Generación rápida de cultivos primarios de melanocitos muritonos y fibroblastos

Resumen

Este protocolo describe un método rápido para generar simultáneamente cultivos de melanocitos y fibroblastos a partir de la piel de ratones de 0-4 días de edad. Estos cultivos primarios pueden ser mantenidos y manipulados in vitro para estudiar una variedad de procesos fisiológicamente relevantes, incluyendo biología celular de la piel, pigmentación, cicatrización de heridas y melanoma.

Resumen

Los defectos en la función de fibroblastos o melanocitos se asocian con enfermedades de la piel, incluyendo la función de barrera deficiente, cicatrización de heridas defectuosas, defectos de pigmentación y cáncer. Vital para la comprensión y la mejora de estas enfermedades son experimentos en cultivos primarios de fibroblastos y melanocitos. Sin embargo, los protocolos actuales para el aislamiento de melanocitos requieren que las capas epidérmicas y dérmicas de la piel se trippsinizan y se desvinculen manualmente. Este proceso consume mucho tiempo, técnicamente desafiante y contribuye a rendimientos inconsistentes. Además, los métodos para generar simultáneamente cultivos de fibroblastos puros a partir de la misma muestra de tejido no están fácilmente disponibles. Aquí, describimos un protocolo mejorado para aislar melanocitos y fibroblastos de la piel de los ratones en los días postnatales 0-4. En este protocolo, toda la piel se homogeneiza mecánicamente usando un helicóptero de tejido y luego se digiere brevemente con colagenasa y trippsina. Las poblaciones celulares se aíslan a través de un revestimiento selectivo seguido del tratamiento con G418. Este procedimiento da como resultado rendimientos constantes de melanocitos y fibroblastos de un solo ratón en menos de 90 minutos. Este protocolo también es fácilmente escalable, lo que permite a los investigadores procesar grandes cohortes de animales sin un aumento significativo en el tiempo de práctica. Mostramos a través de evaluaciones citométricas de flujo que los cultivos establecidos con este protocolo están altamente enriquecidos para melanocitos o fibroblastos.

Introducción

La piel de mamífero es un órgano multicapa que protege el cuerpo de patógenos extraños e irradiación ultravioleta (UVR). La piel también juega un papel crítico en los procesos homeostáticos como la cicatrización de heridas, la regulación de la temperatura y la producción de vitamina D^1,2,3. La piel de mamífero consta de tres tipos principales de células: melanocitos, fibroblastos y queratinocitos. Estos tipos celulares pueblan diferentes capas de la piel, con queratinocitos que componen la epidermis, fibroblastos que residen en la dermis ymelanocitos localizando a la unión epidérmica-dérmica y folículos pilosos 4. Aquí, detallamos un procedimiento simple que permite la generación simultánea de cultivos primarios de melanocitos y fibroblastos a partir de la piel murina.

Los melanocitos son células productoras de pigmentos que se encuentran en muchos lugares del cuerpo humano,incluyendo la epidermis basal, iris, cócleara, cerebro y folículos pilosos 5. La función principal de los melanocitos es generar y secretar vesículas que contienen melanina llamadas melanosomas^5,6. Los melanosomas contienen dos clases principales de melanina: eumelanina marrón/negra y feomelanina amarilla/roja^6,7. Los procesos bioquímicos dentro del melancito regulan la abundancia relativa de cadaespecie de melanina y ayudan a determinar el cabello, la piel y los ojos de color 8,^9. La melanina también sirve para absorber la UVR y proteger los tejidos expuestos al sol de la mutagénesis^10.

La disfunción del melanocitos puede causar defectos pigmentarios y aumentar la susceptibilidad al cáncer de piel. Por ejemplo, los parches de piel hiperpigmentados característicos del melasma son el resultado de la sobreproducción focal de melanina, mientras que las mutaciones genéticas germinales que comprometen los genes implicados en la síntesis de melanina conducen al albinismo^11,12 . Se requiere un conocimiento íntimo de la biología de los melanocitos para desarrollar estrategias que corrijan tales defectos pigmentarios y, en última instancia, mejoren el bienestar psicosocial de las personas afectadas por estas enfermedades. Déficits en la producción de melanina y / o la síntesis preferencial de feomelanina también se asocian con el aumento del riesgo de cáncer de piel¹⁰. Se cree que este riesgo es el resultado de una reducción de la protección UVR^6,13. Por lo tanto, métodos para mejorar o restaurar la producción de eumelanina en melanocitos pueden reducir la incidencia de cáncer de piel en estas poblaciones.

Los fibroblastos mesenquimales establecen el tejido conectivo y el soporte estructural para todos los órganos del cuerpo, incluida la capa dérmica de la piel^14. La excreción de proteínas como el colágeno, la elastina, laminina y fibronectina permiten que losfibroblastos formen la matriz extracelular (ECM) que es esencial para la integridad del tejido 1,¹⁴. Los fibroblastos también desempeñan un papel esencial en procesos como la cicatrización de heridas, inflamación, angiogénesis y formación/progresión del cáncer^1,15,16.

Al igual que los melanocitos, los defectos en la activación y función de los fibroblastos pueden promover la tumorigenesis y la enfermedad. Por ejemplo, la activación inadecuada de fibroblastos comúnmente conduce a la formación de fibrosis, como resultado de la mayor deposición de componentes de ECM en exceso en el tejido circundante. Como los fibroblastos mantienen gran parte de la integridad estructural del cuerpo, la fibrosis promueve enfermedades que afectan a numerosos tejidos y órganos, incluyendo fibrosis pulmonar idiopática, esclerosis sistémica, cirrosis hepática y fibrosis cardíaca^15. Los fibroblastos también desempeñan un papel crítico en el cáncer^16. Los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) son las células no malignas más abundantes en el microambiente de muchos tumores. Se ha demostrado que los CAF promueven la proliferación tumoral, la progresión y la resistencia terapéutica mediante la modulación de la rigidez tisular, la producción local de citoquinas y la función inmune¹⁶.

Los cultivos celulares primarios proporcionan a los investigadores modelos genéticamente manejables para identificar y mitigar los defectos de melanocitos y fibroblastos que conducen a la enfermedad. Sin embargo, los métodos actuales para establecer cultivos de melanocitos consumen mucho tiempo y son técnicamente desafiantes. La necesidad de tripinización y separación delicada de la epidermis y la dermis contribuye a la variabilidad en el rendimiento experimental y dificulta la realización de experimentos a gran escala. Además, actualmente faltan protocolos para aislar simultáneamente melanocitos y fibroblastos de toda la piel en el campo.

Hemos desarrollado un método para reducir los pasos de procesamiento, la variabilidad y el tiempo necesario para establecer cultivos de melanocitos y fibroblastos a partir de la misma muestra de piel entera. Utilizando un método de homogeneización mecánica seguido de una breve digestión, nuestra estrategia disminuye significativamente la cantidad de tiempo práctico necesario para aislar los melanocitos primarios al tiempo que permite el aislamiento simultáneo de fibroblastos. El aumento de la velocidad, eficiencia y consistencia de este protocolo, en combinación con la capacidad de aislar melanocitos de ratones de 0-4 días de edad, proporciona a los investigadores la flexibilidad para realizar una gama más amplia de experimentos de lo que antes era posible.

Protocolo

Obtenga la aprobación de su comité institucional de ética animal antes de empezar este o cualquier otro estudio que involucre animales. Los experimentos realizados en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus #2012A00000134).

1. Preparación del protocolo

NOTA: Las siguientes instrucciones de preparación de reactivos son adecuadas para la generación de cultivos de 9 cm² de melanocitos y fibroblastos a partir de un solo ratón. Consulte la guía de preparación de reactivos de la Tabla 1 para obtener aislamientos a mayor escala.

1. Preparar 1,5 ml de solución de colágeno que contenga colágeno de 50 g/ml en ácido acético glacial de 0,1 M.
2. En un armario de flujo laminar, cubra un pozo de un plato de cultivo celular de 6 pozos con solución de colágeno de 8 g/cm² (1,44 ml). Asegúrese de que el pozo esté completamente cubierto por la solución de colágeno. Incubar el plato a 37oC durante 3 h o a 4oC durante la noche. Antes de su uso, lave bien el colágeno recubierto dos veces con 1,35 ml de solución salinatamponada con fosfato estéril (PBS) (150 ol de PBS por 1 cm 2).
3. Montar el helicóptero de tejido en un gabinete de flujo laminar colocando cuidadosamente un disco de corte en la plataforma del helicóptero de tejido y asegurando una hoja estéril al brazo móvil.
4. Preparar 3 ml de 1 x solución antibiótica/antimicótica diluyendo 100x solución de stock antibiótico/antimicótico en PBS estéril.
5. Preparar 3 ml de tampón fresco de digestión de la piel que contenga 10% de suero bovino fetal, 1% solución de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 10 mg/ml de colagenasa tipo I, 0,25% de trippsina porcina y 0,02 mg/ml desoxirribonucleasa I en RPMI 1640.
6. Preparar 6 ml de medios frescos de melanocitos que contengan 10% de suero bovino fetal, 7% de suero de caballo, 1% solución de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 0,5 mM de toxina cíclica de 0,5 mM (dbcAMP), 20 nM de tetradecanoylphorbol 13-acetato (TPA) y 200 pM de toxina de cólera (CT) Nutrient Mix F-12 Ham's media.
   NOTA: Las soluciones concentradas de dbcAMP, TPA y CT se pueden hacer, alícset y almacenar durante >1 año a -80 oC. Los medios base que carezcan de estos componentes se pueden almacenar durante un máximo de 1 mes a 4 oC.
7. Preparar 4 ml de medios fibroblastos que contengan 10% de suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina y 1% L-glutamina en el medio de águila modificado de Dulbecco. Este soporte se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes.
8. Preparar 40 ml de 4% de solución de paraformaldehyde diluyendo 16% paraformaldehyde en PBS. Almacene cualquier exceso a 4 oC durante 1 mes o -20 oC durante un máximo de 1 año.
9. Preparar una solución de stock de saponina al 1% mezclando 0,5 g de saponina en 50 ml de PBS a 37oC hasta que la saponina se haya disuelto por completo. Esterilice la solución para su almacenamiento a largo plazo utilizando una jeringa de 50 ml equipada con un filtro PES de 0,2 m. La solución de stock de saponina resultante se puede mantener a 4 oC durante 1 mes.
10. Preparar 200 ml de solución de saponina al 0,1% por ratón diluyendo un 1% de solución de saponina en PBS que contiene 3% de albúmina sérica bovina (BSA).
11. Preparar 1 ml de solución de viabilidad diluyendo 1 l de tinte de viabilidad fijable en 1 ml de PBS.

2. Aislamiento de melanocitos y fibroblastos

1. Eutanasia cachorros C57Bl/6J de 0 a 4 días de edad por decapitación y elimina las extremidades de los ratones eutanasiados usando tijeras quirúrgicas.
2. En un armario de flujo laminar, enrolle brevemente el tronco de cada ratón en una placa estéril de Petri que contenga 70% de etanol. Retire el tronco del etanol y colóquelo en un plato de Petri vacío y estéril.
3. Usando tijeras quirúrgicas, esterilizadas en 70% etanol, hacer una incisión en la piel en el lado ventral del tronco comenzando desde el cuello hasta la cola. Pelar la piel del tronco del ratón usando fórceps estériles.
4. Coloque la dermis de la piel hacia abajo en un plato de 6 pozos que contenga 3 ml de 1 x solución antibiótica/antimicótica e incubar a temperatura ambiente durante 2-3 min.
5. Encienda el helicóptero de tejido con los siguientes ajustes en su lugar: Grosor de la rebanada: 1 m; Fuerza de la hoja: 60% del máximo; Velocidad: 50% del máximo.
6. Transfiera la piel, la dermis hacia abajo, a un disco de helicóptero de tejido estéril y pase la piel completamente a través del helicóptero de tejido activado 3 veces.
7. Transfiera la piel homogeneizada a un tubo cónico estéril de 15 ml que contenga 3 ml de tampón de digestión de la piel. Mezcle la suspensión resultante pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces con un micropipeta P1000.
8. Tapar el tubo cónico e incubar la muestra en un baño de agua de 37 oC durante 15 minutos, invirtiendo el tubo cada 3-5 min.
9. Reventar las células de la piel homogeneizar centrifugando el tubo cónico en un rotor de cubo oscilante a 750 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
10. Usando una micropipeta P1000, retire lenta y completamente el búfer de digestión de la piel teniendo cuidado de no molestar el pellet.
    NOTA: Una porción de piel entera se puede guardar en esta etapa y se utiliza como un control para Paso 3: Confirmación de pureza celular. Colar estas células a través de un colador de células de 70 m y luego comenzar en el paso 3.5 para su posterior procesamiento.
11. Resuspenda completamente el pellet celular en 1 ml de melanocitos Media pipeteando 15-20 veces con una micropipeta P1000. Agregue la solución celular resultante en forma de gota a un pozo sin recubrimiento de un plato de 6 pozos que contenga 1 ml de medios de melanocitos.
12. Colocar el homogeneato de la piel chapada en una incubadora de cultivodeta tisular a 37oC y 5% de_CO2. Permita que las culturas incuban durante 40 min.
    NOTA: Durante este tiempo, algunos fibroblastos en el homogeneizado de la piel se adhieren al plato sin recubrimiento, mientras que los melanocitos y queratinocitos permanecen en suspensión.
13. Transfiera el sobrenadante de cultivo del plato sin recubrimiento a un pozo de un plato de 6 pozos prelavado y recubierto de colágeno. Añadir G418 a los medios de comunicación de tal forma que la concentración final sea de 100 ng/ml.
14. Agregue 2 ml de medios de fibroblastos a un pozo del plato sin recubrimiento, que ahora contiene fibroblastos adherentes.
15. Incubar ambos cultivos durante la noche en una incubadora decultivos tisulares situada a 37oC y 5% de CO2.
16. Aspirar por separado los medios y los restos de cada cultivo, 16-24 h después del enchapado. Lave cada plato dos veces con 1 ml de PBS estéril, y luego agregue 2 ml de medios de melanocitos frescos más 100 ng/ml G418 al cultivo de melanocitos y 2 ml de medios de fibroblastos frescos al cultivo de fibroblastos.
17. Después de que los cultivos de melanocitos hayan sido tratados con G418 durante 48 h, lave las células dos veces con 1 ml de PBS estéril y agregue 2 ml de medios de melanocitos frescos sin G418 al cultivo.
    NOTA: A medida que los fibroblastos en el cultivo de melanocitos continúen muriendo en el tratamiento post-G418, lave el plato con PBS estéril para eliminar las células muertas y agregue medios de melanocitos frescos. Los cultivos de melanocitos y fibroblastos deben ser repasos cuando alcanzan una confluencia del 70-80%.

3. Confirmación de pureza celular

1. Aspirar los medios de cada cultivo y lavar cuidadosamente cada plato con 1 ml de PBS estéril.
2. Añadir 0,7 ml de 0,25% de trippsina a cada cultivo e incubar las culturas en trippsina a 37oC y 5% de CO2 durante 1 min.
3. Desaloje las células pipeteando la trippsina contra la parte inferior del plato usando un micropipeta P1000.
4. Añadir 0,7 ml del medio adecuado a cada cultivo trippsinizado y transferir la solución celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Reventar las células por centrifugación a 750 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con un micropita P1000.
   NOTA: Los pasos 3.1-3.5 se pueden utilizar para el paso de cultivos de melanocitos y fibroblastos. El pellet resultante debe ser resuspendido en el medio apropiado y colocado en un plato nuevo, sin recubrimiento (fibroblastos) o prelavado, recubierto de colágeno (melanocitos).
6. Resuspenda el pellet celular en 0,5 ml de PBS helado.
7. Enumere y transfiera 0,5 millones de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenfriado.
8. Repita el paso 3.5 y luego resuspenda las celdas en 100 s de solución de viabilidad. Incubar la suspensión celular durante 30 min a 4oC en la oscuridad.
9. Repita los pasos 3.5-3.6 dos veces.
10. Repita el paso 3.5, luego fije las células resuponiendo el pellet en 100 sL de hielo frío 4% Paraformaldehído Solución. Incubar la suspensión durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
11. Repita el paso 3.5 dos veces, cada vez que vuelva a depender del pellet en 0,5 ml de 3% de BSA en 1x PBS.
12. Repita el paso 3.5 y, a continuación, vuelva a suspender el gránulo celular en 100 ml de solución de saponina al 0,1%. Incubar la suspensión durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
13. Repita el paso 3.5, luego resuspenda el pellet celular en 100 éL de Solución de Saponina al 0,1% que contenga 0,5 g de anticuerpo anti-gp100 de conejo, 0,5 g de anticuerpo de proteína específica de fibroblasto de conejo 1 (FSP1) y 0,025 g de anticuerpo anti-cytoqueratina de ratón 14 (K14). Incubar la suspensión durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    NOTA: Mientras que el anticuerpo K14 fue comprado pre-conjugado a Alexa Fluor 647, los anticuerpos gp100 y FSP1 fueron conjugados a CF 555 y CF 488, respectivamente. La tinción de las poblaciones de control también debe comenzar en este paso. Las poblaciones de células de control deben aislarse del cultivo y procesarse como se describe en los pasos 3.5-3.12.
14. Repita el paso 3.11 dos veces para eliminar cualquier anticuerpo no unido.
15. Repita el paso 3.5, luego resuspenda el pellet celular en 200-400 l de 3% de BSA en 1x PBS.
16. Pase la solución celular a través de un colador de células de 40 m en un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml y analice las células tensadas por citometría de flujo.

Resultados

Los ratones C57Bl/6J machos y hembras fueron eutanasiados en los días postnatales 0-4 y la piel truncal fue sometida a disociación mecánica como se describió anteriormente. Después de cortar, la piel formó una suspensión viscosa carente de cualquier signo de tejido estructural. La centrifugación de esta suspensión dio lugar a la formación de un gran pellet celular en la parte inferior del tubo cónico y una capa de adiposo flotando en la parte superior del sobrenadante. Esta capa adiposa se desectó con el sobr...

Discusión

El cultivo in vitro de melanocitos primarios y fibroblastos ha llevado a avances significativos en nuestra comprensión de la biología y la enfermedad de la piel. Este protocolo mejora los métodos previos de aislamiento de melanocitos al reducir el tiempo y los conocimientos técnicos necesarios para generar cultivos de melanocitos consistentes, al tiempo que permite el aislamiento simultáneo de fibroblastos cutáneos. Un elemento novedoso que ahorra tiempo de este procedimiento es que la dermis y la epidermis no nece...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100