher ScientificB11947
BD Difco Agar Fisher ScientificDF0145-17-0
BD Difco LB BrothFisher ScientificDF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood)Fisher ScientificR01200
Calcium ChlorideFisher ScientificBP510-500
CarbenicillinFisher ScientificBP26481
Catalase Sigma AldrichC1345-1G
CholesterolFisher ScientificICN10138201
IPTGFisher ScientificMP21021012
Magnesium sulfateFisher ScientificBP213-1
NystatinAcros organicsAC455500050
Potassium Phosphate DibasicFisher ScientificBP363-500
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificBP362-500
Sodium AzideSigma AldrichS2002-25G
Sodium chloride Fisher ScientificBP358-1
Sodium HydroxideFisher ScientificSS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic Fisher ScientificBP332-500
Streptomycin Sulfate Fisher ScientificBP910-50
TetracyclinSigma Aldrich87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochlorideSigma AldrichL9756
Yeast extractFisher ScientificBP1422-500 
Consumables 
15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mLFisher Scientific07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mLFisher Scientific07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm)Fisher Scientific08-757-100A
No. 1.5  18 mm x 18 mm Cover SlipsFisher Scientific12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm)Fisher Scientific12-544-4
Software 
PrismGraphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis  
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
StrainGenotypeTransgeneSource
N2C. elegans wild isolateCGC
EU1skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)CGC
LD002IdIs1SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)Keith Blackwell

Referenzen

  1. Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  2. Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
  3. Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
  4. Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
  5. Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
  6. van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
  7. Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
  8. Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
  9. Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
  10. Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
  11. Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
  12. Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
  13. Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
  14. Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
  15. Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
  16. Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
  17. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
  18. Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
  19. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
  20. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  21. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
  22. Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
  23. Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
  24. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  25. An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
  26. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  27. Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
  28. Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Frage 145Caenorhabditis ElegansStreptokokkenEntwicklungsbiologieoxidativer StressSKN 1WasserstoffperoxidGLP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten