Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour enregistrer les contractions musculaires embryonnaires dans les embryons de Drosophila d'une manière non-invasive et axée sur les détails.

Résumé

Les contractions musculaires coordonnées sont une forme de comportement rythmique observée tôt au cours du développement chez les embryons de Drosophila. Des circuits de rétroaction sensorielle neuronale sont nécessaires pour contrôler ce comportement. L'échec de produire le modèle rythmique des contractions peut être indicatif des anomalies neurologiques. Nous avons précédemment constaté que les défauts dans la protéine O-mannosylation, une modification post-translationnelle de protéine, affectent la morphologie d'axone des neurones sensoriels et ont comme conséquence des contractions coordonnées anormales de muscle dans des embryons. Ici, nous présentons une méthode relativement simple pour enregistrer et analyser le modèle des contractions de muscle péristaltique par l'imagerie en direct des embryons de stade tardif jusqu'au point de l'éclosion, que nous avons employé pour caractériser le phénotype de contraction de muscle de protéine O-mannosyltransferase mutants. Les données obtenues à partir de ces enregistrements peuvent être utilisées pour analyser les ondes de contraction musculaire, y compris la fréquence, la direction de la propagation et l'amplitude relative des contractions musculaires à différents segments du corps. Nous avons également examiné la posture du corps et profité d'un marqueur fluorescent exprimé spécifiquement dans les muscles pour déterminer avec précision la position de la ligne médiane de l'embryon. Une approche similaire peut également être utilisée pour étudier divers autres comportements au cours du développement, tels que le roulement et l'éclosion d'embryons.

Introduction

La contraction du muscle péristaltique est un comportement moteur rythmique similaire à la marche et la natation chez l'homme^1,2,3. Les contractions musculaires embryonnaires observées chez les embryons de phase tardive de Drosophila représentent un exemple d'un tel comportement. Drosophila est un excellent organisme modèle pour étudier divers processus de développement parce que le développement embryonnaire dans Drosophila est bien caractérisé, relativement court, et facile à surveiller. L'objectif global de notre méthode est d'enregistrer soigneusement et d'analyser le modèle onduleux de contraction et de relaxation des muscles embryonnaires. Nous avons utilisé une approche simple et non invasive qui offre une visualisation détaillée, l'enregistrement et l'analyse des contractions musculaires. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier d'autres processus in vivo, tels que le roulement embryonnaire observé chez les embryons à un stade avancé juste avant l'éclosion. Dans des études antérieures, les contractions musculaires embryonnaires ont été principalement analysées en termes de fréquence et de direction^1,2. Afin d'estimer l'étendue relative des contractions au fur et à mesure qu'elles progressent le long de l'axe du corps dans la direction antérieure ou postérieure, nous avons utilisé des embryons exprimant le GFP spécifiquement dans les muscles. Cette analyse fournit un moyen plus quantitatif d'analyser les contractions musculaires et de révéler comment la posture du corps chez les embryons est maintenue pendant une série d'ondes péristétiques de contractions musculaires.

Les contractions musculaires péristaltiques sont contrôlées par des circuits de générateurs centraux (CPG) et des communications entre les neurones du système nerveux périphérique (PNS), le système nerveux central (SNC) et les muscles^4,5. L'échec de produire des contractions peristaltiques normales de muscle peut mener aux défauts tels que l'échec à éclore² et à la locomotion larvaire anormale⁶ et peut être indicatif des anomalies neurologiques. La formation image vivante des ondes péristaltiques de contraction musculaire et l'analyse détaillée des phénotypes de contraction peuvent aider à découvrir les mécanismes pathogènes associés aux défauts génétiques affectant les muscles et les circuits neuronaux impliqués dans la locomotion. Nous avons récemment utilisé cette approche pour étudier les mécanismes qui se traduisent par un phénotype de torsion de posture du corps de protein O-mannosyltransferase (POMT) mutants⁷.

Protein O-mannosylation (POM) est un type spécial de modification post-traductionnelle, où un sucre mannose est ajouté à la sérine ou des résidus de thréonine de protéines de voie sécrétrice^8,9. Les défauts génétiques dans LES POM causent des dystrophies musculaires congénitales (CMD) chez l'homme^10,11,12. Nous avons étudié les mécanismes causatifs de ces maladies en utilisant drosophila comme système modèle. Nous avons constaté que les embryons avec des mutations dans la protéine Drosophila O-mannosyltransferase gènes POMT1 et POMT2 (alias l'abdomen rotatif (rt) et tordu (tw)) montrent un («rotation») des segments du corps, ce qui entraîne une posture corporelle anormale⁷. Intéressant, ce défaut a coïncidé avec le stadedéveloppemental quand les contractions de muscle péristaltic deviennent proéminentes 7.

Puisque la posture anormale de corps dans les embryons mutants de POM se produit quand la musculature et l'épiderme sont déjà formés et les ondes péristaltiques des contractions musculaires coordonnées ont commencé, nous avons supposé que la posture anormale de corps pourrait être une conséquence du muscle anormal contractions plutôt qu'un défaut dans la morphologie musculaire ou/et épiderme⁷. CMDs peuvent être associés à des contractions musculaires anormales et des défauts de posture¹³, et donc l'analyse du phénotype de posture dans les mutants Drosophila POMT peut élucider les mécanismes pathologiques associés aux dystrophies musculaires . Afin d'étudier la relation entre le phénotype de posture de corps des mutants de POMT de Drosophila et les anomalies possibles dans les ondes péristaltiques des contractions de muscle, nous avons décidé d'analyser des contractions de muscle en détail utilisant un vivant approche d'imagerie.

Notre analyse des ondes de contraction péristétiques chez les embryons de Drosophila a révélé deux modes de contraction distincts, désignés comme ondes de type 1 et de type 2. Les ondes de type 1 sont de simples ondes qui se propagent de l'antérieur au postérieur ou vice versa. Les ondes de type 2 sont des ondes biphasiques qui s'initient à l'extrémité antérieure, se propagent à mi-chemin dans la direction postérieure, s'arrêtent momentanément, formant une contraction statique temporelle, puis, au cours de la deuxième phase, sont balayées par une contraction péristique qui se propage en avant de l'extrémité postérieure. Les embryons de type sauvage génèrent normalement une série de contractions qui se compose d'environ 75 % d'ondes de type 1 et de 25 % de type 2. En revanche, les embryons mutants POMT génèrent des ondes de type 1 et de type 2 à des fréquences relatives à peu près égales.

Notre approche peut fournir des informations détaillées pour l'analyse quantitative des contractions musculaires et du roulement des embryons⁷. Cette approche pourrait également être adaptée pour l'analyse d'autres comportements impliquant des contractions musculaires, telles que l'éclosion et l'exploration.

Protocole

1. Préparation

1. Préparer une cage à mouches en faisant environ 50 trous dans un bécher en plastique à trois coins d'une capacité de 100 ml à l'aide d'une aiguille chaude de 25 G (voir Tableau des matériaux).
2. Préparer des plats Petri de 60 mm x 15 mm avec du jus de pomme-agar (3 % d'agar et 30 % de jus de pomme).
3. Préparer la pâte de levure fraîche en mélangeant les granules de levure sèche et l'eau. Étendre la pâte de levure sur les plaques d'agar de pomme pour augmenter la ponte.
4. Anesthésier environ 50-60 mouches (utiliser un nombre à peu près égal de mâles et de femelles) sur le CO₂ et les mettre dans la cage à mouches.
   REMARQUE: L'utilisation d'une proportion accrue de femelles (jusqu'à 2:1 ratio de femelles :mâles) peut aider à augmenter la quantité d'œufs pondus pour certains génotypes.
5. Fixez un plat Petri de jus de pomme-agar avec de la pâte de levure à la cage à mouches hermétiquement et scellez-le avec de l'argile de modélisation. Assurez-vous qu'il est scellé à tous les coins.
6. Attendez que les mouches se réveillent de l'anesthésie, puis inverser la cage de telle sorte que le plat Petri est maintenant au fond. Placez la cage dans un incubateur à température contrôlée (25 oC) et en humidité (60 %).
7. Laisser les mouches pondre des œufs pendant 2-3 h, remplacer l'assiette de pommes par une assiette fraîche et laisser l'assiette avec des œufs vieillir de 19 à 20 h dans un incubateur.
   REMARQUE: Avant l'étape ci-dessus, les mouches doivent être synchronisées pour faciliter la collecte des embryons de stade 17e-f (19-21 h AEL). Ceci peut être réalisé en transférant des mouches à une cage avec une plaque fraîche de jus-agar de jus de pomme de levure 3-4 fois pendant 12 h (une fois tous les 3-4 h). Garder les mouches à l'environnement de lumière circadien contrôlé (cycle LD) peut également aider à recueillir une population synchronisée d'embryons, mais ce n'était pas essentiel dans nos expériences.

2. Collection d'embryons

1. Choisissez soigneusement les embryons à l'aide d'un pinceau humide et placez-les dans un plat en verre de collecte rempli de 1x PBS.
2. Sélectionnez les embryons dont les trachées sont remplies d'air. Les trachées remplies d'air indiquent que les embryons ont atteint le stade 17, et que leurs contractions musculaires péristaltiques auraient dû commencer. Les trachée deviennent clairement visibles lorsqu'elles sont remplies d'air, ce qui peut servir de marqueur pour l'étape 17.
3. Placer une dalle d'agar de jus de pomme sur une lame de verre et transférer soigneusement les embryons de PBS à la dalle. Alignez les embryons avec leur côté ventral vers le haut.
   REMARQUE: Les côtés dorsaux et ventrals des embryons peuvent être distingués par la position des appendices dorsaux sur la coquille d'œuf.
4. Faire une bordure rectangulaire de cire sur un autre toboggan en verre à l'aide d'un stylo en cire (voir Tableau des matériaux).
5. Placez un ruban adhésif recto-verso à l'intérieur de cette limite et ramassez doucement les embryons en abaissant cette diapositive sur la dalle d'agar. Appliquer une pression douce pour s'assurer que les embryons collent bien à la bande, avec leur côté dorsal vers le haut. Si nécessaire, les embryons peuvent être roulés sur le ruban adhésif pour corriger leur orientation. Faites toutes les manipulations tout en surveillant les embryons sous un microscope à dissection.
6. Couvrir les embryons avec 1x PBS pour l'imagerie en direct des contractions musculaires.
   REMARQUE: Certaines procédures décrites ci-dessus sont liées aux techniques de base de Drosophila utilisées dans de nombreuses études. Des descriptions plus détaillées des techniques communes de Drosophila peuvent être trouvées ailleurs¹⁴.

3. Enregistrement d'embryons

1. Effectuer l'imagerie en direct d'embryons montés sur un microscope à épiflourescence avec une fonction time-lapse et un appareil photo numérique avec des filtres d'émission appropriés (voir Tableau des matériaux) à l'aide d'une lentille objective d'immersion en eau 10x.
   REMARQUE: Ici, nous avons utilisé des embryons exprimant GFP dans les muscles. D'autres marqueurs fluorescents avec des ensembles de filtres d'excitation et d'émission appropriés peuvent également être utilisés (p. ex., pour la détection des tdTomato, on peut utiliser un filtre Chroma ET-561 réglé pour l'excitation et l'émission autour de 554 nm et 581 nm optimaux, respectivement).
2. Effectuer l'enregistrement vidéo en direct d'embryons à l'aide d'un logiciel approprié (voir Tableau des matériaux) pendant environ 1-2 h avec un taux d'acquisition de 4 images/s.
   REMARQUE: Pour analyser le roulement de l'embryon en développement dans sa coquille, des embryons sans expression de marqueurs fluorescents peuvent être utilisés. À cette fin, l'éclairage lumineux transmis régulier sans filtres spectrals est appliqué pour visualiser le mouvement des embryons à l'intérieur de la coquille (Voir le film 2).

4. Analyse des enregistrements

1. Exporter la vidéo enregistrée directement dans Image J pour d'autres analyses (par exemple, sous forme de fichiers AVI).
2. Dans ImageJ, recadrez les enregistrements vidéo à la taille d'embryons individuels en dessinant une boîte autour de chaque embryon, puis en cliquant sur l'image 'gt; Crop. Cela réduit considérablement la taille des fichiers vidéo sans affecter sa résolution et facilite leur analyse.
3. Tournez des images recadrées pour atteindre la position verticale de la ligne médiane de l'embryon par rapport à l'écran, en cliquant sur l'image 'gt; Transformer 'gt; Rotation.
   REMARQUE: La sélection de l'aperçu au cours de ce processus fournira des conseils pour la rotation, montrant les lignes de grille pour assurer la position verticale de la ligne médiane.
4. Analyse quantitative du roulement d'embryons :
   REMARQUE : Pour les analyses à distance, confirmez d'abord que vos images contiennent des informations à l'échelle. L'échelle d'image peut être ajoutée en sélectionnant Analyze 'gt; Set Scale, puis en entrant une conversion de pixels à des distances, par exemple, micromètres
   1. Marquez la position d'une ou des deux trachée dans la première image de la vidéo à un point à mi-chemin entre les extrémités postérieures et antérieures. Cliquez sur Analyze 'gt; Outils 'gt; gestionnaire de retour sur investissement et enregistrer cette position en tant que tranche numéro-y coordonnées-x coordonnées en dessinant une boîte d'environ 7 'm par 7 'm autour d'elle et en tapant t sur le clavier. Assurez-vous que lors de la saisie t, une région d'intérêt est sélectionnée sur la vidéo. Vous pouvez également sélectionner l'onglet Ajouter (t) sur le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer la position de la trachée au lieu de taper la commande.
      REMARQUE: La région d'intérêt peut varier en forme ou en taille selon la région embryonnaire ou l'événement de développement étudié.
   2. Marquez la position de la même zone de la trachée après chaque contraction péristétique. Mesurez la distance entre la position de pré-contraction et la position post-contraction en traçant une ligne reliant les centres de chaque boîte et en tapant m sur le clavier. Convertir la distance en m à l'aide d'une échelle connue d'images. Alternativement, mesurez la distance en une seule étape en cliquant sur Analyze 'gt; Set Scale et entrez le facteur de conversion pixel-micron connu pour produire un rapport en microns.
      REMARQUE: Une distance en pixels peut être saisie avec sa distance correspondante en m.
   3. Corréler la distance et la direction de chaque événement de roulement avec la direction de la propagation de contraction musculaire dans au moins 8 embryons pour des différences statistiquement significatives.
5. Analyse quantitative des contractions musculaires embryonnaires :
   1. Utilisez des embryons exprimant des marqueurs fluorescents dans les muscles (p. ex., nous avons utilisé des mouches transgéniques exprimant une fusion de Myosin Heavy Chain promoteur et GFP appelé MHC-GFP⁵) pour analyser les paramètres de contraction musculaire tels que l'amplitude de contraction.
   2. Utilisez l'enregistrement de lecture fluorescente et dessinez une région d'intérêt (p. ex., une boîte de 15 à 45 m [HXW]) centrée sur les muscles (qui sont clairement visibles en raison de la présence de marqueur fluorescent) d'un segment particulier du corps, et sélectionnez l'onglet Ajouter (t) sur e e GESTIONNAIRE de retour sur investissement pour enregistrer la position du ROI. Cliquez sur le gestionnaire de retour sur investissement 'gt; Mesurer pour enregistrer l'intensité fluorescente moyenne de chaque région d'intérêt sélectionnée pour chaque image de la vidéo.
   3. Déplacez la boîte vers les centres d'autres segments de corps d'intérêt et cliquez sur Ajouter (t) dans le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer leurs positions. Cela donnera des régions d'intérêt de taille identique dans tous les segments du corps à analyser. Sélectionnez au moins un segment postérieur, un médial et un segment antérieur, par exemple, A7, A4 et T2, respectivement.
   4. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez toutes les régions d'intérêt enregistrées en tant que coordonnées de la tranche numéro-y-x (par exemple, en sélectionnant tout en maintenant Ctrl) et cliquez sur Plus de mesure pour mesurer la moyenne fluorescente l'intensité de chaque région d'intérêt pour toutes les images de la vidéo, et rapportez chaque mesure dans un tableau. Chaque région d'intérêt est une colonne de la table, et chaque image est une ligne. Transférer la table à un programme de feuilles de calcul pour des analyses plus poussées.
   5. Tracez un graphique avec le nombre de trame sur l'axe X et moyenne intensité fluorescente sur l'axe y. Le numéro d'image peut être converti en temps à l'aide du taux d'image (4 images/s) de la vidéo (Figure 1A).
   6. Déterminer l'amplitude de contraction musculaire en estimant l'augmentation de l'intensité de fluorescence de GFP par rapport à la ligne de base. Les contractions musculaires augmentent l'intensité du GFP car elles apportent plus de GFP dans le voisinage de la zone focale pendant que plus de muscles obtiennent tiré dedans pendant ces contractions (film 1)⁷. Établir une fluorescence de base comme intensité moyenne entre les ondes de contraction. Normalisez l'intensité du GFP à la ligne de base en divisant chaque valeur d'intensité du retour sur investissement par l'intensité de base.
      REMARQUE: Chaque profil a une fluorescence de base différente, car il peut y avoir des niveaux d'expression différents dans différents segments musculaires.
      REMARQUE: Une complication potentielle est que la fluorescence de GFP peut changer avec le temps en raison du blanchiment de photo. Cela peut être résolu en surveillant les changements dans la ligne de base de fluorescence et en utilisant une taille d'échantillon suffisante pour les analyses d'ondes (nous utilisons normalement des ensembles de 10 ondes fluorescentes et confirmons que la ligne de base est à peu près constante en prenant une moyenne de seulement ceux de pointe les minima comme ligne de base qui ont diminué dans la fluorescence de 10% ou moins par rapport au pic initial de minima). Un éclairage pulsé-LED peut également être appliqué pour atténuer ce problème¹⁶.
   7. Comparez les contractions musculaires sur les côtés gauche et droit de l'embryon en analysant les intensités maximales des deux côtés de l'embryon pour les mêmes segments. Utilisez l'amplitude de contraction et le temps des intensités maximales pour examiner les différences dans l'étendue et le moment des ondes de contraction de muscle péristaltique se propageant le long des deux côtés de l'embryon.
   8. Comparez l'intensité normalisée du PFG à différents segments (p. ex., dans les régions antérieures, médiales et postérieures) pendant la propagation des ondes de contraction musculaire afin d'examiner les changements dans la contraction à mesure que l'on se propage. Cette analyse détermine également la direction de la vague (c.-à-d. si elle se propage vers les régions antérieures ou postérieures de l'embryon).

Résultats

Les contractions normales des muscles péristétiques sont montrées dans un embryon WT (sauvage,Canton-S) dans le film 1. La fréquence moyenne des ondes péristaltiques des contractions de muscle dans notre analyse était 47 contractions par heure et l'amplitude moyenne était 60% au-dessus de la ligne de base pour des embryons de WT. Le roulement d'embryon est montré pour un embryon de WT dans le film 2, avec la flèche blanche marquant la position initiale d'une trachée e...

Discussion

Notre méthode fournit un moyen quantitatif d'analyser les comportements embryonnaires importants au cours du développement, tels que les ondes de contraction des muscles péristaltiques, y compris la périodicité des ondes, l'amplitude et le modèle, ainsi que l'effet des ondes sur le roulement et la posture des embryons. Cela peut être utile dans l'analyse de différents mutants pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans la régulation de ces comportements et d'autres au cours du développement embryonnaire....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL