Estudando estresse oxidativo causado pelo estreptococos grupo Mitis em Caenorhabditis elegans

Resumo

O nemátodo Caenorhabditis elegans é um excelente modelo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui descrito é um protocolo para infectar o verme com membros dos estreptococos do grupo mitis e determinar a ativação da resposta stress oxidativo contra H₂O₂ , produzido por este grupo de organismos.

Resumo

Caenorhabditis elegans (c. elegans), um nematódeo de vida livre, tem emergido como um modelo atraente para estudar interações patógeno-hospedeiro. O protocolo apresentado usa esse modelo para determinar a patogenicidade causada por estreptococos de grupo o mitis através da produção de H₂O₂. Os estreptococos do grupo mitis são uma ameaça emergente que causam muitas doenças humanas tais como bacteremia, endocardite e celulite orbital. Aqui descrito é um protocolo para determinar a sobrevivência destes vermes em resposta a H₂O₂ produzido por este grupo de patógenos. Usando a codificação de skn-1 gene para um fator de transcrição de resposta de estresse oxidativo, é mostrado que este modelo é importante para a identificação de genes do hospedeiro que são essenciais contra a infecção estreptocócica. Além disso, é mostrado que a ativação da resposta ao estresse oxidativo pode ser monitorada na presença desses patógenos utilizando uma cepa de worm repórter transgénicas, no qual SKN-1 é fundido a proteína verde fluorescente (GFP). Estes ensaios fornecem a oportunidade de estudar a resposta de estresse oxidativo de H₂O₂ , derivada de uma fonte biológica, ao contrário de forma exógena adicionado fontes de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio.

Introdução

Estreptococos do grupo mitis são humanos comensais da cavidade orofaríngea¹. No entanto, estes organismos podem escapar deste nicho e causar uma variedade de doenças invasivas². As infecções causadas por esses microorganismos incluem a bacteremia, endocardite e celulite orbital de^2,3,4,5,6. Além disso, eles estão surgindo agentes como causadores de infecções da corrente sanguínea em imunocomprometidos, intermitente e pacientes com câncer submetidos a quimioterapia^5,7,8,9 .

Os mecanismos subjacentes mitis patogênese de grupo é obscura, porque foram identificados alguns factores de virulência. O grupo mitis é conhecido por produzir H₂O₂, que tem se mostrado um importante papel em comunidades microbianas oral¹⁰. Mais recentemente, vários estudos têm destacado um papel para H₂O₂ como um cytotoxin que induz a célula epitelial morte^11,12. Pneumonia de S., que pertence a este grupo, foi mostrado para produzir altos níveis de H₂O₂ , que induz os danos do DNA e apoptose em células alveolar¹³. Usando um modelo animal de pneumonia aguda, os mesmos pesquisadores demonstraram que a produção de H₂O₂ pela bactéria confere uma vantagem de virulência. Estudos sobre meningite pneumocócica também têm demonstrado que patógeno-derivado H₂O₂ atua em sinergia com pneumolysin para acionar a célula neuronal morte¹⁴. Estas observações estabelecem claramente que H₂O₂ produzido por este grupo de bactérias é importante para sua patogenicidade.

Curiosamente, ele também foi mostrado que os membros da mitis grupo S. mitis e s. oral provoca a morte do nemátodo c. elegans através da produção de H₂O₂^15,16. Este nematódeo de vida livre tem sido usado como um modelo simples, geneticamente tractable estudar muitos processos biológicos. Mais recentemente, o worm tem emergido como um modelo para o estudo de^17,de interações patógeno-hospedeiro¹⁸. Além disso, diversos estudos evidenciaram a importância de se estudar o estresse oxidativo usando este organismo^19,20,21. Seu ciclo de vida curto, a capacidade de "knockdown" genes de interesse por RNAi e uso de proteína fluorescente verde (GFP)-fundidos repórteres para monitorar a expressão do gene são alguns dos atributos que o tornam um sistema modelo atraente. Mais importante, as vias que regulam o estresse oxidativo e imunidade inata no worm são altamente conservadas com mamíferos^20,22.

Neste protocolo, que é demonstrado como usar c. elegans para elucidar a patogenia causada por estreptococos-derivado H₂O₂. Um ensaio de sobrevivência modificada é mostrado, e membros do grupo mitis são capazes de matar os vermes rapidamente através da produção de H₂O₂. Usando os membros do grupo mitis, uma fonte biológica sustentado de espécies reativas de oxigênio (ROS) é fornecido, ao contrário de fontes químicas que induzem o stress oxidativo nos vermes. Além disso, as bactérias são capazes de colonizar as minhocas rapidamente, que permite a H₂O₂ ser direcionados diretamente para as células intestinais (em comparação com outras fontes que têm de atravessar várias barreiras). O ensaio é validado ou 1) por determinar a sobrevivência da estirpe mutante skn-1 ou 2) por derrubando skn-1 usando RNAi em worms em relação a N2 selvagem-tipo e vermes Tratado de controle de vetor. SKN-1 é um fator de transcrição importante que regula a resposta de estresse oxidativo em c. elegans^23,24,25. Além de ensaios de sobrevivência, uma estirpe de worm expressando um repórter transgénico SKN-1B/C::GFP é usada para monitorar a ativação da estresse oxidativo resposta através da produção de H₂O₂ pelo grupo mitis.

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Protocolo

1. preparação do vossos placas de ágar (extrato de levedura de Todd-Hewitt)

1. Para 1 litro de mídia, adicione 30 g de pó de Todd-Hewitt, 2 g de extrato de levedura e 20 g de ágar para um Erlenmeyer de 2 L. Adicionar 970 mL de água desionizada para o conteúdo do frasco e incluir uma barra de agitação. Autoclave a mídia a uma temperatura de 121 ° C e pressão de 15 lb/pol² por 30 min. Depois disso, definir os meios de comunicação em uma placa de agitação e permitir para resfriamento com agitação suave.
2. Despeje a mídia apropriadamente dimensionados pratos de Petri estéril (pratos de 100 x 15 mm para o crescimento e manutenção de bactérias, pratos de 35 x 10 mm para matar ensaios) sob um fluxo laminar. Permitir que os meios de comunicação secar por 2 h no capô laminar. Depois disso, as placas podem ser armazenadas a 4 ° C para 1 mês.

2. preparação do nematoide crescimento médio (NGM) e RNAi alimentando as placas (NGM RNAi)

1. Usando uma barra de agitação, dissolva 2,5 g de peptona e 3 g de NaCl em 970 mL de água desionizada num balão de Erlenmeyer de 2 L. Adicione 20 g de ágar-ágar para a mídia. Autoclave a mídia à temperatura de 121 ° C e à pressão de 15 lb/pol² por 30 min. definir os meios de comunicação em uma placa de agitação e permite para resfriamento com agitação suave.
2. Adicionar as seguintes soluções para a mídia para preparação de placas NGM: 25 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1ml de colesterol (5 mg/mL em etanol a 95%) , 1 mL de nistatina (v/w de 10% em etanol) e 1 mL de estreptomicina 25 mg/mL.
3. Adicionar as seguintes soluções para a mídia para preparação de RNAi NGM placas de alimentação: 25 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1ml de colesterol (5 mg/mL em etanol a 95%) , 1 mL de nistatina (v/w de 10% em etanol), 1 mL de carbenicilina 50mg/mL e 1 mL de IM IPTG.
4. Despeje a mídia 60 x 15 mm pratos de Petri estéril sob fluxo laminar. Permitir que os meios de comunicação secar por 2 h no capô laminar. Posteriormente, as placas podem ser armazenadas a 4 ° C para 1 mês.

3. manutenção de c. elegans

1. Semente as placas NGM por manchar 50 µ l de pernoite crescido Escherichia coli OP50 no centro das placas. A cultura de e. coli é preparada anteriormente na mídia de Luria-Bertani (LB) e armazenada a 4 ° C por vários meses. Cobrir as placas e deixar secar por 24 h sob uma capa laminar e posteriormente armazenar as placas em poliestireno recipiente.
2. Sob um microscópio de dissecação, pegar de 10 a 12 adultos grávidos usando uma picareta worm estéril e transferir os vermes de uma Escherichia coli OP50 semeado placa NGM. Incube as placas a 20 ° C durante a noite.
3. No dia seguinte, retire os adultos usando uma picareta worm estéril e permitir que os embriões desenvolver a larvas L4 a 20 ° C (~2.5 dias).

4. preparação da população em idade síncrono de Worms

1. Lave gravid adultos entre dois e quatro placas NGM usando M9W e cobrá-los em um tubo cônico de 15 mL.
   1. Para preparar M9W: combine 3 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄e 3 g de KH₂PO₄ e dissolver em um volume final de 1L de água desionizada. Autoclave a solução e adicionar 1 mL de 1 M MgSO₄.
2. Girar o tubo a 450 x g por 1 min, em seguida, decante o sobrenadante, garantindo simultaneamente que a pelota worm permanece intacta.
3. Adicione 400 µ l de 8,25% de hipoclorito de sódio (água sanitária) e 100 µ l de 5 N NaOH para preparar a solução de lise de verme. Adicionar a solução de Lise para a pelota de verme e misturar o conteúdo por agredir o tubo até 70% dos vermes adultos lysed. Observe periodicamente o conteúdo do tubo sob um microscópio dissecação para garantir que não há nenhum overbleaching dos ovos.
4. Dilua a mistura de água sanitária, adicionando 10 mL de M9W para o conteúdo do tubo cónico.
5. Girar o tubo a 450 x g por 1 min. decantar sobrenadante e, em seguida, adicionar 10 mL de M9W.
6. Repita o passo 4,5 mais duas vezes.
7. Resuspenda o pellet de ovo resultante em 3-5 mL de M9W. Coloca o tubo em rotacao do tubo. Permitir que os tubos girar a uma velocidade de 18 rpm na temperatura de quarto (RT) durante a noite.
8. No dia seguinte, gire o tubo a 450 x g por 1 min para as larvas L1 de Pelotas. Remova a maioria dos M9W por aspiração, deixando para trás a ~ 250 µ l de líquido no tubo. Resuspenda as larvas L1 e gotas de lugar três 5 µ l de suspensão de worm em uma tampa da placa de Petri e, em seguida, estimativa do número de vermes por µ l utilizando um microscópio de dissecação.

5. indução de RNAi em Worms

1. Usando um estéril loop ou escolher, raia para fora as tensões desejadas de RNAi contendo Escherichia coli dos estoques congelados (bibliotecas Ahringer e Vidal) em placas de 100 x 15 mm LB ágar contendo 50 carbenicilina µ g/mL e 15 µ g/mL de tetraciclina. Incube as placas a 37 ° C por 24 h.
2. Escolher e inocular uma colônia isolada da estirpe desejada RNAi para tubos cônicos estéril 15 mL, contendo 2 mL de LB suplementado com 50 carbenicilina µ g/mL. Incube os tubos a 37 ° C durante 16 h em um agitador orbital a 150 rpm.
3. No dia seguinte, espalhou-se a 150 µ l de cultura adulta durante a noite nas chapas de alimentação 65 x 15 mm RNAi NGM usando um espalhador estéril. Incube as placas a 37 ° C por 24 h.
4. Permitir que as placas esfriar a RT após incubação a 37 ° C. Adicione um volume adequado de M9W contendo larvas de L1 ~ 200 (obtidas de população em idade síncrono de passos de vermes) para a e. coli semeado NGM RNAi alimentando as placas. Incube as placas a 20 ° C até que as larvas chegam à fase de L4 (~2.5 dias).

6. preparação de estreptococos grupo Mitis para infecção

1. Raia fora desejadas cepas de estreptococos na 100 x 15 mm THY agar (se placas foram armazenadas a 4 ° C, pré-aquecer as placas a 37 ° C antes as respectivas tensões), então, incubar as placas a 37 ° C durante a noite (~ 18 h) em um frasco de vela proporcionando um pt microaerófila kapacitet para o crescimento dos estreptococos (as placas listras podem ser armazenadas por uma semana a 4 ° C).
2. Para propagar isolados clínicos de estreptococos, use tryptic soy agar de sangue. Incube as placas a 37 ° C em uma jarra de vela durante a noite (~ 18 h).
3. No dia seguinte, retirar as placas do frasco vela e escolher colónias isoladas utilizando uma ansa estéril. Inocule tubos de cônico estéril 15 mL, contendo 2 mL de caldo de THY. Para propagar isolados clínicos de estreptococos, completar o teu caldo com 5% v/v de sangue de ovelha. Feche as tampas apertadas e incubar os tubos a 37 ° C em condições estáticas.

7. ensaios de sobrevivência

Nota: As etapas envolvidas neste ensaio são descritas na Figura 1. Para demonstrar que o H₂O₂ derivada pelo mitis grupo é responsável pela morte do verme, complementar a mídia com catalase, ou a estirpe mutante ΔspxB e complemento estirpe ΔspxB; spxB + de S. gordonii pode ser usado. SpxB codifica para uma oxidase piruvato, que é responsável pela produção de H₂O₂ no grupo mitis.

1. Pré-aquecer 35 x 10 mm THY placas a 37 ° C. Adicione 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite das cepas de estreptococos desejadas e espalhar as bactérias completamente em toda a superfície do ágar usando um espalhador estéril. Incube as placas a 37 ° C em uma jarra de vela durante a noite (~ 18 h). Como um controle, placas NGM semente dois 35 x 10 mm com 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite de e. coli OP50. Incube as placas a 37 ° C durante a noite.
2. Para confirmar que o H₂O₂ , produzido pelo grupo mitis é responsável pela morte dos vermes, adicionar 50 µ l contendo 1.000 unidades de catalase c para o teu prato. Espalhar a solução da catalase usando um espalhador estéril e permitir que as placas secar no fluxo laminar durante 30 min. semente as placas posteriormente com as cepas de estreptococos respectivos conforme descrito na etapa 7.1.
3. No dia seguinte, retirar as placas do frasco vela e permitem escolher as placas arrefecer à RT de 10-15 min. usando um verme estéril, transferência 30 L4 larvas da NGM ou RNAi NGM alimentando as placas para o estreptococo semearam THY placas. Uso dois semeado teus pratos com um total de 60 vermes por cepa de streptococcus. Incubar as placas a 25 ° C.
4. Usando um microscópio de dissecação, conte o número de larvas de L4 ao vivo e mortos em cada prato em vários momentos. Inicialmente, marcar os vermes como morto ou vivo a cada 30 min. Daí em diante, quando vermes rapidamente começam a morrer, marcá-las em intervalos de 15 min. Use a palheta worm estéril suavemente prod os vermes e determinar se eles estão vivos ou mortos. Um worm é considerado morto, se não houver nenhum movimento em resposta para o estímulo.
5. O ensaio vai levar 5-6 h para completar. Repeti o experimento mais duas vezes. Após a conclusão do ensaio, agrupe todos os dados de ambas as placas. Os dados de cada grupo de entrada, comparar as curvas de sobrevivência e realizar a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier usando o software estatístico.

8. preparação das almofadas de Agarose para microscopia

1. Dissolva 2% w/v de agarose em água desionizada aquecendo a solução em um microondas. Um volume de 5 mL de solução é adequado para preparar 20 slides.
2. Cole a fita de laboratório longitudinalmente ao longo de duas lâminas de vidro. Isto irá determinar a espessura das almofadas do agarose. Coloque uma lâmina de vidro limpa entre os dois slides gravadas.
3. Lugar de 100 µ l de agarose derretido no centro do slide limpo. Colocar imediatamente outro copo limpo em cima o agarose derretido e pressione suavemente para baixo para fazer uma almofada. Permitir que a agarose solidificar e posteriormente retirar a lâmina superior. A almofada de agarose é pronta para uso.

9. observação do SKN-1 localização em resposta à infecção de estreptococos

Nota: As etapas envolvidas neste ensaio são representadas na Figura 2. Localização de SKN-1 foi determinada utilizando a cepa de transgénicos worm SKN-1B/C::GFP. Para demonstrar a localização do SKN-1 devido à produção de H₂O₂ pelo grupo mitis, selvagem-tipo (WT), ΔspxB e o complemento estirpe ΔspxB; spxB + de S. gordonii foram usados. Além disso, a cepa transgênica repórter SKN-1B/C::GFP e a técnica de interferência RNAi foram usados para demonstrar que os componentes da via MAPK p38 regulam a localização do SKN-1.

1. Pré-aquecer 35 x 10 mm THY placas a 37 ° C. Adicione 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite das estirpes de streptococcus desejadas e espalhar as bactérias completamente em toda a superfície do ágar usando um espalhador estéril. Incube as placas a 37 ° C em uma jarra de vela durante a noite (~ 18 h). Como um controle, placas NGM semente três 35 x 10 mm com 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite de e. coli OP50. Incube as placas a 37 ° C ~ 18 h.
2. No dia seguinte, remover placas do frasco vela e permitir que as placas para esfriar a RT para larvas de lavagem L4 de 10-15 min. usando M9W de NGM e NGM RNAi placas de alimentação. Recolha os vermes em tubos cônico de 15 mL.
3. Gire os tubos a 450 x g por 1 min. decantar o sobrenadante e adicionar 10 mL de M9W.
4. Repita o passo 9.3 mais três vezes.
5. Resuspenda as minhocas em ~ 250 µ l de M9W e lugar gotas de 3 a 5 µ l de suspensão de worm em uma prato de Petri limpo tampa e estimar o número de vermes por µ l utilizando um microscópio de dissecação.
6. Adicione as larvas L4 de ~ 100 a cada teu estreptococos semeado e NGM Escherichia coli semeado de placas. Use três placas por cepa de bactérias. Incubar as placas durante 2 a 3 h a 25 ° C.
7. Depois disso, retire as placas da incubadora, lavá-los com M9W e coletar os vermes em tubos cônico de 15 mL.
8. Lave os vermes 3 x, conforme descrito em passos 9.3.
9. Remover a maior parte do M9W por aspiração e adicionar 500 µ l de M9W contendo 2 mM hidrocloreto de sódio azida ou 2mm tetramisole ao pellet de verme. Isso irá anestesiar os vermes, garantindo que nenhum movimento ocorre quando imaginada sob o microscópio.
   Atenção: Use equipamentos de proteção individual (EPI) ao manusear a azida de sódio. Prepare a solução de azida sob uma capa de química.
10. Incube as pelotas de worm em RT por 15 min. Então, ponto 15 µ l de suspensão de worm em um bloco de agarose preparado. Coloque delicadamente uma lamela n. º 1.5 sobre a almofada de agarose contendo os sem-fins anestesiados.
11. Usando um microscópio fluorescente, visualize a localização do SKN-1 utilizando filtros FITC e DAPI. Vermes de imagem em 10x e 20 x de ampliações.
12. Marca os vermes baseados no nível de localização do SKN-1. Nenhuma localização nuclear, localização de SKN-1B/C::GFP na anterior ou posterior do worm e localização nuclear da SKN-1B/C::GFP em todas as células intestinais são categorizados como baixa, média e altos níveis de localização, respectivamente.
13. Depois de marcar as micrografias fluorescentes, determine as diferenças estatísticas por chi-quadrado e testes exatos de Fisher, usando o software estatístico.

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Resultados

Membros do mitis grupo S. mitis, S. oral e S. gordonii rapidamente mataram os vermes, ao contrário de S. mutans, S. salivarius e não-patogênicas de Escherichia coli OP50(Figura 3). A sobrevida mediana para S. mitis, S. oral e S. gordonii foi 300 min, 300 min e min 345, respectivamente. Para determinar se a matança foi mediada por H₂O₂, c...

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Discussão

Os métodos descritos podem ser usados para outras bactérias patogénicas como Enterococcus faecium, que também produz H₂O₂ crescidas sob anaeróbio ou microaerofílicas condições²⁶. Normalmente, para os organismos patogénicos mais, demora vários dias a semanas para completar os ensaios de sobrevivência. No entanto, devido à produção de robusta de H₂O₂ por membros do grupo mitis, estes ensaios podem ser concluídos no prazo de 5-6 h, n...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
Bacto peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated	Fisher Scientific	B11947
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood)	Fisher Scientific	R01200
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP26481
Catalase	Sigma Aldrich	C1345-1G
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
Tetracyclin	Sigma Aldrich	87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride	Sigma Aldrich	L9756
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Consumables
15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL	Fisher Scientific	07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-100A
No. 1.5  18 mm x 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
N2	C. elegans wild isolate		CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell