線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

要約

線虫の線虫は、宿主-病原体相互作用を分析する優れたモデルです。ここで説明した、可鍛鋳鉄群連鎖球菌のメンバーとワームに感染し、H₂O₂を有機体のこのグループによって生成に対する酸化ストレス応答の活性化を決定するプロトコルです。

要約

線虫 (C. elegans)、線虫は、ホスト病原体の相互作用を研究する魅力的なモデルとして登場しました。提案するプロトコルは、H₂O₂の生産を介して可鍛鋳鉄群連鎖球菌によって引き起こされる病原性を決定するため、このモデルを使用します。可鍛鋳鉄群連鎖球菌菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎など多くの疾患を引き起こす新たな脅威であります。ここで説明した H₂O₂への応答でこれらのワームの生存を確認するためのプロトコルが病原体のこのグループによって生成されます。酸化ストレス応答転写因子の遺伝子skn 1エンコーディングを使用して、このモデルはレンサ球菌感染に対して不可欠な宿主遺伝子を識別するために重要であることを示す.さらに、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、SKN 1 を融合遺伝子改変レポーター ワームひずみを用いたこれらの病原体の存在下で酸化ストレス応答の活性化を監視できることを示します。これらのアッセイは、H₂O₂を外ではなく、生物学的ソースによって派生する酸化ストレス応答を勉強する機会が活性酸素種 (ROS) ソースを追加提供します。

概要

可鍛鋳鉄群連鎖球菌は、口腔咽頭腔¹の人間共生生物です。ただし、これらの生物はこのニッチを脱出し、侵襲性疾患²のさまざまなを引き起こすことができます。これらの微生物によって引き起こされる感染症は、菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎^2,3,4,5,6に含まれます。さらに、彼らは浮上して血流感染症の病原体としての免疫不全、好中球減少、および化学療法^5,7,8,9^{を受けている癌患者}.

可鍛鋳鉄グループの根本的な発生機序はあいまいなので、いくつかの病原因子が同定されているメカニズムです。H₂O₂、口腔微生物¹⁰で重要な役割を果たすことを示している可鍛鋳鉄グループが知られています。最近では、いくつかの研究は、上皮細胞の死^11,12を誘導する毒素としての H₂O₂の役割を強調しています。このグループに属しているs. 肺炎は、DNA 損傷と肺胞細胞¹³でアポトーシスを誘導する H₂O₂の高レベルを生成する示されています。急性肺炎動物モデルを使用して、同じ研究者は、細菌によって H₂O₂の生産が病原性の利点を付与を示した。肺炎球菌性髄膜炎に関する研究は、その病原体由来 H₂O₂は神経細胞死¹⁴をトリガーするニューモリシンと相乗的行為をも示しています。これらの観察は明らかに病原性の細菌のこのグループによって生成される、H₂O₂が大事を確立します。

興味深いことに、それも示されている、可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤H₂O₂^15,16の生産を介して線虫C. elegansの死を引き起こす口腔単純性疱疹を米します。この線虫は、多くの生物学的過程を研究する、シンプルで扱いやすい遺伝子モデルとして使用されています。最近では、ワームは、宿主-病原体相互作用^17,18を研究するモデルとして登場しました。さらに、いくつかの研究は、この有機体^19,20,21を使用して酸化ストレスを調査する重要性を強調しています。そのライフ サイクルは短い、RNAi が興味の遺伝子をノックダウンし、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の使用能力-融合レポーター遺伝子の発現を監視する、いくつかの魅力的なモデル システムにする属性。もっと重要なは、酸化ストレスとワームの自然免疫を調節する経路は哺乳類^20,22と非常に節約されます。

このプロトコルではc. の elegansを使用してレンサ球菌由来 H₂O₂による病原性を解明する方法を示した。変更された生存分析が表示され、可鍛鋳鉄グループのメンバーが急速にワームを殺すことでH₂O₂の生産。活性酸素種の持続的な生物的源可鍛鋳鉄グループのメンバーを使用してこの (ROS) がワームで酸化ストレスを誘発する化学のソースではなく、提供されます。さらに、細菌は急速に、ワームを植民地化することができる H₂O₂ (いくつかの障壁を交差する必要がある他の情報源と比較して) 腸管細胞へ直接ターゲットとすることができます。アッセイは、どちらかskn 1変異株のまたは 2) N2 野生型を基準にしてワームおよびベクター駆除処理されたワームで RNAi を用いたskn 1ノックダウンの生存を決定する 1) によって検証されます。SKN 1 はc. の elegans^23,24,25の酸化ストレス応答を調節する重要な転写因子です。生存の試金、以外 SKN-1 b/C::GFP 遺伝子改変レポーターを表現するワームひずみは可鍛鋳鉄グループによる活性化、酸化ストレス応答を介してH₂O₂の生産を監視するために使用されます。

プロトコル

1. 汝 (トッド ・ ヒューイット酵母エキス) 寒天の調製

1. メディアの 1 L は、トッド ・ ヒューイット パウダー、酵母エキスと 2 L の三角フラスコに寒天 20 g 2 g の 30 g を追加します。970 mL の脱イオン水をフラスコの内容に追加し、攪拌棒を含めます。オートクレーブ 15 ポンド/インチ² 30 分のための 121 ° C の温度及び圧力でメディア。その後、メディアを撹拌プレート上に設定し、穏やかな攪拌しながら冷却を可能にします。
2. 層流の下で適切に大きさで分類された滅菌シャーレ (35 × 10 mm 皿でアッセイを殺す細菌の成長と維持のため 100 mm × 15 mm 皿) にメディアを注ぐ。層流フードの下で 2 時間乾燥するメディアを許可します。その後、プレートを 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。

2. 線虫培 (NGM) と RNAi プレート (NGM RNAi) の供給の準備

1. 攪拌棒を使用して、2.5 g ペプトンと 970 ml の脱イオン水 2 L の三角フラスコでの塩化ナトリウム 3 g を溶解します。寒天 20 g をメディアに追加します。オートクレーブ 15 ポンド/インチ² 30 分のための 121 ° C の温度及び圧力でメディア撹拌プレートにメディアを設定し、穏やかな攪拌しながら冷却を可能にします。
2. NGM プレートの準備のためメディアに以下のソリューションを追加: 25 mL の 1 M カリウム リン酸バッファー (pH = 6.0)、1 M MgSO₄、1 M CaCl₂、(95% エタノールに 5 mg/mL) コレステロールの 1 mL の 1 mL の 1 mL、1 mL (10% のエタノールで v/w) ナイスタチンと 25 mg/mL ストレプトマイシンの 1 mL。
3. NGM RNAi プレートを給餌の準備のためメディアに以下のソリューションを追加: 25 mL の 1 M カリウム リン酸バッファー (pH = 6.0)、1 M MgSO₄、1 M CaCl₂、(95% エタノールに 5 mg/mL) コレステロールの 1 mL の 1 mL の 1 mL、(10% のエタノールで v/w) ナイスタチンの 1 mL、50 mg/mL carbenicillin 1 mL と IM IPTG の 1 mL。
4. 層流の下で滅菌シャーレ 60 mm × 15 mm にメディアを注ぐ。層流フードの下で 2 時間乾燥するメディアを許可します。その後、1 ヶ月、4 ° C でプレートを格納できます。

3. c. の elegansのメンテナンス

1. シード一晩 50 μ L スポッティングによる NGM 板には、プレートの中央にエシェリヒア属大腸菌OP50 が栽培されています。大腸菌文化はルリア ベルターニカミラ (LB) メディアに事前に準備し、数ヶ月のための 4 ° C で保存します。プレートをカバーし、層流フードの下で 24 時間乾燥し、その後プレートをポリスチレン容器に格納できるようにします。
2. 解剖顕微鏡の下で滅菌ワーム ピックを使用して妊娠大人 12 名に 10 をピックアップし、大腸菌にワームを転送 OP50 シード NGM プレート。20 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
3. 次の日は滅菌ワーム ピックを使用して大人を削除し、20 ° c (~2.5 日) L4 幼虫に成長する胚を許可します。

4. 人口ワームの同期の準備

1. 2 M9W を使用して 4 つの NGM プレートから妊娠の大人を洗浄し、15 mL の円錐管でそれらを収集します。
   1. M9W を準備する: 塩化ナトリウム 3 g、6 g の Na₂HPO₄KH₂PO₄の 3 g を結合し、最終的な量 1 L の脱イオン水に溶解します。オートクレーブ ソリューション 1 M MgSO₄の 1 つの mL を追加。
2. 1 分の 450 x gでチューブをスピンし、ワームのペレットがままを確保しつつ、上清をデカントします。
3. 8.25% ナトリウム次亜塩素酸 (家庭用漂白剤) の 400 μ L とワームの換散ソリューションを準備する 5 N NaOH の 100 μ L を追加します。ワーム ペレットを溶解ソリューションを追加し、大人のワームの 70% が分離するまで管をフリックで内容をミックスします。卵の overbleaching がないように解剖顕微鏡下でチューブの内容を定期的に観察します。
4. M9W の 10 mL をコニカル チューブの内容に追加することで漂白剤ミックスを希釈します。
5. 1 分デカント上澄みの 450 x gでチューブをスピンし、M9W の 10 mL を追加します。
6. 4.5 の手順を 2 回繰り返します。
7. 3-5 ml M9W 結果卵ペレットを再懸濁します。チューブ回転にチューブを置きます。一晩常温 (RT) 18 rpm の速度で回転するチューブを許可します。
8. 次の日は、L1 幼虫を餌に 1 分間、450 x gでチューブをスピンします。管の液体の ~ 250 μ L を残して、吸引によって M9W のほとんどを削除します。L1 幼虫を再懸濁します、シャーレの蓋、解剖顕微鏡を用いた μ L 当たりワーム数を推定上にワーム懸濁液の場所 3 5 μ L が値下がりしました。

5. ワームの RNAi の誘導

1. 生殖を使用してループやピックアップ、50 μ G/ml carbenicillin とテトラサイクリンの 15 μ G/ml を含む 100 mm × 15 mm LB 寒天プレートの上に冷凍株 (Ahringer とヴィダル ライブラリ) から必要な RNAi を含む大腸菌系統を連勝。24 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。
2. ピックアップし、50 μ G/ml carbenicillin を添加した LB の 2 mL を含む滅菌 15 mL の円錐管に、RNAi ひずみから隔離されたコロニーを接種します。150 rpm で軌道シェーカーの 16 h の 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
3. 次の日は 150 μ L 滅菌スプレッダーを使用して 65 mm × 15 mm NGM RNAi 給餌プレートの上に一晩培養の広がった24 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。
4. 37 ° C で培養後 RT に冷却板を許可します。大腸菌(ワーム ステップの人口同期から取得) ~ 200 L1 幼虫を含む M9W の適切なボリューム シード餌板 NGM RNAi を追加します。幼虫 L4 段階 (~2.5 日) に達するまでは、20 ° C で版を孵化させなさい。

6 可鍛鋳鉄群連鎖球菌の感染症のための準備

1. 汝の寒天 100 mm × 15 mm の希望菌株のレンサ球菌を連勝 (プレートが 4 ° C で保存されている場合事前ウォーム プレートは 37 ° C それぞれの菌株をストリー キングする前に)、微好気の en を提供するキャンドル瓶に 37 ° C 一晩 (~ 18 h) でプレートをインキュベート(縞板は 4 ° C で 1 週間保存できます) レンサ球菌の成長のための環境。
2. レンサ球菌の臨床分離株を反映するには、トリプシン大豆血液寒天培地を使用します。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
3. 次の日はキャンドル瓶からプレートを取り外して滅菌ループを使用して隔離されたコロニーを拾います。汝の液 2 mL を含む 15 mL 滅菌円錐管を接種します。レンサ球菌の臨床分離菌を繁殖させる補完 THY ヒツジ血の 5 %v/v とスープ。タイトなキャップを閉じ、静的条件下 37 ° C でチューブを孵化させなさい。

7 試金のサバイバル

注:このアッセイに必要な手順は、図 1に描かれています。グループはワームの殺害を担当、可鍛鋳鉄で H₂O₂が派生したことを示すため、カタラーゼ、または変異株 ΔspxBとメディアを補完し、補完するひずみ ΔspxB; spxB + s. gordoniiのことができます。使用します。SpxB は、H₂O₂剤群の生産に責任があるピルビン酸オキシダーゼをエンコードします。

1. 35 × 10 mm をあらかじめ暖かい 37 ° c. に汝のプレートレンサ球菌の目的の系統の一晩の栽培文化の 80 μ L を追加し、滅菌スプレッダーを使用して寒天表面に細菌を完全に 。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。としてコントロール、エシェリヒア属大腸菌OP50 の一晩の栽培文化の 80 μ L でシード 2 35 ミリメートル × 10 mm NGM プレート。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
2. H₂O₂可鍛鋳鉄グループ プロデュースがワームの殺害に責任があることを確認、追加、なたにカタラーゼ c の 1,000 台を含む 50 μ L プレート。滅菌スプレッダーを使用してカタラーゼ溶液を広がり、30 分シードそれぞれ連鎖球菌株手順 7.1 で説明されているようでその後プレートを層流で乾燥するプレートを許可します。
3. 次の日キャンドル瓶からプレートを削除でき、滅菌ワームを使用して 10-15 分の RT に冷却するプレートを選ぶ、NGM またはレンサ球菌にプレートを供給 NGM RNAi から転送 30 L4 幼虫シード汝のプレートが。2 シード株のレンサ球菌あたり 60 ワームの合計で汝のプレートです。25 ° C で版を孵化させなさい
4. 解剖顕微鏡を使用して、各板いくつか縦長時ライブとデッドの L4 幼虫の数をカウントします。当初は、死者のようにワームをスコア、またはライブ 30 分毎。その後、ワームは急速に死に始め場合、は、15 分間隔でそれらをスコアします。優しくデッドオアア ライブかどうかワームを突くし滅菌ワーム ピックを使用します。ワームは動き、催促に応答がない場合、死者と見なされます。
5. アッセイは、完了する 5 〜 6 時間かかります。2 回以上の実験を繰り返します。分析が完了したら、2 つのプレートからデータをプールします。各グループのデータを入力、生存曲線を比較し、統計ソフトを用いたカプラン ・ マイヤー生存分析を実行します。

8. Agarose パッドの顕微鏡検査のための準備

1. 電子レンジでソリューションを加熱することによって 2 %w/v 脱イオン水で寒天を溶解します。5 mL の溶液の量が 20 スライドを準備する十分です。
2. ラボのテープの 2 つのガラス スライドに沿って縦棒します。これは agarose パッドの厚さを決定します。録音された 2 つのスライドの間のきれいなガラス スライドを配置します。
3. きれいなスライドの中央に溶融 agarose の場所 100 μ L。すぐに溶融 agarose の上に別のきれいなガラスを置き、軽くパッドを作成する押し下げます。アガロースを固めるし、その後一番上のスライドを削除するを許可します。アガロース パッドは使用可能です。

9.連鎖球菌感染に応答 SKN 1 局在の観察

注:このアッセイに必要な手順は、図 2で描かれています。SKN 1 のローカリゼーションは、SKN-1 b/C::GFP トランスジェニック ワームひずみを使用して決定されました。(WT) H₂O₂可鍛鋳鉄のグループは、野生型の生産のため SKN 1 のローカライズ、ΔspxB、およびを補体ひずみΔspxB; spxB + s. gordoniiを示すために使用されました。さらに、遺伝子改変レポーターひずみ SKN-1 b/C::GFP と RNAi 干渉は、p38 MAPK 経路のコンポーネントが SKN 1 のローカリゼーションを規制することを示すため使用されました。

1. 35 × 10 mm をあらかじめ暖かい 37 ° c. に汝のプレート連鎖球菌の目的の系統の一晩の栽培文化の 80 μ L を追加し、滅菌スプレッダーを使用して寒天表面に細菌を完全に 。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。としてコントロール、エシェリヒア属大腸菌OP50 の一晩の栽培文化の 80 μ L でシード 3 35 ミリメートル × 10 mm NGM プレート。37 ° C 〜 18 時間でこれらの版を孵化させなさい。
2. 次の日、キャンドル瓶からプレートを削除、NGM から M9W を使用して 10-15 分洗浄 L4 幼虫の RT に冷却するプレートと NGM RNAi 給餌プレート。15 mL の円錐管にワームを収集します。
3. 450 x gで 1 分間、上清をデカントでチューブをスピンし、M9W の 10 mL を追加します。
4. 9.3 のステップを 3 回繰り返します。
5. M9W の ~ 250 μ L でワームを再懸濁し、きれいなペトリ皿にワーム懸濁液の場所 3 つの 5 μ L 滴蓋し解剖顕微鏡を用いた μ L 当たりワームの数を推定します。
6. 汝の連鎖球菌シードそれぞれ、NGM大腸菌シード プレート 100 ~ L4 幼虫を追加します。細菌の株あたり 3枚のプレートを使用します。25 ° C で 2 に 3 h の版を孵化させなさい
7. その後、インキュベーターからプレートを削除、M9W で洗って、15 mL の円錐管にワームを収集します。
8. ワーム 3 を洗って x に従って手順 9.3。
9. 吸引により、M9W の大部分を除去し、M9W 含む 2 mM ナトリウム アジ化または 2 mM tetramisole 塩酸塩を 500 μ l 添加をワームのペレットに追加します。これはワーム、顕微鏡下でイメージを作成するとき、移動は行われませんを確保を麻酔が。
   注意:アジ化ナトリウムを処理するときは、個人保護用具 (PPE) を使用します。化学のフードの下でアジ化ソリューションを準備します。
10. 15 分間常温ワーム餌を孵化させなさい。その後、準備されたアガロース パッドにワーム懸濁液の 15 μ L スポット。号 1.5 coverslip を麻酔下のワームを含む agarose パッドにそっとかぶせます。
11. 蛍光顕微鏡を用いた、SKN 1 利用フィルター FITC と DAPI のローカリゼーションを視覚化します。10 x、20 x の倍率でワームをイメージ。
12. SKN 1 の局在化のレベルに基づくワームをスコアします。核局在化、SKN-1 b/C::GFP 前部または後部のワームでのローカリゼーション、SKN-1 b/C::GFP すべての腸細胞の核局在化として分類されるない低、中、高レベルのローカリゼーションのそれぞれ。
13. 蛍光顕微鏡を得点した後 chi - 乗と統計解析ソフトウェアを使用したフィッシャーの正確なテストの統計的な差異を決定します。

結果

可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤、 s. 口腔単純性疱疹とs. gordonii急速に死亡とは対照的に, S. mutans、 s. レンサと非病原性大腸菌のワームは、OP50 (図 3A)。剤、 s. 口腔単純性疱疹、 S. gordoniiの生存期間の中央値は 300 分、300 分、345 分であった。殺害された H₂O₂

ディスカッション

腸球菌 faecium、また嫌気性下で栽培した H₂O₂を作り出すなど他の病原細菌の説明する方法を使用できるまたは微好気条件²⁶。通常、最も病原性生物の週間生存の試金を完了するにいくつかの日が必要。ただし、H₂O₂可鍛鋳鉄グループのメンバーによって堅牢な生産のためこれらの試金は記載されている条件の下で 5-6 時間以内完了でした?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
Bacto peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated	Fisher Scientific	B11947
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood)	Fisher Scientific	R01200
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP26481
Catalase	Sigma Aldrich	C1345-1G
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
Tetracyclin	Sigma Aldrich	87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride	Sigma Aldrich	L9756
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Consumables
15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL	Fisher Scientific	07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-100A
No. 1.5  18 mm x 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
N2	C. elegans wild isolate		CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell