Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Özet

Burada, non-invaziv ve detay odaklı bir şekilde Drosophila embriyolarında embriyonik kas kasılmaları kaydetmek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Eşgüdümlü kas kasılmaları, Drosophila embriyolarında gelişme sırasında erken görülen ritmik davranışların bir biçimidir. Neuronal duyusal geri besleme devreleri bu davranışı kontrol etmek için gereklidir. Kasılmalar ritmik deseni üretmek için başarısızlık nörolojik anomalilerin göstergesi olabilir. Daha önce protein o-mannosylation kusurları, bir posttranslasyonel protein modifikasyon, duyusal nöronların Akon morfolojisi etkileyen ve embriyolar anormal koordine kas kasılmaları sonucu bulundu. Burada, biz protein kas kasılma fenotipi karakterize etmek için kullanılan hatching noktasına kadar geç evre embriyo canlı görüntüleme tarafından peristaltik kas kasılmaları desen kayıt ve analiz için nispeten basit bir yöntem sunuyoruz O-mannosyliltransferase mutantlar. Bu kayıtlardan elde edilen veriler, farklı vücut segmentlerinde kas kasılmasının frekans, yayılma yönü ve bağıl amplitül gibi kas kasılma dalgalarını analiz etmek için kullanılabilir. Biz de vücut duruş incelenmiştir ve doğru embriyo orta çizgi konumunu belirlemek için kaslar özellikle ifade edilen bir floresan işaretçinin avantajlarından alınmıştır. Benzer bir yaklaşım da embriyo haddeleme ve hatching gibi geliştirme sırasında çeşitli davranışları incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Peristaltik kas kasılma, insanlar^1,2,3yürüyüş ve yüzme benzer bir ritmik motor davranışıdır. Drosophila geç evre embriyolar görülen embryonik kas kasılmaları böyle bir davranış örneği temsil eder. Drosophila çeşitli gelişimsel süreçleri incelemek için mükemmel bir model organizmadır, çünkü Drosophila 'da embriyonik gelişim iyi karakterize edilir, nispeten kısa ve izlenmesi kolay. Bizim yöntemin genel amacı dikkatle kaydetmek ve kasılma ve embriyonik kasların rahatlama dalga boyunu desen analiz etmektir. Biz ayrıntılı bir görselleştirme, kayıt ve kas kasılmaları analizi sunan basit, non-invaziv bir yaklaşım kullandık. Bu yöntem de potansiyel olarak diğer in vivo süreçleri incelemek için kullanılabilir, gibi embriyonik Rolling geç evre embriyolar sadece önce tarlama öncesinde görülen. Önceki çalışmalarda, embriyonik kas kasılmaları çoğunlukla frekans ve yön^1,2açısından analiz edildi. Anterior veya posterior yönde vücut ekseni boyunca ilerleme olarak kasılmalar bağıl kapsamını tahmin etmek için, biz kas özellikle GFP ifade embriyoları kullandık. Bu analiz, kas kasılmaları analiz etmek ve kas kasılmaları peristaltik dalgalar serisi sırasında embriyolar vücut duruş nasıl sürdürülür ortaya çıkarmak için daha nicel bir yol sağlar.

Peristaltik kas kasılmaları merkezi desen jeneratör (CPG) devreler ve periferik sinir sistemi (PNS), merkezi sinir sistemi (CNS) ve kaslar^4,5nöronlar arasında iletişim tarafından kontrol edilir. Normal peristaltik kas kasılmaları üretmek için başarısızlık,² ve anormal larva lokomolojik⁶ ve nörolojik anomalilerin göstergesi olabilir kaçak gibi kusurları neden olabilir. Kas kasılma ve kasılma fenotiplerinin detaylı analizi peristaltik dalgaların canlı görüntüleme, lokomotif dahil kaslar ve nöral devreleri etkileyen genetik kusurları ile ilişkili patojen mekanizmaları ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Son zamanlarda bu yaklaşım, pRotein O-mannosyltransferaz (pomt) mutantlar⁷bir vücut duruş torsiyon fenotürü neden mekanizmaları araştırmak için kullandık.

Protein O-mannosylation (POM) posttranslasyonel modifikasyon özel bir türüdür, bir mannoz şeker serin eklenir ya da salgı yolu proteinleri treonin kalıntıları^8,9. Genetik kusurları POM neden konjenital kas distrophies (CMD) insanlarda^10,11,12. Bu hastalıkların etken mekanizmalarını model sistemi olarak Drosophila kullanarak araştırdık. Biz Drosophila protein O-mannosyltransferase genler POMT1 ve POMT2 (aka Döndürülmüş karın (RT) ve bükülmüş (tw)) içinde mutasyonlar ile embriyo bulundu bir anormal vücut duruş sonuçları vücut segmentleri, deplasman ("dönme")⁷. İlginçtir ki, bu kusur, peristaltik kas kasılmaları belirgin hale geldiğinde gelişimsel aşamasına denk gelmiştir⁷.

Kaslı ve epidermis zaten oluşmuş ve koordine kas kasılmaları peristaltik dalgalar başladı POM mutant embriyolar anormal vücut duruş doğar beri, biz anormal vücut duruş anormal kas bir sonucu olabilir hipotez kas veya/ve epidermis morfoloji bir kusur yerine kasılmalar⁷. CMDS anormal kas kasılmaları ve duruş kusurları ile ilişkili olabilir¹³, ve böylece Drosophila pomt mutantlarda duruş fenotipi Analizi kas distrophies ile ilişkili patolojik mekanizmaları aydınlatmak olabilir . Drosophila pomt mutantların vücut duruş fenotipi ve kas kasılmaları peristaltik dalgalar olası anomaliler arasındaki ilişkiyi incelemek için, biz canlı kullanarak detaylı kas kasılmaları analiz karar verdi görüntüleme yaklaşımı.

Drosophila embriyolarında peristaltik kasılma dalgaları analizimiz, tip 1 ve tip 2 dalgaları olarak belirlenmiş iki farklı kasılma modu ortaya koydu. Tip 1 dalgalar anterior posterior veya tersi yayılan basit dalgalar vardır. Tip 2 dalgalar anterior ucunda Başlatan bifazik dalgalar, posterior yönde yarım yaymak, anlık durağan, bir temporal statik kasılma şekillendirme, ve daha sonra, ikinci aşamada, yayar bir peristaltik kasılma tarafından süpürülür arka ucunda ileri. Vahşi tip embriyolar normalde yaklaşık 75% tip 1 ve% 25 tip 2 dalgadan oluşan bir dizi kasılmalar üretir. Buna karşılık, Pomt mutant embriyo türü 1 ve tip 2 dalgalar yaklaşık eşit göreli Frekanslar oluşturur.

Yaklaşımımız kas kasılmaları ve embriyo haddeleme⁷nicel analizi için ayrıntılı bilgi sağlayabilir. Bu yaklaşım, kas kasılmaları içeren diğer davranışların analizine de uyarlanabilir, örneğin tarama ve tarama gibi.

Protokol

1. hazırlık

1. Bir sıcak 25 G iğne kullanarak bir 100 ml kapasiteli üç köşe plastik kabı yaklaşık 50 delik yaparak bir sinek kafesi hazırlayın ( malzeme tablosunabakın).
2. Hazırlama 60 mm x 15 mm Petri yemekleri elma suyu ile-agar (3% Agar ve 30% elma suyu).
3. Kuru Maya granül ve su karıştırma taze Maya hamur hazırlayın. Yumurta döşeme artırmak için elma agar plakaları üzerine Maya hamur Spread.
4. 50-60 sinekler hakkında anestezi (erkek ve dişi yaklaşık eşit sayıda kullanın) CO₂ ve sinek kafesi koyun.
   Not: Kadınlarda artan bir oranını kullanarak (kadar ~ 2:1 kadın oranı: erkek) bazı genotypes için laid yumurta miktarını artırmaya yardımcı olabilir.
5. Sıkıca sinek kafesi Maya macun ile bir elma suyu-agar Petri çanak takın ve modelleme kil ile mühürleyin. Her köşelerde mühürlendiğinden emin olun.
6. Sinekler anesteziden uyanana kadar bekleyin ve ardından Petri tabağı Şu anda alt kısımda olduğu gibi kafesi ters çevirin. Kafes kontrollü sıcaklık (25 °C) ve nem (% 60) ile bir kuluçla yerleştirin.
7. 2-3 h için yumurta yatıyordu uçar izin, taze bir ile elma plaka yerine, ve bir kuluçk 19-20 h için yumurta yaş ile plaka izin.
   Not: Yukarıdaki adımda önce, sinekler Stage 17E-f (19-21 h AEL) embriyoları koleksiyonunu kolaylaştırmak için senkronize edilmelidir. Bu taze Maya-elma suyu-agar plaka 3-4 kez 12 h (bir kez her 3-4 h) ile bir kafes uçar aktararak elde edilebilir. Kontrollü sirkadiyen ışık ortamında sinekler tutulması (LD döngüsü) Ayrıca embriyolar eşitlenmiş bir nüfus toplama ile yardımcı olabilir, ama bu bizim deneyler önemli değildi.

2. embriyo koleksiyonu

1. Dikkatli bir ıslak fırça ile embriyolar seçin ve 1x PBS ile dolu bir toplama cam çanak onları yerleştirin.
2. Onların trakheae hava ile dolu olan embriyo seçin. Hava dolu trakheae, embriyoların sahne 17 ' ye ulaştığını ve peristaltik kas kasılmaları başlamalıdır gösterir. Tracheae, sahne 17 için bir marker olarak hizmet verebilir hava ile doldurulduğunda açıkça görünür hale gelir.
3. Bir cam slayt üzerinde bir elma suyu agar levha yerleştirin ve dikkatle PBS dan levha için embriyolar aktarmak. Embriyoları kendi ventral taraflarıyla sıraya atın.
   Not: Embriyoların dorsal ve ventral yanları, yumurta kabuğu üzerindeki dorsal uzantların pozisyonuna göre ayırt edilebilir.
4. Bir balmumu kalem kullanarak başka bir cam slayt üzerinde dikdörtgen bir balmumu sınırı olun ( malzeme tablosunabakın).
5. Bu sınır içinde bir çift taraflı yapışkan bant yerleştirin ve yavaşça agar levha üzerine bu slaytı düşürerek embriyoları almak. Embriyolar bant iyi, onların dorsal tarafı kadar sopa sağlamak için nazik basınç uygulayın. Gerekirse, embriyolar yönlendirmesini düzeltmek için bantta yuvarlanmış olabilir. Bir diseksiyon mikroskop altında embriyolar izlerken tüm manipülasyonlar yapın.
6. Kas kasılmaları canlı görüntüleme için 1x PBS ile embriyo kapak.
   Not: Yukarıda açıklanan bazı prosedürler, birçok çalışmada kullanılan temel Drosophila teknikleriyle ilgilidir. Ortak Drosophila teknikleri daha ayrıntılı açıklamaları başka bir yerde bulunabilir¹⁴.

3. embriyo kaydı

1. 10X su daldırma objektif objektif kullanarak bir zaman atlamalı fonksiyon ve uygun emisyon filtreleri (bkz . malzeme tablosu) ile bir dijital fotoğraf makinesi ile bir epiflourescence mikroskop üzerinde monte embriyo canlı görüntüleme gerçekleştirin.
   Not: Burada kas GFP ifade embriyolar kullanılır. Uygun uyarılma ışık ve emisyon filtre setleri ile Diğer Floresan belirteçleri de kullanılabilir (örn., tdTomato algılama için, bir Chroma ET-561 filtre seti uygun 554 nm ve 581 Nm, sırasıyla uyarma ve emisyon için kullanabilirsiniz).
2. Uygun yazılım kullanarak embriyoların canlı video kaydını gerçekleştirin (bkz. malzeme tablosu) yaklaşık 1-2 h bir edinme oranı ile 4 kare/s.
   Not: Onun kabuk içinde gelişmekte olan embriyo haddeleme analiz etmek için, floresan işaretçileri ifadesi olmadan embriyolar kullanılabilir. Bu amaçla, kabuk içindeki embriyo hareketini görselleştirmek için spektral filtreler içermeyen düzenli olarak iletilen ışık aydınlatması uygulanır (bkz. Film 2).

4. kayıtların Analizi

1. Daha fazla analiz için kaydedilmiş videoyu doğrudan Image J 'ye dışa aktarın (örn. AVI dosyaları gibi).
2. Imagej 'de, her bir embriyo etrafında bir kutu çizerek ve sonra görüntü > kırpmatıklayarak bireysel embriyolar boyutuna video kayıtlarını kırpın. Bu, çözünürlüğü etkilemeden video dosyalarının boyutunu büyük ölçüde azaltır ve analizlerini kolaylaştırır.
3. Görüntü > Dönüştür > Döndür 'ütıklayarak, ekrana göre embriyo orta çizgisinin dikey konumuna ulaşmak için kırpılmış görüntüleri döndürün.
   Not: Bu işlem sırasında Önizleme 'yi seçmek, orta çizginin dikey konumunu sağlamak için kılavuz çizgilerini gösteren rotasyon için rehberlik sağlayacaktır.
4. Embriyo haddeleme nicel Analizi :
   Not: mesafe analizleri için öncelikle görüntülerinizin ölçek bilgilerini içerdiğini onaylayın. Görüntü ölçeği, analiz et ≫ ölçek ayarlaseçeneğini belirleyerek ve ardından mesafelere piksel dönüşümü (örn., mikrometre) girerek eklenebilir
   1. Arka ve ön uçları arasındaki bir noktada video ilk çerçevede bir veya her iki tracheae konumunu işaretle. Tıklayın analiz > araçları > YG Yöneticisi ve bu pozisyonu dilim numarası-y koordinat-x koordinatı olarak yaklaşık 7 μm ile 7 μm etrafında bir kutu çizim ve klavyede t yazarak kaydedin. Tyazarken, videoda bir ilgi alanı seçildiğinden emin olun. Alternatif olarak, komutu yazmak yerine trakea konumunu kaydetmek için YG yöneticisinde Ekle (t) sekmesini seçin.
      Not: İlgi bölgesi, embriyonik bölgeye veya gelişimsel etkinliğe bağlı olarak şekil veya boyutta farklılık gösterebilir.
   2. Her peristaltik kasılma sonra trakea aynı alanın konumunu işaretleyin. Her kutunun merkezini bağlayan ve klavyede m yazarak bir çizgi çizerek, ön kontraksiyonlu pozisyondan sonrası kasılma konumuna uzaklığı ölçün. Görüntü bilinen bir ölçek kullanarak μm uzaklığı dönüştürün. Alternatif olarak, tek bir adımda μm cinsinden uzaklığı ölçerek analiz ≫ Ölçek ayarlayın ve mikron cinsinden bir raporu vermek için bilinen pikselden micron dönüştürme faktörünü girin.
      Not: Piksel cinsinden bir mesafe, karşılık gelen uzaklığı ile birlikte μm olarak girilebilir.
   3. İstatistiksel olarak önemli farklılıklar için en az 8 Embriyoda kas kasılma yayılımı yönünde her bir yuvarlanma olayının mesafeyi ve yönünü ilişkilendirir.
5. Embriyonik kas kasılmaları nicel Analizi:
   1. Embriyoların kaslarda floresan belirteçleri ifade kullanın (örn., biz transgenik sinek MYosin Hağırmış Chain organizatör ve Gfp denilen MHC-Gfp⁵) bir füzyon yapı ifade kullanılan kas kasılma parametrelerini analiz etmek gibi kasılma genliği.
   2. Floresan okuma kaydını kullanın ve ilgi bir bölge çizmek (örneğin, bir kutu 15 μm için 45 μm [HXW]) kaslarda merkezli (hangi açık floresan işaretleyici varlığı nedeniyle görünür) belirli bir vücut segmenti, ve seçin Ekle (t) Tab üzerinde YG 'nin konumunu kaydetmek için YG Yöneticisi. Video her kare için seçilen ilgi her bölgenin ortalama floresan yoğunluğu kaydetmek için ROI yöneticisi > Ölçü tıklayın.
   3. Kutuyu ilgi diğer vücut segmentlerinin merkezlerine taşıyın ve pozisyonları kaydetmek için YG yöneticisinde Ekle (t) seçeneğine tıklayın. Bu, tüm vücut segmentlerinde aynı boyutta ilgi bölgeleri analiz edilecek verecektir. Sırasıyla en az bir posterior, bir medial ve bir ön segment, örneğin a7, A4 ve T2 seçin.
   4. YG yöneticisinde, dilim numarası-y koordinat-x koordinatı olarak kaydedilen tüm ilgi bölgelerini seçin (örn., CTRL tuşunubasılı tutarak seçerek) ve ortalama floresan ölçmek Için daha fazla > Multi ölçmek tıklayın Her bölgenin ilgi yoğunluğu, videonun tüm çerçeveleri için ve bir tabloda her ölçümü rapor. İlgi her bölge tablonun bir sütundur ve her çerçeve bir satırdır. Daha fazla analizler için tabloyu bir elektronik tablo programına aktarın.
   5. Y ekseni üzerinde x ekseni ve ortalama floresan yoğunluğu üzerinde kare numarası ile bir grafik çizin. Kare numarası, videonun kare hızını (4 kare/s) kullanarak zamana dönüştürülebilir (Şekil 1A).
   6. GFP floresans yoğunluğunun temeline göre artmasını tahmin ederek kas kasılma genliğini belirleyin. Daha fazla kas bu Kasılmalar sırasında çekti olsun gibi odak alanının yakınında daha GFP getirmek kas kasılmaları GFP yoğunluğu artırmak (Film 1)⁷. Kasılma dalgaları arasındaki ortalama yoğunluk olarak temel floresans oluşturun. Her YG yoğunluğu değerini temel yoğunluğa bölerek GFP yoğunluğunu temel olarak normalleştirin.
      Not: Farklı kas segmentlerinde farklı ifade seviyeleri olabilir gibi her profilin farklı bir temel floresan vardır.
      Not: Bir potansiyel komplikasyon GFP floresans fotoğraf beyazlatma nedeniyle zamanla değişebilir olmasıdır. Bu, floresan temelindeki değişiklikleri izleyerek ve dalga analizleri için yeterli numune boyutunu kullanarak çözülebilir (normalde 10 flüoresan dalgalar setleri kullanıyoruz ve taban çizgisinin yalnızca bu zirvenin ortalamasını alarak yaklaşık olarak sabit olduğunu onaylayın ilk Minima zirvesine göre% 10 veya daha az olan floresan olarak azalan temel olarak Minima). Bu sorun¹⁶azaltmak için bir Pulse-LED aydınlatma da uygulanabilir.
   7. Aynı segmentlerde embriyonun her iki tarafındaki en yüksek yoğunlukları analiz ederek embriyonun sol ve sağ taraflarında kas kasılmaları karşılaştırın. Embriyonun her iki tarafında yayılan peristaltik kas kasılma dalgalarının ölçüde ve zamanlamasında farklılıkları incelemek için daralma genliği ve tepe yoğunluklarının süresini kullanın.
   8. Farklı segmentlerde GFP normalleştirilmiş yoğunluğunu karşılaştırın (örneğin, anterior, medial ve posterior bölgelerde) kas kasılma dalga yayılma sırasında dalga yayar gibi kasılma değişiklikleri incelemek için. Bu analiz aynı zamanda dalgaların yönünü de belirler (yani, embriyonun anterior veya posterior bölgelerine doğru yayar).

Sonuçlar

Normal peristaltik kas kasılmaları Film 1' de bir WT (Wild-Type, Canton-S) embriyo gösterilir. Analizimizde kas kasılmaları peristaltik dalgaların ortalama sıklığı saat başına 47 kasılmalar oldu ve ortalama amplitüd WT embriyoları için temel olarak% 60 üzerinde oldu. Embriyo haddeleme film 2 bir WT embriyo için gösterilir, beyaz ok bir trakea ilk pozisyonu ve bir dorsal uzantının konumunu tasvir siyah bir ok işaretleme ile. Dorsal eklentisi (dış) trachea...

Tartışmalar

Yöntemimiz, dalga periodicity, genlik ve desen gibi peristaltik kas kasılma dalgaları, embriyo haddeleme ve duruş üzerinde dalga etkisi gibi gelişim sırasında önemli embriyo davranışlarını analiz etmek için nicel bir yol sağlar. Bu, embriyonik gelişim sırasında bu ve diğer davranışları düzenleyen belirli genlerin rolünü incelemek için farklı mutantların analizinde yararlı olabilir. Biz kas kasılma genliği, frekans ve embriyoların kasılma dalgası yayılma yönünü analiz etmek için kasl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL