초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

요약

여기에서, 우리는 비침습적이고 세부지향적인 방식으로 Drosophila 배아에서 배아 근육 수축을 기록하는 방법을 제시한다.

초록

조정된 근육 수축은 Drosophila 태아에 있는 발달 도중 일찌기 보인 리듬 행동의 한 형태입니다. 이 동작을 제어하려면 신경 감각 피드백 회로가 필요합니다. 수축의 리듬 패턴을 생성하지 못하면 신경 학적 이상을 나타낼 수 있습니다. 우리는 이전에 단백질 O-mannosylation에 있는 결점을, 번역 후 단백질 수정, 감각 신경의 축삭 형태에 영향을 미치고 태아에 있는 이상한 조정한 근육 수축 귀착된다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에서, 우리는 단백질의 근육 수축 표현형을 특성화하기 위하여 이용된 부화의 점까지 말기 태아의 살아있는 화상 진찰에 의하여 연동 근육 수축의 패턴을 기록하고 분석하기 위한 상대적으로 간단한 방법을 제시합니다 O-만노실 트랜스퍼라제 돌연변이체. 이 기록에서 얻은 데이터는 주파수, 전파 방향 및 다른 신체 세그먼트에서 근육 수축의 상대적 진폭을 포함하여 근육 수축 파를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 바디 자세를 검토하고 정확하게 태아 중간선의 위치를 결정하기 위하여 근육에서 구체적으로 표현된 형광 마커의 이용을 취했습니다. 유사한 접근은 또한 배아 압연 및 부화와 같은 발달 도중 각종 그밖 행동을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서문

연동 근육 수축은 인간 1,^2,3에서걷기와 수영과 유사한 리듬 운동 동작입니다. Drosophila 후기 단계 배아에서 보인 배아 근육 수축은 그러한 행동의 예를 나타낸다. 초파리는 다양한 발달 과정을 연구하는 우수한 모델 유기체로, 초파리에서배아발달이 잘 특성화되어 있고, 상대적으로 짧고, 모니터링하기 쉽다. 우리의 방법의 전반적인 목표는 신중하게 기록하고 배아 근육의 수축과 이완의 물결 모양의 패턴을 분석하는 것입니다. 우리는 근육 수축의 상세한 시각화, 기록 및 분석을 제공하는 간단한 비침습적 접근법을 사용했습니다. 이 방법은 또한 잠재적으로 부화 직전에 말기 배아에서 보인 배아 압연과 같은 생체 내 다른 과정을 연구하는 데 사용될 수 있다. 이전 연구에서, 배아 근육 수축은 주로 주파수 및방향 의 관점에서 분석되었다 1,^2. 전방 또는 후방 방향으로 신체 축을 따라 진행하면서 수축의 상대적 정도를 추정하기 위해, 우리는 근육에서 GFP를 구체적으로 발현하는 배아를 사용했습니다. 이 분석은 근육 수축을 분석하고 근육 수축의 연동 파의 일련의 동안 배아의 신체 자세가 어떻게 유지되는지를 밝히는 보다 정량적인 방법을 제공합니다.

연동 근육 수축은 중앙 패턴 발생기 (CPG) 회로 및 말초 신경계 (PNS), 중추 신경계 (CNS) 및 근육^4,5의뉴런 간의 통신에 의해 제어됩니다. 정상적인 연동 근육 수축을 생성하지 못하면 부화 실패² 및 비정상적인 애벌레 운동 6과 같은 결함이 발생할 수 있으며 신경 학적 이상을 나타낼 수 있습니다. 근육 수축의 연동 파의 살아있는 화상 진찰 및 수축 표현형의 상세한 분석은 운동에 관련되었던 근육 및 신경 회로에 영향을 미치는 유전 적 결함과 관련되었던 병원성 기계장치를 밝히는 것을 도울 수 있습니다. 우리는 최근에 p로테인 O-m annosyltransferase (POMT) 돌연변이체의 신체 자세비틀림 표현형을 초래하는 메커니즘을 조사하기 위해 이러한 접근법을 사용했다.

단백질 O-만노실화(POM)는 분비 통로 단백질의 세린 또는 쓰레오닌 잔류물8,^9에만노스 슈가를 첨가하는 특별한 유형의 번역 후 변형이다. POM에 있는 유전 적 결함은 인간에 있는 선천성 근육 dys트로피 (CMD)를 일으키는 원인이 됩니다^10,11,12. 우리는 모형 시스템으로 Drosophila를 사용하여 이 질병의 원인 기계장치를 조사했습니다. 우리는 Drosophila 단백질 O-mannosyltransferase 유전자 POMT1 및 POMT2 (일명 회전 복부 (rt)와 꼬인 (tw)에 있는 돌연변이를 가진 배아가 보여준다는 것을 것을을 발견했습니다 신체 세그먼트의 변위("회전")로 인해 비정상적인 신체^자세가7. 흥미롭게도, 이 결함은 연동 근육 수축이 눈에 띄는 될 때 개발 단계와 일치⁷.

POM 돌연변이 배아의 비정상적인 신체 자세는 근육과 표피가 이미 형성되고 조정된 근육 수축의 연동파가 시작될 때 발생하기 때문에 비정상적인 신체 자세가 비정상적인 근육의 결과일 수 있다고 가정했습니다. 근육 또는 표피 형태에 결함이 아닌 수축⁷. CMDs는 이상한 근육 수축 및 자세 결점^13와연관될 수 있고, 따라서 Drosophila POMT 돌연변이체에 있는 자세 표현형의 분석은 근이영양증과 관련되었던 병리학적인 기계장치를 해명할 수 있습니다 . Drosophila POMT 돌연변이체의 신체 자세 표현형과 근육 수축의 연동 파에서 가능한 이상 사이의 관계를 조사하기 위해, 우리는 살아있는 을 사용하여 근육 수축을 자세히 분석하기로 결정했습니다. 이미징 접근 방식.

Drosophila 태아에 있는 연동 수축 파의 우리의 분석은 타입-1과 타입-2 파파로 지정된 2개의 명백한 수축 모드를, 밝혔습니다. 타입 1 파도는 전방에서 후방으로 전파되는 단순한 파도이거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 유형 2 파도는 전방 끝에서 시작, 후방 방향으로 중간 전파, 순간적으로 정지, 시간 정적 수축을 형성하고, 두 번째 단계 동안, 전파 연동 수축에 의해 휩쓸된다 이파성 파도입니다 뒤쪽 끝에서 앞으로. 야생 형 배아는 일반적으로 대략 75% 타입-1 및 25% 타입 2 파파로 이루어져 있는 수축의 시리즈를 생성합니다. 대조적으로, POMT 돌연변이 배아는 대략 동등한 상대 주파수에서 타입-1 및 타입-2 파형을 생성합니다.

우리의 접근은 근육 수축 및 배아 압연7의 정량분석을 위한 상세한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 접근은 또한 해치와 크롤링과 같은 근육 수축을 관련시키는 그밖 행동의 분석을 위해 적응될 수 있었습니다.

프로토콜

1. 준비

1. 뜨거운 25G 바늘을 사용하여 100 mL 용량 트라이 코너 플라스틱 비커에 약 50 개의 구멍을 만들어 플라이 케이지를 준비하십시오 (재료 표참조).
2. 사과 주스 한천 (3 % 한천 과 30 % 사과 주스)으로 60mm x 15mm 페트리 요리를 준비하십시오.
3. 마른 효모 과립과 물을 혼합하여 신선한 효모 페이스트를 준비합니다. 효모 페이스트를 사과 한천 접시에 펴서 알 을 낳는다.
4. CO 2에 약 50-60 개의 파리 (남성과 여성의 대략 동등한 수를 사용)를 마취하고 비행 케이지에 넣습니다.
   참고: 여성의 증가 비율을 사용 하 여 (최대 ~2:1 비율의 여성:남성) 일부 유전자형에 대 한 누워 계란의 양을 증가 도움이 될 수 있습니다.
5. 효모 페이스트와 함께 사과 주스 한천 페트리 접시를 플라이 케이지에 단단히 붙이고 모델링 점토로 밀봉하십시오. 모든 모서리에 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
6. 파리가 마취에서 깨어날 때까지 기다린 다음 페트리 접시가 바닥에 있게 되도록 케이지를 반전시다. 제어 온도 (25 °C)와 습도 (60 %)와 인큐베이터에 케이지를 넣어.
7. 파리가 2-3 시간 동안 알을 낳고, 사과 접시를 신선한 것으로 교체하고, 인큐베이터에서 19-20 시간 동안 계란 나이를 가진 접시를 보자.
   참고: 상기 단계 이전에, 파리는 단계 17e-f (19-21 h AEL) 배아의 수집을 용이하게하기 위해 동기화되어야합니다. 이것은 신선한 효모 사과 주스 - 한천 접시를 12 시간 동안 3-4 회 (3-4 시간마다 한 번) 케이지로 옮기면 달성 할 수 있습니다. 통제된 circadian 빛 환경에서 파리를 지키는 (LD 주기) 또한 배아의 동기화된 인구를 모으는 것을 도울 수 있습니다, 그러나 이것은 우리의 실험에서 필수적이지 않았습니다.

2. 배아 수집

1. 조심스럽게 젖은 페인트 브러시로 배아를 선택하고 1 x PBS로 채워진 수집 유리 접시에 놓습니다.
2. 기관지의 공기가 채워진 배아를 선택합니다. 공기 채워진 기관은 태아가 단계 17에 도달했다는 것을 표시하고, 그들의 연동 근육 수축은 시작했어야 합니다. 기관지가 공기로 가득 차면 선명하게 볼 수 있으며, 이는 스테이지 17의 표식역할을 할 수 있습니다.
3. 유리 슬라이드에 사과 주스 한천 슬래브를 놓고 PBS에서 슬래브로 조심스럽게 배아를 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 놓습니다. 배아를 복부 쪽으로 정렬합니다.
   참고: 배아의 등쪽과 복부 측면은 달걀 껍질에 등쪽 부속기의 위치에 의해 구별 될 수있다.
4. 왁스 펜을 사용하여 다른 유리 슬라이드에서 직사각형 왁스 경계를 만듭니다(재료 표참조).
5. 그 경계 내에 양면 끈적끈적한 테이프를 놓고 이 슬라이드를 한천 슬래브 위로 낮추어 배아를 부드럽게 집어 들입니다. 배아가 등쪽을 위로 올려 테이프에 잘 달라붙도록 부드러운 압력을 가하십시오. 필요한 경우 배아를 테이프에 압연하여 방향을 수정할 수 있습니다. 해부 현미경으로 배아를 모니터링하는 동안 모든 조작을 수행하십시오.
6. 근육 수축의 살아있는 화상 진찰을 위한 1x PBS로 배아를 커버하십시오.
   참고: 위에서 설명한 몇몇 절차는 많은 연구 결과에서 이용된 기본적인 Drosophila 기술과 관련있습니다. 일반적인 초파리 기술에 대한 자세한 설명은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다¹⁴.

3. 배아 기록

1. 타임랩스 기능을 갖춘 진피 현미경과 10배 침수 조준 렌즈를 사용하여 적절한 방출 필터가 있는 디지털 카메라(재료 표참조)에 장착된 배아의 실시간 이미징을 수행합니다.
   참고: 여기에서 우리는 근육에 GFP를 표현하는 배아를 사용했습니다. 적절한 여기 광 및 방출 필터 세트를 가진 다른 형광 마커도 사용할 수 있습니다 (예를 들어, tdTomato 검출을 위해, 하나는 최적의 554 nm 및 581 nm 주위 의 여기 및 방출을 위한 Chroma ET-561 필터 세트를 각각 사용할 수 있습니다).
2. 4 프레임 / s의 수집 속도와 약 1-2 시간 동안 적합한 소프트웨어 (재료 표참조)를 사용하여 배아의 라이브 비디오 녹화를 수행합니다.
   참고: 그것의 껍질 내의 발전 태아의 압연을 분석하기 위하여는형광 마커의 발현 없이 태아를 사용할 수 있습니다. 이를 위해, 스펙트럼 필터없이 정기적으로 전송된 광 조명은 쉘 내의 배아 모션을 시각화하기 위해 적용된다(동영상 2참조).

4. 녹음 분석

1. 추가 분석을 위해 녹화된 비디오를 이미지 J로 직접 내보내(예: AVI 파일).
2. ImageJ에서 각 배아 주위에 상자를 그린 다음 이미지 > 자르기를클릭하여 개별 배아의 크기로 비디오 녹화를 자르십시오. 이렇게 하면 해상도에 영향을 주지 않고 비디오 파일의 크기가 크게 줄어들고 분석이 용이합니다.
3. 이미지 > 변환 > 회전을클릭하여 화면 과 관련된 배아 중간선의 수직 위치를 달성하기 위해 자른 이미지를 회전합니다.
   참고: 이 과정에서 미리 보기를 선택하면 회전에 대한 지침이 제공되어 중간선의 수직 위치를 보장하기 위해 격자선을 표시합니다.
4. 배아 압연의 정량적 분석 :
   참고: 거리 분석의 경우 먼저 이미지에 배율 정보가 포함되어 있는지 확인합니다. 이미지 배율은 분석 및 조정을선택한 다음 픽셀을 거리(예: 마이크로미터)로 변환하여 추가할 수 있습니다.
   1. 후방과 전방 끝 사이의 중간 지점에서 비디오의 첫 번째 프레임에 하나 또는 둘 다의 기관의 위치를 표시합니다. 분석 > 도구 > ROI 관리자를 클릭하고 약 7 μm x 7 μm의 상자를 그려 키보드에 t를 입력하여 슬라이스 번호 y 좌표x 좌표로이 위치를 기록합니다. t를 입력할 때 비디오에서 관심 영역이 선택되어 있는지 확인합니다. 또는 ROI 관리자에서 (t) 추가 탭을 선택하여 명령을 입력하는 대신 기관 위치를 기록합니다.
      참고: 관심 영역은 연구중인 배아 영역 또는 발달 이벤트에 따라 모양 또는 크기가 다를 수 있습니다.
   2. 각 연동 수축 후 기관의 동일한 영역의 위치를 표시합니다. 각 상자의 중심을 연결하는 선을 그리고 키보드에 m을 입력하여 사전 수축 위치에서 수축 후 위치까지의 거리를 측정합니다. 알려진 이미지 축척을 사용하여 거리를 μm으로 변환합니다. 또는 분석 > 스케일 설정(Scale)을 클릭하여 단일 단계에서 μm의 거리를 측정하고 알려진 픽셀 대 미크론 변환 계수를 입력하여 미크론으로 보고서를 산출합니다.
      참고: 픽셀 거리는 μm의 해당 거리와 함께 입력할 수 있습니다.
   3. 통계적으로 유의한 차이를 위해 적어도 8개의 배아에서 근육 수축 전파의 방향과 각 압연 이벤트의 거리 및 방향을 상관시다.
5. 배아 근육 수축의 정량분석:
   1. 근육에서 형광 마커를 발현하는 배아를 사용 (예를 들어, 우리는 MHC-GFP5라고 불리는 M요신 Heavy C하인 프로모터및 GFP의 융합 구조를 발현하는 형질전환 파리를 사용하여) 근육 수축 파라미터를 분석하는 것 수축 진폭.
   2. 형광 판독 의 기록을 사용하고 특정 신체 세그먼트의 근육 (형광 마커의 존재로 인해 명확하게 볼 수있는) 중심의 근육 (예를 들어, 15 μm ~ 45 μm [HXW]의 상자)의 관심 영역을 그릴, 그리고 다음에 추가 (t) 탭을 선택 E ROI 관리자를 통해 ROI의 위치를 기록할 수 있습니다. ROI 관리자 > 측정을 클릭하여 비디오의 각 프레임에 대해 선택한 각 관심 영역의 평균 형광 강도를 기록합니다.
   3. 상자를 관심 있는 다른 신체 세그먼트의 중심으로 이동하고 ROI 관리자에서 추가(t)를 클릭하여 해당 위치를 기록합니다. 이렇게 하면 모든 바디 세그먼트에서 동일한 크기의 관심 영역을 분석할 수 있습니다. 하나 이상의 후방, 하나의 내측 및 하나의 전방 세그먼트(예: A7, A4 및 T2)를 각각 선택합니다.
   4. ROI 관리자에서 슬라이스 번호-y 좌표-x 좌표로 기록된 모든 관심 지역을 선택하고(예: Ctrl을들고 있는 동안 선택) 더 > 다중 측정을 클릭하여 평균 형광을 측정합니다. 비디오의 모든 프레임에 대한 관심 있는 각 영역의 강도를 보고하고 테이블의 각 측정값을 보고합니다. 관심 있는 각 영역은 테이블의 열이며 각 프레임은 행입니다. 추가 분석을 위해 테이블을 스프레드시트 프로그램으로 전송합니다.
   5. x축에 프레임 번호와 y축의 평균 형광 강도가 있는 그래프를 플로팅합니다. 프레임 번호는 비디오의 프레임 속도(4 프레임/s)를 사용하여 시간으로 변환할 수 있습니다(도1A).
   6. 기준선에 상대적인 GFP 형광 강도의 증가를 추정하여 근육 수축 진폭을 결정합니다. 근육 수축 증가 GFP 강도 증가 그들은 더 많은 근육이 수축 하는 동안 당겨 얻을 으로초점 영역의 부근에 더 많은 GFP를 가지고 (영화 1)^7. 수축 파사이의 평균 강도로서 기준선 형광을 설정합니다. 모든 ROI 강도 값을 기준선 강도로 나누어 GFP 강도를 기준선으로 정규화합니다.
      참고: 각 프로필은 상이한 근육 세그먼트에 상이한 발현 수준이 있을 수 있기 때문에 상이한 기준선 형광을 가지고 있다.
      참고: 한 가지 잠재적인 합병증은 GFP 형광이 사진 표백으로 인해 시간이 지남에 따라 변할 수 있다는 것입니다. 이는 형광 기준의 변화를 모니터링하고 파도 분석을 위한 충분한 샘플 크기를 사용하여 해결할 수 있습니다(일반적으로 10개의 형광파 세트를 사용하고 기준선이 해당 피크의 평균만을 취하여 거의 일정하다는 것을 확인합니다) 초기 미니마 피크에 비해 형광이 10% 이하로 감소한 기준선으로 미니마). 펄스-LED 조명은 또한 그^{문제(16)를}완화하기 위해 적용될 수 있다.
   7. 동일한 세그먼트에 대한 배아의 양쪽에 피크 강도를 분석하여 배아의 왼쪽과 오른쪽측면에 근육 수축을 비교합니다. 수축 진폭과 피크 강도의 시간을 사용하여 배아의 양쪽을 따라 전파되는 연동 근육 수축파의 범위와 타이밍의 차이를 검사합니다.
   8. 근육 수축파 전파 동안 다른 세그먼트(예: 전방, 내측 및 후방 영역)에서 GFP의 정규화된 강도를 비교하여 파도가 전파됨에 따라 수축의 변화를 검사합니다. 이 분석은 또한 파의 방향을 결정합니다 (즉, 배아의 전방 또는 후방 영역으로 전파되는지 여부).

결과

법제1에서는WT(야생형, 캔톤-S) 배아에 정상적인 연동근 수축이 나타난다. 우리의 분석에 있는 근육 수축의 연동파의 평균 주파수는 시간당 47 수축이고 평균 진폭은 WT 태아를 위한 기준선 위에 60% 이었습니다. 배아 압연은 영화 2에서 WT 배아에 대해 도시되며, 흰색 화살표는 기관의 초기 위치를 표시하고 등쪽 부속기의 위치를 묘사하는 검은 색 화살표를 표시합니?...

토론

우리의 방법은 파도 주기성, 진폭 및 패턴을 포함하여 연동 근육 수축 파뿐만 아니라 배아 압연 및 자세에 대한 파 효과와 같은 발달 중에 중요한 배아 행동을 분석하는 정량적 방법을 제공합니다. 이것은 배아 발달 도중 이들과 그밖 행동을 통제에 있는 특정 유전자의 역할을 공부하기 위하여 다른 돌연변이의 분석에서 유용할 수 있습니다. 우리는 근육 수축 진폭, 빈도 및 배아의 수축 파 전파 방...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL