Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.

Zusammenfassung

Defekte in der Fibroblasten- oder Melanozytenfunktion sind mit Hautkrankheiten verbunden, einschließlich schlechter Barrierefunktion, defekter Wundheilung, Pigmentierungsdefekten und Krebs. Entscheidend für das Verständnis und die Verbesserung dieser Krankheiten sind Experimente in primären Fibroblasten- und Melanozytenkulturen. Dennoch erfordern aktuelle Protokolle zur Melanozytenisolation, dass die epidermalen und dermalen Hautschichten trypsinisiert und manuell getrennt werden. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, technisch anspruchsvoll und trägt zu inkonsistenten Erträgen bei. Darüber hinaus sind Methoden zur gleichzeitigen Erzeugung reiner Fibroblastenkulturen aus derselben Gewebeprobe nicht ohne weiteres verfügbar. Hier beschreiben wir ein verbessertes Protokoll zur Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus der Haut von Mäusen an postnatalen Tagen 0-4. In diesem Protokoll wird die gesamte Haut mit einem Gewebehäcksler mechanisch homogenisiert und dann kurz mit Kollagenase und Trypsin verdaut. Die Zellpopulationen werden dann durch selektive Beschichtung isoliert, gefolgt von der Behandlung durch G418. Dieses Verfahren führt zu konsistenten Melanozyten- und Fibroblastenausbeuten einer einzelnen Maus in weniger als 90 min. Dieses Protokoll ist auch leicht skalierbar, so dass Forscher große Kohorten von Tieren ohne signifikante Erhöhung der Hands-on-Zeit verarbeiten können. Wir zeigen durch zytometrische Fließbewertungen, dass Kulturen, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, stark für Melanozyten oder Fibroblasten angereichert sind.

Einleitung

Säugetierhaut ist ein mehrschichtiges Organ, das den Körper vor fremden Krankheitserregern und ultravioletter Bestrahlung (UVR) schützt. Die Haut spielt auch eine entscheidende Rolle bei panostatischen Prozessen wie Wundheilung, Temperaturregulierung und Vitamin-D-Produktion^1,2,3. Säugetierhaut besteht aus drei Hauptzelltypen: Melanozyten, Fibroblasten und Keratinozyten. Diese Zelltypen bevölkern verschiedene Hautschichten, wobei Keratinozyten die Epidermis, Fibroblasten in der Dermis und Melanozyten, die sich an die epidermal-dermalische Kreuzung und Haarfollikel localisieren, und Haarfollikel⁴. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren, das die gleichzeitige Erzeugung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus muriner Haut ermöglicht.

Melanozyten sind pigmentproduzierende Zellen, die an vielen Orten im gesamten menschlichen Körper gefunden werden, einschließlich der Basalepidermis, Iris, Cochlea, Gehirn und Haarfollikel⁵. Die primäre Funktion von Melanozyten ist es, Melanin-haltige Vesikel zu erzeugen und abzusondern, die Melanosomen genannt werden^5,6. Melanosomen enthalten zwei Hauptklassen von Melanin: braun/schwarz Eumelanin und gelb/rot Pheomelanin^6,7. Biochemische Prozesse innerhalb der Melanozyten regulieren die relative Fülle jeder Melanin-Art und helfen, Haar, Haut und Augenfarbe zu bestimmen^8,9. Melanin dient auch dazu, UVR zu absorbieren und sonnenexponierte gewebe vor Mutagenese¹⁰zu schützen.

Melanozytenfunktionsstörungen können pigmentäre Defekte verursachen und die Anfälligkeit für Hautkrebs erhöhen. Zum Beispiel sind die für Melasma charakteristischen hyperpigmentierten Hautflecken das Ergebnis einer fokalen Melanin-Überproduktion, während genetische Mutationen aus keimlinen, die Die an der Melaninsynthese beteiligten Gene gefährden, zu Albinismus führen^11,12 . Intime Kenntnisse der Melanozytenbiologie sind erforderlich, um Strategien zu entwickeln, die solche pigmentären Defekte korrigieren und letztlich das psychosoziale Wohlbefinden von Personen verbessern, die von diesen Krankheiten betroffen sind. Defizite in der Melaninproduktion und/oder die bevorzugte Synthese von Phäomelanin sind auch mit einem erhöhten Hautkrebsrisiko¹⁰verbunden. Dieses Risiko wird angenommen, dass durch reduzierten UVR-Schutz^6,13. So, Methoden zur Verbesserung oder Wiederherstellung der Eumelanin-Produktion in Melanozyten können die Inzidenz von Hautkrebs in diesen Populationen zu reduzieren.

Mesenchymale Fibroblasten etablieren das Bindegewebe und die strukturelle Unterstützung für alle Organe des Körpers, einschließlich der dermalen Schicht der Haut¹⁴. Die Ausscheidung von Proteinen wie Kollagen, Elastin, Laminin und Fibronectin ermöglicht Fibroblasten, die extrazelluläre Matrix (ECM) zu bilden, die für die Gewebeintegrität unerlässlich ist^1,14. Fibroblasten spielen auch eine wesentliche Rolle in Prozessen wie Wundheilung, Entzündung, Angiogenese und Krebsbildung/Progression^1,15,16.

Ähnlich wie bei Melanozyten können Defekte bei der Fibroblastenaktivierung und -funktion Die Tumorgenese und Krankheit fördern. Beispielsweise führt eine unangemessene Fibroblastenaktivierung häufig zur Bildung von Fibrose, die sich aus der verstärkten Ablagerung überschüssiger ECM-Komponenten in das umgebende Gewebe ergibt. Da Fibroblasten einen Großteil der strukturellen Integrität des Körpers erhalten, fördert Fibrose Krankheiten, die zahlreiche Gewebe und Organe betreffen, einschließlich idiopathischer Lungenfibrose, systemischer Sklerose, Leberzirrhose und Herzfibrose¹⁵. Fibroblasten spielen auch eine entscheidende Rolle bei Krebs¹⁶. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sind die am häufigsten vorkommenden nicht-bösartigen Zellen in der Mikroumgebung vieler Tumoren. CAFs haben gezeigt, dass Tumorproliferation, Progression und therapeutische Resistenz durch modulationende Gewebesteifigkeit, lokale Zytokinproduktion und Immunfunktion¹⁶zu fördern.

Primäre Zellkulturen bieten Forschern genetisch bewegliche Modelle, um Melanozyten- und Fibroblastendefekte, die zu Krankheiten führen, zu identifizieren und zu mildern. Die derzeitigen Methoden zur Etablierung von Melanozytenkulturen sind jedoch zeitaufwändig und technisch anspruchsvoll. Die Notwendigkeit einer Trypsinisierung und einer delikaten Trennung von Epidermis und Dermis trägt zur Variabilität der experimentellen Ausbeute bei und erschwert die Durchführung groß angelegter Experimente. Darüber hinaus fehlen derzeit Protokolle zur gleichzeitigen Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus der gesamten Haut auf dem Feld.

Wir haben eine Methode entwickelt, um die Verarbeitungsschritte, die Variabilität und den Zeitaufwand für die Herstellung von Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus derselben gesamten Hautprobe zu reduzieren. Mit einer mechanischen Homogenisierungsmethode, gefolgt von einer kurzen Verdauung, verringert unsere Strategie die Menge an hands-on-Zeit, die erforderlich ist, um primäre Melanozyten zu isolieren, während gleichzeitige Fibroblastenisolation ermöglicht wird. Die erhöhte Geschwindigkeit, Effizienz und Konsistenz dieses Protokolls in Kombination mit der Fähigkeit, Melanozyten von 0-4 Tage alten Mäusen zu isolieren, bietet Forschern die Flexibilität, eine breitere Palette von Experimenten durchzuführen, als bisher möglich.

Protokoll

Erhalten Sie die Genehmigung Ihrer institutionellen Tierethikkommission, bevor Sie mit dieser oder einer anderen Studie mit Tieren in Sendepolitik verfahren. Die in diesem Protokoll durchgeführten Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Protokoll #2012A00000134) der Ohio State University genehmigt.

1. Protokollvorbereitung

HINWEIS: Die folgenden Reagenzpräparationsanweisungen sind für die Erzeugung von 9 cm² Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus einer Maus geeignet. Siehe die Reagenzvorbereitungsanleitung in Tabelle 1 für größere Isolationen.

1. Bereiten Sie 1,5 ml Kollagenlösung vor, die 50 g/ml Kollagen in 0,1 M Eisessigsäure enthält.
2. In einem laminaren Strömungsschrank einen Brunnen einer 6-Well-Zellkulturschale mit 8 g/cm² (1,44 ml) Kollagenlösung beschichten. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen vollständig von der Collagen-Lösung abgedeckt ist. Die Schale bei 37 °C für 3 h oder bei 4 °C über Nacht inkubieren. Vor der Verwendung den kollagenbeschichteten Brunnen zweimal mit 1,35 ml steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS) (150 l PBS pro 1 cm²⁾waschen.
3. Montieren Sie den Tissue-Chopper in einem laminaren Strömungsschrank, indem Sie sorgfältig eine Schneidescheibe auf die Tissue-Chopper-Plattform legen und eine sterile Klinge am beweglichen Arm sichern.
4. Bereiten Sie 3 ml 1x Antibiotikum/Antimykotische Lösung durch Verdünnung 100x Antibiotikum/Antimykotische Lagerlösung in sterilem PBS vor.
5. Bereiten Sie 3 ml frischen Hautverdauungspuffer mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung, 1% L-Glutamin, 10 mg/ml Kollagennase Typ I, 0,25% Schweinetrypsin und 0,02 mg/ml Desoxyribonuclease I in RPMI 1640 vor.
6. Bereiten Sie 6 ml frische Melanozytenmedien vor, die 10% fetales Rinderserum, 7% Pferdeserum, 1% Penicillin/Streptomycinlösung, 1% L-Glutamin, 0,5 mM Di-Butyryl-zyklisches AMP (dbcAMP), 20 nM Tetradecanoylphorbol 13-Acetat (TPA) und 200 pM Choleratoxin (CT) enthalten Nutrient Mix F-12 Schinken Medien.
   HINWEIS: Konzentrierte dbcAMP-, TPA- und CT-Lagerlösungen können hergestellt, aliquoted und für >1 Jahr bei -80 °C gelagert werden. Basismedien ohne diese Komponenten können bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
7. Bereiten Sie 4 ml Fibroblastenmedien vor, die 10% fetales Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium enthalten. Dieses Medium kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
8. Bereiten Sie 40 ml 4% Paraformaldehydlösung vor, indem Sie 16% Paraformaldehyd in PBS verdünnen. Lagern Sie einen Überschuss bei 4 °C für 1 Monat oder -20 °C für bis zu 1 Jahr.
9. Bereiten Sie eine 1% Saponin-Lagerlösung vor, indem Sie 0,5 g Saponin in 50 ml PBS bei 37 °C mischen, bis sich das Saponin vollständig aufgelöst hat. Sterilisieren Sie die Lösung für die Langzeitlagerung mit einer 50 ml Spritze, die mit einem 0,2 m PES-Filter ausgestattet ist. Die resultierende Saponin-Lagerlösung kann 1 Monat lang bei 4 °C aufbewahrt werden.
10. Bereiten Sie 200 l 0,1% Saponin-Lösung pro Maus vor, indem Sie 1% Saponin-Stammlösung in PBS verdünnen, die 3% Rinderserumalbumin (BSA) enthält.
11. Bereiten Sie 1 ml Viability Solution vor, indem Sie 1 l fixierbaren Isse-Farbstoff in 1 ml PBS verdünnen.

2. Melanozyten- und Fibroblastenisolierung

1. Euthanisieren Sie 0 bis 4 Tage alte männliche und/oder weibliche C57Bl/6J Welpen durch Enthauptung und entfernen Sie Extremitäten von den eingeschläferten Mäusen mit chirurgischer Schere.
2. In einem laminaren Fließschrank den Kofferraum jeder Maus kurz in einer sterilen Petrischale mit 70% Ethanol rollen. Entfernen Sie den Stamm aus dem Ethanol und legen Sie ihn in eine leere, sterile Petrischale.
3. Mit chirurgischen Scheren, sterilisiert in 70% Ethanol, machen einen Schnitt in der Haut auf der ventralen Seite des Rumpfes von hals bis zum Schwanz. Schälen Sie die Haut aus dem Rumpf der Maus mit sterilen Zangen.
4. Legen Sie die Haut dermis Seite nach unten in eine 6-Well-Schale mit 3 ml 1x Antimykotische Lösung und inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 min.
5. Schalten Sie den Gewebe-Chopper mit den folgenden Einstellungen ein: Scheibendicke: 1 m; Klingenkraft: 60 % des Maximums; Geschwindigkeit: 50 % des Maximums.
6. Übertragen Sie die Haut, Dermis Seite nach unten, auf eine sterile Gewebe-Chopper-Scheibe und passieren Sie die Haut vollständig durch den aktivierten Gewebe-Chopper 3 mal.
7. Übertragen Sie die homogenisierte Haut in ein steriles, 15 ml konisches Rohr mit 3 ml Hautverdauungspuffer. Mischen Sie die resultierende Suspension, indem Sie 10-15 Mal mit einer P1000-Mikropipette nach oben und unten pfeifen.
8. Kappen Sie das konische Rohr und inkubieren Sie die Probe in einem 37 °C Wasserbad für 15 min, invertieren Sie das Rohr alle 3-5 min.
9. Pellet die Zellen in der Haut homogenisieren durch Zentrifugieren des konischen Rohres in einem schwingenden Schaufelrotor bei 750 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
10. Mit einer P1000 Mikropipette, langsam und vollständig entfernen Sie die Haut Verdauung Puffer darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
    HINWEIS: Ein Teil der gesamten Haut kann in diesem Stadium gespeichert und als Kontrolle für Schritt 3: Bestätigung der Zellreinheit verwendet werden. Dehnen Sie diese Zellen durch ein 70 m Zellsieb und beginnen Sie dann bei Schritt 3.5 für die Weiterverarbeitung.
11. Das Zellpellet in 1 ml Melanozyten-Medien gründlich wieder aufhängen, indem es 15-20 Mal mit einer P1000-Mikropipette nach oben und unten pipet. Fügen Sie die resultierende Zelllösung tropfenweise in einen unbeschichteten Brunnen einer 6-Well-Schale mit 1 ml Melanozyten-Medien.
12. Legen Sie die beschichtete Haut homogenat in einem Gewebekultur-Inkubator auf 37 °C und 5% CO2_eingestellt. Lassen Sie die Kulturen für 40 min brüten.
    HINWEIS: Während dieser Zeit haften einige Fibroblasten in der Haut homogenat an der unbeschichteten Schale, während die Melanozyten und Keratinozyten in Suspension bleiben.
13. Übertragen Sie den Kulturüberstand von der unbeschichteten Schale auf einen Brunnen einer vorgewaschenen, mit Kollagen beschichteten 6-Well-Schale. Fügen Sie G418 zu den Medien hinzu, so dass die endgültige Konzentration 100 ng/ml beträgt.
14. Fügen Sie 2 ml Fibroblasten-Medien in einen Brunnen der unbeschichteten Schale, die jetzt anhaftende Fibroblasten enthält.
15. Inkubieren Sie beide Kulturen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator, der bei 37 °C und 5%_CO2eingestellt ist.
16. Separat die Medien und alle Trümmer aus jeder Kultur, 16-24 h nach der Beschichtung. Waschen Sie jedes Gericht zweimal mit 1 ml sterilem PBS, und fügen Sie dann 2 ml frischemelanozyte Medien plus 100 ng/mL G418 in die Melanozytenkultur und 2 ml frisches Fibroblastenmedium zur Fibroblastenkultur hinzu.
17. Nachdem die Melanozytenkulturen 48 h lang mit G418 behandelt wurden, waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml sterilem PBS und fügen Sie der Kultur 2 ml frischemelanozyten Medien ohne G418 hinzu.
    HINWEIS: Da Fibroblasten in der Melanozytenkultur nach der Behandlung nach G418 weiter absterben, waschen Sie die Schale mit sterilem PBS, um abgestorbene Zellen zu entfernen und frische Melanozytenmedien hinzuzufügen. Melanozyten- und Fibroblastenkulturen sollten durchgesieben werden, wenn sie 70-80% Konfluenz erreichen.

3. Bestätigung der zellulären Reinheit

1. Aspirieren Sie die Medien aus jeder Kultur und waschen Sie sorgfältig jedes Gericht mit 1 ml sterilem PBS.
2. Fügen Sie 0,7 ml 0,25% Trypsin zu jeder Kultur hinzu und bebrüten die Kulturen in Trypsin bei 37 °C und 5% CO2 für 1 min.
3. Lösen Sie die Zellen, indem Sie das Trypsin mit einer P1000-Mikropipette gegen den Boden der Schale pfeifen.
4. Fügen Sie 0,7 ml des entsprechenden Mediums zu jeder trypsinisierten Kultur hinzu und übertragen Sie die Zelllösung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
5. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 750 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000-Mikropipette.
   HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.5 können verwendet werden, um Melanozyten- und Fibroblastenkulturen zu durchlaufen. Das resultierende Pellet sollte in den entsprechenden Medien resuspendiert und in eine neue, unbeschichtete (Fibroblasten) oder vorgewaschene, kollagenbeschichtete Schale (Melanozyten) gegeben werden.
6. Das Zellpellet in 0,5 ml eiskaltem PBS wieder aufsetzen.
7. Aufzählen und Übertragen von 0,5 Millionen Zellen in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
8. Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie die Zellen dann in 100 L der Viability Solution wieder aus. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6 zweimal.
10. Wiederholen Sie Schritt 3.5, und fixieren Sie dann die Zellen, indem Sie das Pellet in 100 l eiskalte 4% Paraformaldehydlösung wieder aufhängen. Inkubieren Sie die Suspension für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
11. Wiederholen Sie Schritt 3,5 zweimal, wobei das Pellet jedes Mal in 0,5 ml von 3% BSA in 1x PBS wieder aufsetzt wird.
12. Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie dann das Zellpellet in 100 l 0,1% Saponin-Lösung wieder aus. Inkubieren Sie die Suspension für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
13. Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie dann das Zellpellet in 100 l 0,1% Saponin-Lösung mit 0,5 g Kaninchen-Anti-gp100-Antikörper, 0,5 g Kaninchen-Anti-Fibroblast-spezifischem Protein-1 (FSP1)-Antikörper und 0,025 g Maus-Anti-Cytokeratin 14 (K14) Antikörper wieder aus. Inkubieren Sie die Suspension für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    HINWEIS: Während der K14-Antikörper vorkonjugiert an Alexa Fluor 647 erworben wurde, wurden die Antikörper gp100 und FSP1 mit CF 555 bzw. CF 488 konjugiert. Auch die Färbung der Kontrollpopulationen sollte bei diesem Schritt beginnen. Kontrollzellpopulationen sollten von der Kultur isoliert und wie in den Schritten 3.5-3.12 beschrieben verarbeitet werden.
14. Wiederholen Sie Schritt 3.11 zweimal, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.
15. Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie dann das Zellpellet in 200-400 l von 3% BSA in 1x PBS wieder auf.
16. Übergeben Sie die Zelllösung durch ein 40-m-Zellsieb in ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr und analysieren Sie die belasteten Zellen durch Durchflusszytometrie.

Ergebnisse

Männliche und weibliche C57Bl/6J-Mäuse wurden an den postnatalen Tagen 0-4 eingeschläfert und die truncal Haut wurde einer mechanischen Dissoziation unterzogen, wie oben beschrieben. Nach dem Hacken bildete die Haut eine zähflüssige Gülle ohne Anzeichen von Strukturgewebe. Die Zentrifugierung dieser Gülle führte zur Bildung eines großen Zellpellets am Boden des konischen Rohres und einer Fettschicht, die auf dem Überstand schwebte. Diese Fettschicht wurde mit dem Überstand entsorgt, während das verbleibende Z...

Diskussion

Die In-vitro-Kultur von primären Melanozyten und Fibroblasten hat zu signifikanten Fortschritten in unserem Verständnis von Hautbiologie und Krankheiten geführt. Dieses Protokoll verbessert frühere Melanozyten-Isolationsmethoden, indem es die Zeit und das technische Geschick reduziert, die erforderlich sind, um konsistente Melanozytenkulturen zu erzeugen, während gleichzeitig die Isolierung von Hautfibroblasten ermöglicht wird. Ein neuartiges, zeitsparendes Element dieses Verfahrens ist, dass Dermis und Epidermis n...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100