Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo per registrare le contrazioni muscolari embrionali negli embrioni della Drosophila in modo non invasivo e orientato ai dettagli.

Abstract

Le contrazioni muscolari coordinate sono una forma di comportamento ritmico visto all'inizio durante lo sviluppo negli embrioni della Drosophila. I circuiti di feedback sensoriale neuronale sono necessari per controllare questo comportamento. La mancata produzione del modello ritmico delle contrazioni può essere indicativa di anomalie neurologiche. In precedenza abbiamo scoperto che i difetti nella proteina O-mannosilation, una modificazione delle proteine post-traduzionale, influenzano la morfologia degli assoni dei neuroni sensoriali e provocano contrazioni muscolari coordinate anormali negli embrioni. Qui, presentiamo un metodo relativamente semplice per registrare e analizzare il modello delle contrazioni muscolari peristalitiche mediante l'imaging dal vivo di embrioni in fase avanzata fino al punto di schiusa, che abbiamo usato per caratterizzare il fenotipo di contrazione muscolare delle proteine Mutanti O-mannosyltransferase. I dati ottenuti da queste registrazioni possono essere utilizzati per analizzare le onde di contrazione muscolare, tra cui la frequenza, la direzione di propagazione e l'ampiezza relativa delle contrazioni muscolari in diversi segmenti del corpo. Abbiamo anche esaminato la postura del corpo e sfruttato un marcatore fluorescente espresso specificamente nei muscoli per determinare con precisione la posizione della linea mediana dell'embrione. Un approccio simile può anche essere utilizzato per studiare vari altri comportamenti durante lo sviluppo, come il rotolamento degli embrioni e la schiusa.

Introduzione

La contrazione muscolare peristaltica è un comportamento motorio ritmico simile al camminare e nuotare negli esseri umani^1,2,3. Le contrazioni muscolari embrionali osservate negli embrioni in fase avanzata della Drosophila rappresentano un esempio di tale comportamento. La Drosophila è un eccellente organismo modello per studiare vari processi di sviluppo perché lo sviluppo embrionale nella Drosophila è ben caratterizzato, relativamente breve e facile da monitorare. L'obiettivo generale del nostro metodo è quello di registrare e analizzare attentamente il modello ondulatorio di contrazione e rilassamento dei muscoli embrionali. Abbiamo usato un approccio semplice e non invasivo che offre una visualizzazione dettagliata, la registrazione e l'analisi delle contrazioni muscolari. Questo metodo può anche essere potenzialmente utilizzato per studiare altri processi in vivo, come il rotolamento embrionale visto negli embrioni in fase avanzata appena prima della schiusa. In studi precedenti, le contrazioni muscolari embrionali sono state analizzate per lo più in termini di frequenza e direzione^1,2. Per stimare l'entità relativa delle contrazioni man mano che progrediscono lungo l'asse del corpo nella direzione anteriore o posteriore, abbiamo usato embrioni che esprimono GFP in modo specifico nei muscoli. Questa analisi fornisce un modo più quantitativo per analizzare le contrazioni muscolari e per rivelare come la postura del corpo negli embrioni viene mantenuta durante una serie di onde peristaliche di contrazioni muscolari.

Le contrazioni muscolari peristaltiche sono controllate da circuiti centrali del generatore di pattern (CPG) e comunicazioni tra neuroni del sistema nervoso periferico (PNS), il sistema nervoso centrale (SNC) e muscoli^4,5. La mancata produzione di normali contrazioni muscolari peristaliche può portare a difetti come la mancata schiusa² e la locomozione larvale anormale⁶ e può essere indicativa di anomalie neurologiche. L'imaging dal vivo di onde peristalitiche di contrazione muscolare e l'analisi dettagliata dei fenotipi di contrazione possono aiutare a scoprire i meccanismi patogeni associati ai difetti genetici che interessano i muscoli e i circuiti neurali coinvolti nella locomozione. Recentemente abbiamo usato questo approccio per studiare i meccanismi che provocano una postura del corpo torsione fenotipo di proteino O-mannosyltransferase (POMT) mutanti⁷.

Protein O-mannosylation (POM) è un tipo speciale di modifica post-traduzionale, dove uno zucchero mannoso viene aggiunto ai residui di serine o di treonina di proteine della via secretoria^8,9. I difetti genetici nella POM causano distrofie muscolari congenite (CMD) negli esseri umani^10,11,12. Abbiamo studiato i meccanismi causali di queste malattie usando la Drosophila come sistema modello. Abbiamo scoperto che gli embrioni con mutazioni nella proteina della Proteina di Drosophila O-mannosyltransferasis geni POMT1 e POMT2 (a.k.a. addominale ruotato (rt) e contorti (tw )) mostrano un spostamento ("rotazione") di segmenti del corpo, che si traduce in una postura anormale del corpo⁷. È interessante notare che, questo difetto ha coinciso con la fase di sviluppo quando le contrazioni muscolari peristaliche diventano prominenti⁷.

Poiché la postura anomala del corpo negli embrioni mutanti di POM si verifica quando la muscolatura e l'epidermide sono già formate e sono iniziate onde peristaliche di contrazioni muscolari coordinate, abbiamo ipotizzato che la postura anormale del corpo potrebbe essere il risultato di un muscolo anormale contrazioni piuttosto che un difetto nella morfologia muscolare o/e epidermide⁷. I CMD possono essere associati a contrazioni muscolari anormali e difetti postura1^,e quindi l'analisi del fenotipo della postura nei mutanti PSIMT Drosophila può chiarire i meccanismi patologici associati a distrofie muscolari . Al fine di studiare la relazione tra il fenotipo della postura del corpo dei mutanti Posophila POMT e le possibili anomalie nelle onde peristaliche delle contrazioni muscolari, abbiamo deciso di analizzare le contrazioni muscolari in dettaglio utilizzando un approccio imaging.

La nostra analisi delle onde di contrazione peristale negli embrioni di Drosophila ha rivelato due modalità di contrazione distinte, designate come onde di tipo 1 e di tipo 2. Le onde di tipo 1 sono onde semplici che si propagano da anteriore a posteriore o viceversa. Le onde di tipo 2 sono onde bifasiche che iniziano all'estremità anteriore, si propagano a metà della direzione posteriore, si fermano momentaneamente, formando una contrazione statica temporale, e poi, durante la seconda fase, vengono spazzate da una contrazione peristale che propaga in avanti dall'estremità posteriore. Gli embrioni selvatici di tipo selvaggio normalmente generano una serie di contrazioni che consiste di circa 75% tipo 1 e 25% di tipo 2 onde. Al contrario, gli embrioni mutanti POMT generano onde di tipo 1 e tipo 2 a frequenze relative approssimativamente uguali.

Il nostro approccio può fornire informazioni dettagliate per l'analisi quantitativa delle contrazioni muscolari e del rotolamento degli embrioni⁷. Questo approccio potrebbe anche essere adattato per l'analisi di altri comportamenti che coinvolgono contrazioni muscolari, come la schiusa e la scansione.

Protocollo

1. Preparazione

1. Preparare una gabbia di mosca facendo circa 50 fori in un bicchiere di plastica tri-angolo di capacità 100 mL utilizzando un aghi caldo 25 G (vedi Tabella dei materiali).
2. Preparare 60 mm x 15 mm piatti Petri con succo di mela-agar (3% agar e 30% succo di mela).
3. Preparare la pasta di lievito fresco mescolando granuli di lievito secco e acqua. Stendere la pasta di lievito sui piatti di agar di mela per aumentare la deposizione delle uova.
4. Anasthetizzare circa 50-60 mosche (usare approssimativamente lo stesso numero di maschi e femmine) su CO₂ e metterli nella gabbia di mosca.
   NOT: L'uso di un aumento della percentuale di femmine (fino a 2:1 rapporto tra femmine:maschi) può contribuire ad aumentare la quantità di uova deposte per alcuni genotipi.
5. Attacca saldamente un piatto di Petri al succo di mela con pasta di lievito alla gabbia di mosca e sigillala con l'argilla da modellare. Assicurarsi che sia sigillato a tutti gli angoli.
6. Attendere che le mosche si sveglino dall'anestesia e quindi invertire la gabbia in modo che il piatto Petri è ora in fondo. Mettere la gabbia in un'incubatrice con temperatura controllata (25 gradi centigradi) e umidità (60%).
7. Lasciare che le mosche depongano le uova per 2-3 h, sostituire la piastra di mela con una fresca e lasciare che il piatto con le uova invecchiasse per 19-20 h in un'incubatrice.
   NOT: Prima del passaggio precedente, le mosche devono essere sincronizzate per facilitare la raccolta degli embrioni dello stadio 17e-f (19-21 h AEL). Questo può essere ottenuto trasferendo le mosche in una gabbia con un piatto di succo di frutta-agar di lievito fresco 3-4 volte per 12 h (una volta ogni 3-4 h). Mantenere le mosche in un ambiente luminoso circadiano controllato (ciclo LD) può anche aiutare a raccogliere una popolazione sincronizzata di embrioni, ma questo non era essenziale nei nostri esperimenti.

2. Collezione di embrioni

1. Raccogliere con cura gli embrioni con un pennello bagnato e metterli in un piatto di vetro da collezione riempito con 1x PBS.
2. Selezionare gli embrioni che hanno la loro trachea riempita d'aria. Le trachea piene d'aria indicano che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio 17 e che le loro contrazioni muscolari peristalitiche avrebbero dovuto iniziare. Le tracheae diventano chiaramente visibili quando sono piene d'aria, che può servire come marcatore per la fase 17.
3. Mettere una lastra di agar succo di mela su uno scivolo di vetro e trasferire con attenzione gli embrioni dalla PBS alla lastra. Allineare gli embrioni con il loro lato ventrale verso l'alto.
   NOT: I lati dorsali e ventrali degli embrioni possono essere distinti dalla posizione delle appendici dorsali sul guscio d'uovo.
4. Creare un contorno di cera rettangolare su un'altra diapositiva di vetro utilizzando una penna di cera (vedere Tabella dei materiali).
5. Posizionare un nastro adesivo fronte/retro all'interno di quel contorno e raccogliere delicatamente gli embrioni abbassando questa diapositiva sulla lastra di agar. Applicare una leggera pressione per garantire che gli embrioni si attacchino bene al nastro, con il loro lato dorsale verso l'alto. Se necessario, gli embrioni possono essere arrotolati sul nastro per correggere il loro orientamento. Fare tutte le manipolazioni durante il monitoraggio degli embrioni al microscopio di dissezione.
6. Coprire gli embrioni con 1x PBS per l'imaging dal vivo delle contrazioni muscolari.
   NOT: Alcune procedure descritte in precedenza sono correlate alle tecniche di base della Drosophila utilizzate in molti studi. Descrizioni più dettagliate delle comuni tecniche di Drosophila possono essere trovate altrove¹⁴.

3. Registrazione degli embrioni

1. Eseguire l'imaging dal vivo di embrioni montati su un microscopio epiflourescenza con una funzione time-lapse e una fotocamera digitale con filtri di emissione adatti (vedi Tabella deimateriali) utilizzando una lente obiettivo di immersione in acqua 10x.
   NOT: Qui abbiamo usato gli embrioni che esprimevano la GFP nei muscoli. È inoltre possibile utilizzare altri marcatori fluorescenti con set di filtri di eccitazione ed emissione adatti (ad esempio, per il rilevamento del tdTomato, è possibile utilizzare un set di filtri Chroma ET-561 per l'eccitazione e l'emissione rispettivamente intorno a 554 nm e 581 nm ottimali).
2. Eseguire la registrazione video dal vivo degli embrioni utilizzando un software adatto (vedere Tabella dei materiali) per circa 1-2 h con un tasso di acquisizione di 4 fotogrammi/s.
   NOT: Per analizzare il rotolamento dell'embrione in via di sviluppo all'interno del suo guscio, possono essere utilizzati embrioni senza espressione di marcatori fluorescenti. A tal fine, viene applicata una normale illuminazione luminosa trasmessa senza filtri spettrali per visualizzare il movimento dell'embrione all'interno del guscio (vedere Film 2).

4. Analisi delle registrazioni

1. Esportare il video registrato direttamente nell'immagine J per ulteriori analisi (ad esempio, come file AVI).
2. In ImageJ, ritaglia le registrazioni video alle dimensioni dei singoli embrioni disegnando una casella intorno a ogni embrione e facendo clic su Immagine > Ritaglia. Questo riduce notevolmente le dimensioni dei file video senza alterarne la risoluzione e ne facilita l'analisi.
3. Ruotare le immagini ritagliate per ottenere la posizione verticale della linea mediana dell'embrione rispetto allo schermo, facendo clic su Immagine > Trasforma > Ruota.
   NOT: Selezionando Anteprima durante questo processo verranno fornite indicazioni per la rotazione, mostrando le linee della griglia per garantire la posizione verticale della linea mediana.
4. Analisi quantitativa del laminazione degli embrioni :
   NOTA: per le analisi della distanza, verificare innanzitutto che le immagini includano informazioni sulla scala. È possibile aggiungere la scala dell'immagine selezionando Analizza > Imposta scala, quindi immettendo una conversione dei pixel in distanze, ad esempio micrometri
   1. Contrassegnare la posizione di una o entrambe le trachea nel primo fotogramma del video in un punto intermedio tra le estremità posteriori e anteriori. Fare clic su Analizza > Strumenti > Gestione ROI e registrare questa posizione come coordinata numero-y della sezione disegnando una casella di circa 7 m per 7 m intorno ad esso e digitando t sulla tastiera. Assicurarsi che quando si digita t, una regione di interesse sia selezionata nel video. In alternativa, selezionare la scheda Aggiungi (t) nel gestore del ROI per registrare la posizione della trachea invece di digitare il comando.
      NOT: La regione di interesse può variare in forma o dimensione a seconda della regione embrionale o dell'evento di sviluppo in fase di studio.
   2. Contrassegnare la posizione della stessa area della trachea dopo ogni contrazione peristale. Misurare la distanza dalla posizione di pre-contrazione alla posizione di post-contrazione tracciando una linea che collega i centri di ogni casella e digitando m sulla tastiera. Convertire la distanza in m utilizzando una scala nota di immagini. In alternativa, misura la distanza in m in un unico passaggio facendo clic su Analizza > Imposta scala e inserisci il fattore di conversione pixel-micron noto per produrre un rapporto in micron.
      NOT: Una distanza in pixel può essere inserita insieme con la corrispondente distanza in m.
   3. Correlare la distanza e la direzione di ogni evento rotante con la direzione della propagazione della contrazione muscolare in almeno 8 embrioni per differenze statisticamente significative.
5. Analisi quantitativa delle contrazioni muscolari embrionali:
   1. Utilizzare embrioni che esprimono marcatori fluorescenti nei muscoli (ad esempio, abbiamo usato mosche transgeniche che esprimono un costrutto di fusione di Myosin Heavy Chain promoter e GFP chiamato MHC-GFP⁵) per analizzare parametri di contrazione muscolare come ampiezza di contrazione.
   2. Utilizzare la registrazione della lettura fluorescente e disegnare una regione di interesse (ad es. una casella da 15 a 45 m [HXW]) centrata sui muscoli (che sono chiaramente visibili a causa della presenza di marcatore fluorescente) di un particolare segmento del corpo, e selezionare la scheda Aggiungi (t) e Gestione ROI per registrare la posizione del ROI. Fare clic su Gestione ROI > Misura per registrare l'intensità fluorescente media di ogni regione di interesse selezionata per ogni fotogramma del video.
   3. Sposta la casella nei centri di altri segmenti del corpo di interesse e fai clic su Aggiungi (t) nel gestore del ROI per registrare le loro posizioni. Questo darà aree di interesse di dimensioni identiche in tutti i segmenti del corpo da analizzare. Selezionare almeno un posteriore, un segmento mediale e un segmento anteriore, ad esempio A7, A4 e T2, rispettivamente.
   4. Nel gestore del ROI, selezionare tutte le aree di interesse registrate come coordinata fetta number-y coordinate-x (ad esempio, selezionando tenendo premuto Ctrl) e fare clic su Altro > Misura multipla per misurare la media fluorescente l'intensità di ogni regione di interesse per tutti i fotogrammi del video e segnalare ogni misurazione in una tabella. Ogni area di interesse è una colonna della tabella e ogni frame è una riga. Trasferire la tabella in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
   5. Tracciare un grafico con il numero del fotogramma sull'asse x e l'intensità fluorescente media sull'asse y. Il numero di fotogramma può essere convertito in tempo utilizzando la frequenza fotogrammi (4 fotogrammi/s) del video (Figura 1A).
   6. Determinare l'ampiezza di contrazione muscolare stimando l'aumento dell'intensità della fluorescenza GFP rispetto alla linea di base. Le contrazioni muscolari aumentano l'intensità GFP in quanto portano più GFP in prossimità dell'area focale man mano che più muscoli vengono tirati durante queste contrazioni (Film 1)⁷. Stabilire una fluorescenza di base come intensità media tra le onde di contrazione. Normalizza l'intensità GFP sulla linea di base dividendo ogni valore di intensità ROI per l'intensità della linea di base.
      NOT: Ogni profilo ha una diversa fluorescenza di base, in quanto potrebbero esserci diversi livelli di espressione in diversi segmenti muscolari.
      NOT: Una potenziale complicazione è che la fluorescenza GFP può cambiare nel tempo a causa dello sbiancamento delle foto. Questo può essere risolto monitorando i cambiamenti nella linea di base della fluorescenza e utilizzando una dimensione del campione sufficiente per le analisi delle onde (normalmente usiamo set di 10 onde fluorescenti e confermiamo che la linea di base è approssimativamente costante prendendo una media di solo quelle di picco minima come linea di base che è diminuita di fluorescenza del 10% o meno rispetto al picco minimo iniziale). Un'illuminazione a LED a impulsi può essere applicata anche per mitigare il problema¹⁶.
   7. Confrontare le contrazioni muscolari sui lati sinistro e destro dell'embrione analizzando le intensità di picco su entrambi i lati dell'embrione per gli stessi segmenti. Utilizzare l'ampiezza di contrazione e il tempo di intensità di picco per esaminare le differenze di estensione e tempistica delle onde di contrazione muscolare peristale che si propagano lungo entrambi i lati dell'embrione.
   8. Confrontare l'intensità normalizzata della GFP in diversi segmenti (ad esempio, nelle regioni anteriori, mediali e posteriori) durante la propagazione dell'onda di contrazione muscolare per esaminare i cambiamenti nella contrazione man mano che l'onda si propaga. Questa analisi determina anche la direzione dell'onda (cioè se si propaga verso le regioni anteriori o posteriori dell'embrione).

Risultati

Le normali contrazioni muscolari peristaltiche sono mostrate in un embrione WT (wild-type, Canton-S) nel film 1. La frequenza media delle onde peristalitiche delle contrazioni muscolari nella nostra analisi era di 47 contrazioni all'ora e l'ampiezza media era del 60% superiore alla linea di base per gli embrioni WT. Il rotolamento dell'embrione è mostrato per un embrione WT nel film 2, con la freccia bianca che segna la posizione iniziale di una trachea e una freccia nera che ...

Discussione

Il nostro metodo fornisce un modo quantitativo per analizzare importanti comportamenti embrionali durante lo sviluppo, come le onde di contrazione muscolare peristale, tra cui la periodicità delle onde, l'ampiezza e il modello, nonché l'effetto delle onde sul rotolamento e sulla postura. Questo può essere utile nelle analisi di diversi mutanti per studiare il ruolo di geni specifici nella regolazione di questi e altri comportamenti durante lo sviluppo embrionale. Abbiamo utilizzato cambiamenti nell'intensità del marc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL