Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo

Resumen

Aquí, presentamos un método para registrar contracciones musculares embrionarias en embriones de Drosophila de una manera no invasiva y orientada a los detalles.

Resumen

Las contracciones musculares coordinadas son una forma de comportamiento rítmico que se ve temprano durante el desarrollo en embriones de Drosophila. Se requieren circuitos neuronales de retroalimentación sensorial para controlar este comportamiento. No producir el patrón rítmico de las contracciones puede ser indicativo de anomalías neurológicas. Anteriormente encontramos que los defectos en la proteína O-mannosilación, una modificación de la proteína posttranslacional, afectan la morfología del axón de las neuronas sensoriales y dan lugar a contracciones musculares coordinadas anormales en embriones. Aquí, presentamos un método relativamente simple para registrar y analizar el patrón de contracciones musculares peristálticas mediante imágenes en vivo de embriones en etapa tardía hasta el punto de eclosión, que utilizamos para caracterizar el fenotipo de contracción muscular de la proteína Mutantes o-mannosyltransferasa. Los datos obtenidos de estas grabaciones se pueden utilizar para analizar las ondas de contracción muscular, incluyendo la frecuencia, dirección de propagación y amplitud relativa de las contracciones musculares en diferentes segmentos del cuerpo. También hemos examinado la postura corporal y aprovechado un marcador fluorescente expresado específicamente en los músculos para determinar con precisión la posición de la línea media del embrión. Un enfoque similar también se puede utilizar para estudiar varios otros comportamientos durante el desarrollo, como laminación de embriones y la eclosión.

Introducción

La contracción muscular peristáltica es un comportamiento motor rítmico similar a caminar y nadar en humanos^1,2,3. Las contracciones musculares embrionarias que se ven en los embriones de etapa tardía de Drosophila representan un ejemplo de tal comportamiento. La drosofilia es un excelente organismo modelo para estudiar varios procesos de desarrollo porque el desarrollo embrionario en Drosophila está bien caracterizado, relativamente corto y fácil de monitorear. El objetivo general de nuestro método es registrar y analizar cuidadosamente el patrón ondulación de contracción y relajación de los músculos embrionarios. Utilizamos un enfoque simple y no invasivo que ofrece una visualización detallada, registro y análisis de las contracciones musculares. Este método también se puede utilizar potencialmente para estudiar otros procesos in vivo, como la rodadura embrionaria que se ve en embriones de etapa tardía justo antes de la eclosión. En estudios anteriores, las contracciones musculares embrionariasse analizaron principalmente en términos de frecuencia y dirección 1,². Con el fin de estimar el alcance relativo de las contracciones a medida que avanzan a lo largo del eje del cuerpo en la dirección anterior o posterior, hemos utilizado embriones que expresan GFP específicamente en los músculos. Este análisis proporciona una forma más cuantitativa de analizar las contracciones musculares y revelar cómo se mantiene la postura corporal en embriones durante una serie de ondas peristálticas de contracciones musculares.

Las contracciones musculares peristálticas son controladas por circuitos de generador de patrones centrales (CPG) y comunicaciones entre las neuronas del sistema nervioso periférico (PNS), el sistema nervioso central (SNC) y los músculos^4,5. No producir contracciones musculares peristálticas normales puede conducir a defectos tales como falla en la eclosión² y locomoción larval anormal⁶ y puede ser indicativo de anomalías neurológicas. Las imágenes en vivo de ondas peristálticas de contracción muscular y análisis detallados de fenotipos de contracción pueden ayudar a descubrir mecanismos patógenos asociados con defectos genéticos que afectan a los músculos y circuitos neuronales involucrados en la locomoción. Recientemente usamos ese enfoque para investigar mecanismos que resultan en un fenotipo de torsión de postura corporal de protein O-mannosyltransferase (POMT) mutantes⁷.

La proteína O-mannosilación (POM) es un tipo especial de modificación posttranslacional, donde se añade un azúcar de manona a los residuos de serina o trionina de las proteínas secretas de la vía^8,9. Los defectos genéticos en el POM causan distrofias musculares congénitas (CMD) en humanos^10,11,12. Investigamos los mecanismos causales de estas enfermedades utilizando Drosophila como sistema modelo. Encontramos que los embriones con mutaciones en los genes de la proteína Drosophila O-mannosiltransferasa POMT1 y POMT2 (también k.a. abdomen rotado (rt) y retorcidos (tw)) muestran un desplazamiento ("rotación") de los segmentos corporales, lo que resulta en una postura corporal anormal⁷. Curiosamente, este defecto coincidió con la etapa de desarrollo cuando las contracciones musculares peristálticas se vuelven prominentes⁷.

Dado que la postura corporal anormal en embriones mutantes POM surge cuando la musculatura y la epidermis ya están formadas y las ondas peristálticas de contracciones musculares coordinadas han comenzado, hipotetizado que la postura corporal anormal podría ser el resultado de un músculo anormal contracciones en lugar de un defecto en el músculo o /y epidermis morfología⁷. Las CMD pueden estar asociadas con contracciones musculares anormales y defectos de postura^13,y por lo tanto el análisis del fenotipo de postura en mutantes Drosophila POMT puede aclarar los mecanismos patológicos asociados con distrofias musculares . Con el fin de investigar la relación entre el fenotipo de la postura corporal de los mutantes Drosophila POMT y las posibles anomalías en las ondas peristálticas de las contracciones musculares, decidimos analizar las contracciones musculares en detalle utilizando un enfoque de imágenes.

Nuestro análisis de ondas de contracción peristáltica en embriones droofílicos reveló dos modos de contracción distintos, designados como ondas de tipo 1 y tipo 2. Las ondas de tipo 1 son ondas simples que se propagan de anterior a posterior o viceversa. Las ondas de tipo 2 son ondas bifásicas que se inician en el extremo anterior, se propagan a mitad de camino en la dirección posterior, se detienen momentáneamente, forman una contracción estática temporal, y luego, durante la segunda fase, son barridas por una contracción peristáltica que se propaga hacia adelante desde el extremo posterior. Los embriones de tipo salvaje normalmente generan una serie de contracciones que consiste en aproximadamente 75% tipo 1 y 25% ondas tipo 2. Por el contrario, los embriones mutantes POMT generan ondas de tipo 1 y tipo 2 a frecuencias relativas aproximadamente iguales.

Nuestro enfoque puede proporcionar información detallada para el análisis cuantitativo de las contracciones musculares y la rodadura de embriones⁷. Este enfoque también podría adaptarse para analizar otros comportamientos relacionados con las contracciones musculares, como el eclosión y el rastreo.

Protocolo

1. Preparación

1. Prepare una jaula de mosca haciendo aproximadamente 50 agujeros en un vaso de precipitados de plástico triesquina de 100 ml de capacidad utilizando una aguja caliente de 25 G (ver Tabla de materiales).
2. Preparar platos Petri de 60 mm x 15 mm con jugo de manzana-agar (3% agar y 30% jugo de manzana).
3. Preparar la pasta de levadura fresca mezclando gránulos de levadura seca y agua. Esparce la pasta de levadura sobre las placas de agar de manzana para aumentar la puesta de huevos.
4. Anestesiar alrededor de 50-60 moscas (utilizar aproximadamente el mismo número de machos y hembras) en CO₂ y ponerlos en la jaula de moscas.
   NOTA: El uso de una mayor proporción de hembras (hasta 2:1 de proporción de hembras:machos) puede ayudar a aumentar la cantidad de óvulos puestos para algunos genotipos.
5. Coloque un plato Petri de agar de jugo de manzana con pasta de levadura en la jaula de moscas firmemente y sellarlo con arcilla de modelado. Asegúrese de que esté sellado en todas las esquinas.
6. Espere hasta que las moscas despierten de la anestesia y luego invierta la jaula de tal forma que el plato Petri esté ahora en la parte inferior. Poner la jaula en una incubadora con temperatura controlada (25oC) y humedad (60%).
7. Deje que las moscas pongan huevos durante 2-3 h, reemplace el plato de manzana por uno fresco y deje que el plato con huevos envejezca durante 19-20 h en una incubadora.
   NOTA: Antes del paso anterior, las moscas deben sincronizarse para facilitar la recolección de embriones de etapa 17e-f (19-21 h AEL). Esto se puede lograr transfiriendo moscas a una jaula con una placa de agar de jugo de levadura fresca 3-4 veces durante 12 h (una vez cada 3-4 h). Mantener las moscas en un entorno de luz circadiana controlado (ciclo LD) también puede ayudar con la recolección de una población sincronizada de embriones, pero esto no fue esencial en nuestros experimentos.

2. Colección de embriones

1. Escoja cuidadosamente los embriones con un pincel húmedo y colóquelos en un plato de vidrio de recolección lleno de 1 PBS.
2. Seleccione los embriones que tienen sus tráqueas llenas de aire. Las tráqueas llenas de aire indican que los embriones han alcanzado la fase 17, y sus contracciones musculares peristálticas deberían haber comenzado. Las tráqueas se vuelven claramente visibles cuando se llenan de aire, que puede servir como un marcador para la etapa 17.
3. Coloque una losa de agar jugo de manzana en un portaobjetos de vidrio y transfiera cuidadosamente los embriones de PBS a la losa. Alinee los embriones con su lado ventral.
   NOTA: Los lados dorsales y ventrales de los embriones se pueden distinguir por la posición de los apéndices dorsales en la cáscara de huevo.
4. Haga un límite rectangular de cera en otra diapositiva de vidrio con una pluma de cera (consulte Tabla de materiales).
5. Coloque una cinta adhesiva de doble cara dentro de ese límite y recoja suavemente los embriones bajando esta diapositiva sobre la losa de agar. Aplique una presión suave para asegurarse de que los embriones se peguen bien a la cinta, con su lado dorsal hacia arriba. Si es necesario, los embriones se pueden enrollar en la cinta para corregir su orientación. Realice todas las manipulaciones mientras monitorea los embriones bajo un microscopio de disección.
6. Cubrir embriones con 1x PBS para imágenes en vivo de contracciones musculares.
   NOTA: Algunos procedimientos descritos anteriormente están relacionados con técnicas básicas de Drosophila utilizadas en muchos estudios. Descripciones más detalladas de las técnicas comunes de Drosophila se pueden encontrar en otros lugares¹⁴.

3. Grabación de embriones

1. Realice imágenes en vivo de embriones montados en un microscopio de epiflourescencia con función de lapso de tiempo y una cámara digital con filtros de emisión adecuados (ver Tabla de Materiales)utilizando una lente objetivo de inmersión en agua 10x.
   NOTA: Aquí usamos embriones que expresaban GFP en los músculos. También se pueden utilizar otros marcadores fluorescentes con conjuntos adecuados de filtros de luz de excitación y emisión (por ejemplo, para la detección de tdTomato, se puede utilizar un conjunto de filtros Chroma ET-561 para excitación y emisión alrededor de 554 nm y 581 nm óptimos, respectivamente).
2. Realizar grabación de vídeo en directo de embriones utilizando un software adecuado (ver Tabla de Materiales)durante aproximadamente 1-2 h con una tasa de adquisición de 4 fotogramas/s.
   NOTA: Para analizar la minación del embrión en desarrollo dentro de su caparazón, se pueden utilizar embriones sin expresión de marcadores fluorescentes. Con este fin, se aplica la iluminación de luz transmitida regular sin filtros espectrales para visualizar el movimiento del embrión dentro de la cáscara (ver Película 2).

4. Análisis de las Grabaciones

1. Exporte el vídeo grabado directamente a la imagen J para análisis posteriores (por ejemplo, como archivos AVI).
2. En ImageJ, recorte las grabaciones de vídeo al tamaño de embriones individuales dibujando una caja alrededor de cada embrión y, a continuación, haciendo clic en Imagen > Recortar. Esto reduce en gran medida el tamaño de los archivos de vídeo sin afectar a su resolución y facilita su análisis.
3. Gire las imágenes recortadas para lograr la posición vertical de la línea media del embrión en relación con la pantalla, haciendo clic en Imagen > Transformar > Rotar.
   NOTA: Si selecciona Vista previa durante este proceso, se proporcionarán instrucciones para la rotación, mostrando las líneas de cuadrícula para garantizar la posición vertical de la línea media.
4. Análisis cuantitativo de la rodadura embrionaria :
   NOTA: Para los análisis de distancia, confirme primero que las imágenes incluyen información de escala. La escala de imagen se puede agregar seleccionando Analizar > Definir escalay, a continuación, introduciendo una conversión de píxeles a distancias, por ejemplo, micrómetros
   1. Marque la posición de una o ambas tráqueas en el primer fotograma del vídeo en un punto a medio camino entre los extremos posterior y anterior. Haga clic en Analizar > Herramientas > Gestor de ROI y registre esta posición como coordenada-y de la rebanada mediante el dibujo de un cuadro de aproximadamente 7 m por 7 m a su alrededor y escribiendo t en el teclado. Asegúrese de que al escribir t, se selecciona una región de interés en el vídeo. Como alternativa, seleccione la pestaña Agregar (t) en el administrador de ROI para registrar la posición de la tráquea en lugar de escribir el comando.
      NOTA: La región de interés puede variar en forma o tamaño dependiendo de la región embrionaria o evento de desarrollo que se está estudiando.
   2. Marque la posición de la misma zona de la tráquea después de cada contracción peristáltica. Mida la distancia desde la posición de la contracción hasta la posición posterior a la contracción dibujando una línea que conecte los centros de cada cuadro y escribiendo m en el teclado. Convierta la distancia a m utilizando una escala conocida de imágenes. Alternativamente, mida la distancia en un solo paso haciendo clic en Analizar > Establecer escala e introduzca el factor de conversión de píxel a micra conocido para producir un informe en micrones.
      NOTA: Se puede introducir una distancia en píxeles junto con su distancia correspondiente en el número de píxeles.
   3. Correlacionar la distancia y la dirección de cada evento rodante con la dirección de propagación de la contracción muscular en al menos 8 embriones para diferencias estadísticamente significativas.
5. Análisis cuantitativo de contracciones musculares embrionarias:
   1. Utilice embriones que expresen marcadores fluorescentes en los músculos (por ejemplo, utilizamos moscas transgénicas que expresan una construcción de fusión de Myosin Heavy Chain promotor y GFP llamado MHC-GFP 5 ) para analizar los parámetros de contracción muscular como como los parámetros de contracción muscular como, como mHC-GFP⁵) para analizar los parámetros de contracción muscular como, como los parámetros de contracción muscular, como mústico amplitud de contracción.
   2. Utilice la grabación de la lectura fluorescente y dibuje una región de interés (por ejemplo, una caja de 15 m a 45 m [HXW]) centrada en los músculos (que son claramente visibles debido a la presencia de un marcador fluorescente) de un segmento corporal en particular, y seleccione la pestaña Agregar (t) en el capítulo e gestor de ROI para registrar la posición del ROI. Haga clic en Gestor de ROI > Medir para registrar la intensidad fluorescente media de cada región de interés seleccionada para cada fotograma del vídeo.
   3. Mueva la casilla a los centros de otros segmentos del cuerpo de interés y haga clic en Agregar (t) en el gestor de ROI para registrar sus posiciones. Esto dará regiones de interés de tamaño idéntico en todos los segmentos del cuerpo a analizar. Seleccione al menos un segmento posterior, un medial y uno anterior, por ejemplo, A7, A4 y T2, respectivamente.
   4. En el gestor de ROI, seleccione todas las regiones de interés registradas como coordenada sin formato-y coordenadas x (por ejemplo, seleccionando mientras mantiene presionada la tecla Ctrl) y haga clic en Más > Medida múltiple para medir la media fluorescente intensidad de cada región de interés para todos los fotogramas del vídeo, e informar cada medida en una tabla. Cada región de interés es una columna de la tabla y cada fotograma es una fila. Transfiera la tabla a un programa de hoja de cálculo para análisis posteriores.
   5. Trazar un gráfico con el número de fotograma en el eje X y la intensidad fluorescente media en el eje Y. El número de fotograma se puede convertir en tiempo utilizando la velocidad de fotogramas (4 fotogramas/s) del vídeo (Figura1A).
   6. Determinar la amplitud de la contracción muscular estimando el aumento de la intensidad de fluorescencia de GFP en relación con el valor basal. Las contracciones musculares aumentan la intensidad de la GFP a medida que aportan más GFP a las proximidades del área focal a medida que se tiran más músculos durante estas contracciones (Película 1)⁷. Establecer una fluorescencia basal como la intensidad media entre las ondas de contracción. Normalice la intensidad de GFP hasta la línea de base dividiendo cada valor de intensidad de ROI por la intensidad de la línea base.
      NOTA: Cada perfil tiene una fluorescencia basal diferente, ya que puede haber diferentes niveles de expresión en diferentes segmentos musculares.
      NOTA: Una posible complicación es que la fluorescencia gFP puede cambiar con el tiempo debido al blanqueamiento fotográfico. Esto se puede resolver mediante el monitoreo de los cambios en la línea de base de fluorescencia y el uso de un tamaño de muestra suficiente para los análisis de ondas (normalmente usamos conjuntos de 10 ondas fluorescentes y confirmamos que la línea de base es aproximadamente constante tomando un promedio de sólo esos picos mínimos como línea de base que han disminuido en fluorescencia en un 10% o menos en relación con el pico mínimo inicial). También se puede aplicar una iluminación de pulso-LED para mitigar ese problema¹⁶.
   7. Compare las contracciones musculares en los lados izquierdo y derecho del embrión mediante el análisis de las intensidades máximas en ambos lados del embrión para los mismos segmentos. Utilice la amplitud de contracción y el tiempo de intensidades máximas para examinar las diferencias en cuanto a extensión y temporización de las ondas de contracción muscular peristáltica que se propagan a ambos lados del embrión.
   8. Compare la intensidad normalizada de la GFP en diferentes segmentos (por ejemplo, en regiones anteriores, mediales y posteriores) durante la propagación de la onda de contracción muscular para examinar los cambios en la contracción a medida que se propaga la onda. Este análisis también determina la dirección de la onda (es decir, si se propaga hacia regiones anteriores o posteriores del embrión).

Resultados

Las contracciones musculares peristálticas normales se muestran en un embrión WT (tipo salvaje, Canton-S) en la película 1. La frecuencia media de las ondas peristálticas de las contracciones musculares en nuestro análisis fue de 47 contracciones por hora y la amplitud media fue 60% por encima de la línea de base para los embriones WT. El balanceo de embriones se muestra para un embrión WT en la película 2, con la flecha blanca que marca la posición inicial de una trá...

Discusión

Nuestro método proporciona una manera cuantitativa de analizar comportamientos importantes de embriones durante el desarrollo, como ondas de contracción muscular peristáltica, incluyendo periodicidad de onda, amplitud y patrón, así como el efecto de onda sobre la rotación y la postura de embriones. Esto puede ser útil en análisis de diferentes mutantes para estudiar el papel de genes específicos en la regulación de estos y otros comportamientos durante el desarrollo embrionario. Hemos utilizado cambios en la in...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL