Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode vor, um embryonale Muskelkontraktionen in Drosophila-Embryonen nicht-invasiv und detailorientiert aufzuzeichnen.

Zusammenfassung

Koordinierte Muskelkontraktionen sind eine Form des rhythmischen Verhaltens, das früh während der Entwicklung bei Drosophila-Embryonen beobachtet wird. Um dieses Verhalten zu steuern, sind neuronale sensorische Rückkopplungskreise erforderlich. Wenn das rhythmische Muster von Kontraktionen nicht erzeugt wird, kann dies auf neurologische Anomalien hindeuten. Wir haben zuvor festgestellt, dass Defekte in der Protein-O-Mannosylierung, einer posttranslationalen Proteinmodifikation, die Axonmorphologie sensorischer Neuronen beeinflussen und zu abnormalen koordinierten Muskelkontraktionen in Embryonen führen. Hier stellen wir eine relativ einfache Methode zur Aufzeichnung und Analyse des Musters peristaltischer Muskelkontraktionen durch Live-Bildgebung von Embryon im späten Stadium bis zum Schraffur, die wir verwendet, um die Muskelkontraktion Phänotyp des Proteins charakterisieren O-mannosyltransferase Mutanten. Daten aus diesen Aufzeichnungen erhalten können verwendet werden, um Muskelkontraktionswellen zu analysieren, einschließlich Frequenz, Richtung der Ausbreitung und relative Amplitude von Muskelkontraktionen an verschiedenen Körpersegmenten. Wir haben auch die Körperhaltung untersucht und einen fluoreszierenden Marker genutzt, der speziell in den Muskeln ausgedrückt wird, um die Position der Embryo-Mittellinie genau zu bestimmen. Ein ähnlicher Ansatz kann auch verwendet werden, um verschiedene andere Verhaltensweisen während der Entwicklung zu studieren, wie embryonalieren und schlüpfen.

Einleitung

Peristaltische Muskelkontraktion ist ein rhythmisches motorisches Verhalten ähnlich wie Gehen und Schwimmen beim Menschen^1,2,3. Embryonale Muskelkontraktionen, die in Drosophila-Embryonen im späten Stadium beobachtet werden, sind ein Beispiel für ein solches Verhalten. Drosophila ist ein ausgezeichneter Modellorganismus, um verschiedene Entwicklungsprozesse zu studieren, da die embryonale Entwicklung in Drosophila gut charakterisiert, relativ kurz und leicht zu überwachen ist. Das übergeordnete Ziel unserer Methode ist es, das wellenartige Muster der Kontraktion und Entspannung der embryonalen Muskeln sorgfältig aufzuzeichnen und zu analysieren. Wir verwendeten einen einfachen, nicht-invasiven Ansatz, der eine detaillierte Visualisierung, Aufzeichnung und Analyse von Muskelkontraktionen bietet. Diese Methode kann möglicherweise auch verwendet werden, um andere In-vivo-Prozesse zu untersuchen, wie z. B. embryonale Walzen, die in späten Embryonen kurz vor dem Schlüpfen beobachtet wurden. In früheren Studien wurden embryonale Muskelkontraktionen meist in Bezug auf Häufigkeit und Richtung^{analysiert 1,2}. Um das relative Ausmaß der Kontraktionen zu schätzen, während sie entlang der Körperachse in vorderer oder hinterer Richtung voranschreiten, haben wir Embryonen verwendet, die GFP spezifisch in muskeln ausdrücken. Diese Analyse bietet eine quantitativere Möglichkeit, Muskelkontraktionen zu analysieren und zu zeigen, wie die Körperhaltung in Embryonen während einer Reihe peristaltischer Wellen von Muskelkontraktionen aufrechterhalten wird.

Peristaltische Muskelkontraktionen werden durch zentrale Mustergenerator (CPG) Schaltungen und Kommunikation zwischen Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS), des zentralen Nervensystems (ZNS) und Muskeln^4,5gesteuert. Wenn keine normalen peristaltischen Muskelkontraktionen auftreten, kann dies zu Defekten wie dem Versagen der Luke² und der abnormalen Larvenfortbewegung⁶ führen und kann auf neurologische Anomalien hinweisen. Live-Bildgebung von peristaltischen Wellen der Muskelkontraktion und detaillierte Analyse von Kontraktion Phänotypen können helfen, pathogene Mechanismen im Zusammenhang mit genetischen Defekten, die Muskeln und neuronale Schaltkreise in der Fortbewegung beteiligt aufzudecken. Wir haben vor kurzem diesen Ansatz verwendet, um Mechanismen zu untersuchen, die zu einem Körperhaltungs-Torsion-Phänotypvon protin O-mannosyltransferase (POMT) Mutanten 7 führen.

Protein-O-Mannosylierung (POM) ist eine spezielle Art der posttranslationalen Modifikation, bei der ein Mannosezucker zu Serin- oder Threoninrückständen von sekretorischen Signalwegproteinen^8,9hinzugefügt wird. Genetische Defekte in POM verursachen angeborene Muskeldystrophien (CMD) beim Menschen^10,11,12. Wir untersuchten die ursächlichen Mechanismen dieser Krankheiten mit Drosophila als Modellsystem. Wir fanden heraus, dass Embryonen mit Mutationen in Drosophila-Protein O-mannosyltransferase Gene POMT1 und POMT2 (auch als rotierter Bauch (rt) und verdreht (tw)) Verschiebung ("Rotation") von Körpersegmenten, was zu einer abnormalen Körperhaltung führt⁷. Interessanterweise fiel dieser Defekt mit dem Entwicklungsstadium zusammen, wenn peristaltische Muskelkontraktionen prominent werden⁷.

Da abnorme Körperhaltung in POM-mutierten Embryonen entsteht, wenn muskulös und epidermis bereits gebildet sind und peristaltische Wellen koordinierter Muskelkontraktionen begonnen haben, vermuteten wir, dass eine abnorme Körperhaltung eine Folge abnormaler Muskeln sein könnte. Kontraktionen statt eines Defekts in der Muskel- oder/und Epidermismorphologie⁷. CMDs können mit abnormalen Muskelkontraktionen und Haltungsfehlern in Verbindung gebracht werden¹³, und daher kann die Analyse des Haltungsphänotyps bei Drosophila POMT-Mutanten pathologische Mechanismen im Zusammenhang mit Muskeldystrophien aufklären . Um den Zusammenhang zwischen dem Körperhaltungsphänotyp von Drosophila POMT Mutanten und möglichen Anomalien in peristaltischen Wellen von Muskelkontraktionen zu untersuchen, haben wir beschlossen, Muskelkontraktionen im Detail mit einem bildgebenden Ansatz.

Unsere Analyse von peristaltischen Kontraktionswellen in Drosophila-Embryonen ergab zwei unterschiedliche Kontraktionsmodi, die als Typ-1- und Typ-2-Wellen bezeichnet wurden. Typ-1-Wellen sind einfache Wellen, die sich von vorn zu hintergründ oder umgekehrt ausbreiten. Typ-2-Wellen sind biphasische Wellen, die sich am vorderen Ende antreiben, sich auf halbem Weg in die hintere Richtung ausbreiten, kurzzeitig anhalten, eine zeitliche statische Kontraktion bilden und dann, während der zweiten Phase, von einer peristaltischen Kontraktion gefegt werden, die sich fortausbreitet. vom hinteren Ende nach vorne. Wildtyp-Embryonen erzeugen normalerweise eine Reihe von Kontraktionen, die aus etwa 75 % Typ-1- und 25 %-Typ-2-Wellen bestehen. Im Gegensatz dazu erzeugen POMT-mutierte Embryonen Typ-1- und Typ-2-Wellen bei annähernd gleichen relativen Frequenzen.

Unser Ansatz kann detaillierte Informationen für die quantitative Analyse von Muskelkontraktionen und Embryorollen⁷liefern. Dieser Ansatz könnte auch für Analysen anderer Verhaltensweisen mit Muskelkontraktionen, wie Schlüpfen und Kriechen, angepasst werden.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie einen Fliegenkäfig vor, indem Sie etwa 50 Löcher in einem 100 ml Tragfähigkeittri-Eck-Kunststoffbecher mit einer heißen 25 G Nadel machen (siehe Tabelle der Materialien).
2. 60 mm x 15 mm Petrischalen mit Apfelsaft-Agar (3% Agar und 30% Apfelsaft) zubereiten.
3. Bereiten Sie frische Hefepaste durch Mischen von trockenem Hefegranulat und Wasser vor. Die Hefepaste auf die Apfelagarplatten verteilen, um die Eiablage zu erhöhen.
4. Anästhetisieren Sie etwa 50-60 Fliegen (verwenden Sie etwa die gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen) auf CO₂ und legen Sie sie in den Fliegenkäfig.
   HINWEIS: Die Verwendung eines erhöhten Anteils von Weibchen (bis zu 2:1-Verhältnis von Weibchen:Männchen) kann dazu beitragen, die Menge der gelegten Eier für einige Genotypen zu erhöhen.
5. Eine Apfelsaft-Agar Petrischale mit Hefepaste fest am Fliegenkäfig befestigen und mit Modellierton versiegeln. Stellen Sie sicher, dass es an allen Ecken versiegelt ist.
6. Warten Sie, bis fliegen aus der Anästhesie aufwachen und dann den Käfig so umkehren, dass die Petrischale nun am Boden ist. Legen Sie den Käfig in einen Inkubator mit kontrollierter Temperatur (25 °C) und Luftfeuchtigkeit (60%).
7. Lassen Sie Fliegen Eier für 2-3 h legen, ersetzen Sie den Apfelteller mit einem frischen, und lassen Sie den Teller mit Eiern Alter für 19-20 h in einem Brutkasten.
   HINWEIS: Vor dem obigen Schritt müssen Fliegen synchronisiert werden, um die Entnahme von Embryon des Stadiums 17e-f (19-21 h AEL) zu erleichtern. Dies kann erreicht werden, indem Fliegen in einen Käfig mit einem frischen Hefe-Apfel-Saft-Agar-Teller 3-4 mal für 12 h (einmal alle 3-4 h) übertragen werden. Fliegen in kontrollierter zirkadianer Lichtumgebung (LD-Zyklus) zu halten kann auch beim Sammeln einer synchronisierten Population von Embryonen helfen, aber dies war in unseren Experimenten nicht wesentlich.

2. Sammlung von Embryonen

1. Wählen Sie Embryonen vorsichtig mit einem nassen Pinsel und legen Sie sie in eine Sammelglasschale, die mit 1x PBS gefüllt ist.
2. Wählen Sie die Embryonen aus, deren Luft luftgefüllt ist. Luftgefüllte Luftröhren deuten darauf hin, dass Embryonen Stadium 17 erreicht haben, und ihre peristaltischen Muskelkontraktionen sollten beginnen. Tracheae werden deutlich sichtbar, wenn sie mit Luft gefüllt werden, was als Marker für Stufe 17 dienen kann.
3. Legen Sie eine Apfelsaft-Agarplatte auf eine Glasrutsche und übertragen Sie Embryonen vorsichtig von PBS auf die Platte. Richten Sie die Embryonen mit ihrer ventralen Seite nach oben.
   HINWEIS: Dorsale und ventrale Seiten von Embryonen können durch die Position von dorsalen Anhängseln auf der Eierschale unterschieden werden.
4. Erstellen Sie eine rechteckige Wachsgrenze auf einem anderen Glasschlitten mit einem Wachsstift (siehe Materialtabelle).
5. Legen Sie ein doppelseitiges Klebeband innerhalb dieser Grenze und nehmen Sie die Embryonen vorsichtig auf, indem Sie diesen Schlitten auf die Agarplatte senken. Tragen Sie sanften Druck auf, um sicherzustellen, dass Embryonen gut auf dem Band kleben, mit ihrer rückenden Seite nach oben. Bei Bedarf können Embryonen auf dem Band gerollt werden, um ihre Ausrichtung zu korrigieren. Machen Sie alle Manipulationen, während Sie Embryonen unter einem Seziermikroskop überwachen.
6. Bedecken Sie Embryonen mit 1x PBS für die Live-Bildgebung von Muskelkontraktionen.
   HINWEIS: Einige oben beschriebene Verfahren beziehen sich auf grundlegende Drosophila-Techniken, die in vielen Studien verwendet werden. Detailliertere Beschreibungen der gängigen Drosophila-Techniken finden Sie an anderer Stelle¹⁴.

3. Aufnahme von Embryonen

1. Führen Sie live die Bildgebung von montierten Embryonen auf einem Epifloureszenzmikroskop mit Zeitrafferfunktion und einer Digitalkamera mit geeigneten Emissionsfiltern (siehe Materialtabelle)mit einer 10-fachen Wassertauchobjektivlinse durch.
   HINWEIS: Hier verwendeten wir Embryonen, die GFP in den Muskeln ausdrücken. Es können auch andere Leuchtstoffmarker mit geeigneten Anregungslicht- und Emissionsfiltersätzen verwendet werden (z.B. zur tdTomato-Erkennung kann ein Chroma ET-561 Filterset zur Anregung und Emission um optimale 554 nm bzw. 581 nm verwendet werden).
2. Führen Sie Live-Videoaufzeichnungen von Embryonen mit geeigneter Software (siehe Tabelle der Materialien) für ca. 1-2 h mit einer Erfassungsrate von 4 Frames/s durch.
   HINWEIS: Zur Analyse des Walzens des sich entwickelnden Embryos in seiner Schale können Embryonen ohne Expression von fluoreszierenden Markern verwendet werden. Zu diesem Zweck wird eine regelmäßige Lichtdurchlässigkeit ohne Spektralfilter angewendet, um die Embryobewegung innerhalb der Schale zu visualisieren (siehe Film 2).

4. Analyse der Aufnahmen

1. Exportieren Sie das aufgenommene Video direkt in Bild J für weitere Analysen (z.B. als AVI-Dateien).
2. Schneiden Sie in ImageJ die Videoaufzeichnungen auf die Größe einzelner Embryonen zu, indem Sie eine Box um jeden Embryo zeichnen und dann auf Bild > Zuschneidenklicken. Dadurch wird die Größe von Videodateien erheblich reduziert, ohne die Auflösung zu beeinträchtigen, und die Analyse erleichtert.
3. Drehen Sie zugeschnittene Bilder, um eine vertikale Position der Embryo-Mittellinie relativ zum Bildschirm zu erreichen, indem Sie auf Bild > Transform > Drehenklicken.
   HINWEIS: Wenn Sie während dieses Vorgangs Vorschau auswählen, wird eine Anleitung für die Drehung angezeigt, in der Gitternetzlinien angezeigt werden, um die vertikale Position der Mittellinie sicherzustellen.
4. Quantitative Analyse des Embryowalzens :
   HINWEIS: Bestätigen Sie bei Entfernungsanalysen zunächst, dass Ihre Bilder Skaleninformationen enthalten. Bildmaßstab kann hinzugefügt werden, indem Sie Analysieren > Skalierung festlegenauswählen und dann eine Konvertierung von Pixeln in Entfernungen eingeben, z. B. Mikrometer
   1. Markieren Sie die Position einer oder beider Luftröhren im ersten Frame des Videos an einem Punkt auf halbem Weg zwischen hinteren und vorderen Enden. Klicken Sie auf Analysieren > Werkzeuge > ROI-Manager und zeichnen Sie diese Position als Slice-Nummer-y-Koordinaten-x-Koordinate auf, indem Sie eine Box von ca. 7 x 7 x m um sie herum zeichnen und t auf der Tastatur eingeben. Stellen Sie sicher, dass bei der Eingabe von teine Interessensgruppe im Video ausgewählt wird. Alternativ können Sie die Registerkarte Hinzufügen (t) im ROI-Manager auswählen, um die Position der Luftröhre aufzuzeichnen, anstatt den Befehl einzugeben.
      HINWEIS: Die Region von Interesse kann je nach embryonaler Region oder Entwicklungsereignis, die untersucht wird, in Form oder Größe variieren.
   2. Markieren Sie die Position des gleichen Bereichs der Luftröhre nach jeder peristaltischen Kontraktion. Messen Sie den Abstand von der Position vor der Kontraktion zur Position nach der Kontraktion, indem Sie eine Linie zeichnen, die die Mitten jedes Feldes verbindet, und m auf der Tastatur eingeben. Konvertieren Sie den Abstand mit einem bekannten Maßstab von Bildern in die Größe von m. Messen Sie alternativ den Abstand in einem einzigen Schritt, indem Sie auf Analysieren > Skalierung festlegen klicken und den bekannten Pixel-zu-Mikron-Umrechnungsfaktor eingeben, um einen Bericht in Mikrometern zu erhalten.
      HINWEIS: Ein Abstand in Pixel kann zusammen mit dem entsprechenden Abstand in 'm eingegeben werden.
   3. Korrelieren Sie die Entfernung und Richtung jedes rollenden Ereignisses mit der Richtung der MuskelkontraktionSausbreitung in mindestens 8 Embryonen für statistisch signifikante Unterschiede.
5. Quantitative Analyse embryonaler Muskelkontraktionen:
   1. Verwenden Sie Embryonen, die fluoreszierende Marker in Muskeln exdrücken (z. B. verwendeten wir transgene Fliegen, die ein Fusionskonstrukt von MYosin Heavy Chain Promoter und GFP namens MHC-GFP⁵) exezieren, um Parameter für die Muskelkontraktion wie Kontraktionsamplitude.
   2. Verwenden Sie die Aufzeichnung der fluoreszierenden Auslesung und zeichnen Sie einen Bereich von Interesse (z. B. eine Box von 15 bis 45 m [HXW]), die auf die Muskeln (die aufgrund des Vorhandenseins eines fluoreszierenden Markers deutlich sichtbar sind) eines bestimmten Körpersegments zentriert ist, und wählen Sie die Registerkarte Hinzufügen (t) auf dem der ROI-Manager, um die Position des ROI aufzuzeichnen. Klicken Sie auf ROI-Manager > Messen, um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität jeder Region aufzuzeichnen, die für jeden Frame des Videos ausgewählt wurde.
   3. Verschieben Sie das Feld in die Zentren anderer Körpersegmente von Interesse und klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen (t), um ihre Positionen aufzuzeichnen. Dadurch werden Regionen gleicher Größe in allen zu analysierenden Körpersegmenten angezeigt. Wählen Sie mindestens ein posterior, ein mediale und ein vorderes Segment aus, z. B. A7, A4 und T2.
   4. Wählen Sie im ROI-Manager alle Bereiche aus, die als Slice-Number-y-Koordinaten-x-Koordinate aufgezeichnet sind (z. B. durch Auswahl von Strg)und klicken Sie auf Mehr > Multi-Messung, um den mittleren Fluoreszenzwert zu messen. Intensität jeder Region, die für alle Frames des Videos von Interesse ist, und melden Sie jede Messung in einer Tabelle. Jeder Bereich von Interesse ist eine Spalte der Tabelle, und jeder Frame ist eine Zeile. Übertragen Sie die Tabelle für weitere Analysen in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
   5. Zeichnen Sie ein Diagramm mit Rahmenzahl auf der x-Achse und mittlerer Fluoreszenzintensität auf der y-Achse. Die Bildnummer kann mithilfe der Bildrate (4 Frames/s) des Videos in die Zeit konvertiert werden (Abbildung 1A).
   6. Bestimmen Sie die Amplitude der Muskelkontraktion, indem Sie den Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität relativ zur Basislinie schätzen. Muskelkontraktionen erhöhen die GFP-Intensität, da sie mehr GFP in die Nähe des Brennbereichs bringen, da mehr Muskeln während dieser Kontraktionen eingezogen werden (Film 1)⁷. Legen Sie eine Basisfluoreszenz als durchschnittliche Intensität zwischen Kontraktionswellen fest. Normalisieren Sie die GFP-Intensität auf die Basislinie, indem Sie jeden ROI-Intensitätswert durch die Basisintensität dividieren.
      HINWEIS: Jedes Profil hat eine unterschiedliche Ausgangsfluoreszenz, da es unterschiedliche Expressionsebenen in verschiedenen Muskelsegmenten geben kann.
      HINWEIS: Eine mögliche Komplikation ist, dass sich die GFP-Fluoreszenz im Laufe der Zeit aufgrund von Fotobleichungen ändern kann. Dies kann durch die Überwachung von Veränderungen der Fluoreszenz-Baseline und die Verwendung einer ausreichenden Stichprobengröße für Wellenanalysen behoben werden (wir verwenden normalerweise Sätze von 10 fluoreszierenden Wellen und bestätigen, dass die Basislinie ungefähr konstant ist, indem wir einen Durchschnitt nur dieser Spitzenwerte einnehmen. Minima als Ausgangswert, die in der Fluoreszenz um 10% oder weniger im Vergleich zum ursprünglichen Minima-Peak gesunken sind). Eine Puls-LED-Beleuchtung kann auch angewendet werden, um dieses Problem zu mildern¹⁶.
   7. Vergleichen Sie Muskelkontraktionen auf der linken und rechten Seite des Embryos, indem Sie Spitzenintensitäten auf beiden Seiten des Embryos für gleiche Segmente analysieren. Verwenden Sie Kontraktionsamplitude und Zeit der Spitzenintensitäten, um Unterschiede in Umfang und Timing der peristaltischen Muskelkontraktionswellen zu untersuchen, die sich auf beiden Seiten des Embryos ausbreiten.
   8. Vergleichen Sie die normalisierte Intensität des GFP in verschiedenen Segmenten (z. B. an vorderen, medialen und hinteren Regionen) während der Muskelkontraktionswellenausbreitung, um Veränderungen der Kontraktion zu untersuchen, wenn sich die Welle ausbreitet. Diese Analyse bestimmt auch die Richtung der Welle (d.h. ob sie sich in Richtung vorderer oder hinterer Regionen des Embryos ausbreitet).

Ergebnisse

Normale peristaltische Muskelkontraktionen werden in einem WT (Wildtyp, Canton-S) Embryo in Film 1gezeigt. Die durchschnittliche Häufigkeit peristaltischer Wellen von Muskelkontraktionen lag in unserer Analyse bei 47 Kontraktionen pro Stunde und die durchschnittliche Amplitude lag bei WT-Embryonen um 60 % über dem Ausgangswert. Embryo-Rollen wird für einen WT-Embryo in Film 2 gezeigt, wobei der weiße Pfeil die Anfangsposition einer Luftröhre und einen schwarzen Pfeil marki...

Diskussion

Unsere Methode bietet eine quantitative Möglichkeit, wichtige Embryo-Verhalten während der Entwicklung zu analysieren, wie peristaltische Muskelkontraktionswellen, einschließlich Wellenperiodizität, Amplitude und Muster, sowie Wellenwirkung auf Embryo-Rollen und Haltung. Dies kann bei Analysen verschiedener Mutanten nützlich sein, um die Rolle bestimmter Gene bei der Regulierung dieser und anderer Verhaltensweisen während der embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Wir haben Veränderungen in der muskelspezifischen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0	C13440-20CU	With different emission filters
Forceps	FST Dumont	11254-20	Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm
LED	X-cite BDX (Excelitas)	XLED1
Microscope	Carl Ziess Examiner D1	491405-0005-000	Epiflourescence with time lapse
Needle	BD	305767	25 G x 1-1/2 inch
Paintbrush	Contemporary crafts		Any paintbrush will work
Petri dishes	VWR	25384-164	60 mm x 15 mm
Software	HCImage Live
Thread Zap Wax pen	Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)	TZ1300	Burner Tool
Tricorner plastic beaker	VWR	25384-152	100 mL