Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

Riepilogo

Questo protocollo delinea un metodo rapido per generare simultaneamente colture di melanociti e fibroblasti dalla pelle di topi di 0-4 giorni. Queste colture primarie possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare una varietà di processi fisiologicamente rilevanti, tra cui biologia cellulare della pelle, pigmentazione, guarigione delle ferite e melanoma.

Abstract

I difetti nella funzione fibroblasta o melanocite sono associati a malattie della pelle, tra cui scarsa funzione di barriera, guarigione difettosa delle ferite, difetti di pigmentazione e cancro. Vitali per la comprensione e il miglioramento di queste malattie sono esperimenti nelle colture primarie di fibroblasto e melanociti. Tuttavia, i protocolli attuali per l'isolamento del melanocite richiedono che gli strati epidermici e dermici della pelle siano trypsinizzati e dissociati manualmente. Questo processo richiede molto tempo, è tecnicamente impegnativo e contribuisce a rendimenti incoerenti. Inoltre, i metodi per generare simultaneamente colture fibroblaste pure dallo stesso campione di tessuto non sono prontamente disponibili. Qui, descriviamo un protocollo migliorato per isolare melanociti e fibroblasti dalla pelle dei topi nei giorni postnatali 0-4. In questo protocollo, tutta la pelle viene omogeneizzata meccanicamente utilizzando un chopper di tessuto e poi brevemente digerita con collagenae e trypsina. Le popolazioni cellulari vengono poi isolate attraverso la placcatura selettiva seguita dal trattamento G418. Questa procedura si traduce in rendimenti costante di melanocite e fibroblasto da un singolo topo in meno di 90 min. Questo protocollo è anche facilmente scalabile, consentendo ai ricercatori di elaborare grandi coorti di animali senza un aumento significativo dei tempi pratici. Dimostriamo attraverso le valutazioni citometriche di flusso che le colture stabilite utilizzando questo protocollo sono altamente arricchite per melanociti o fibroblasti.

Introduzione

La pelle di mammifero è un organo multistrato che protegge il corpo da patogeni estranei e irradiazione ultravioletta (UVR). La pelle svolge anche un ruolo fondamentale nei processi omeostatici come la guarigione delle ferite, la regolazione della temperatura e la produzione di vitamina D^1,2,3. La pelle di mammaliana è costituita da tre tipi principali di cellule: melanociti, fibroblasti e cheratinociti. Questi tipi di cellule popolano diversi strati della pelle, con cheratinociti che compongono l'epidermide, fibroblasti che risiedono nel derma e melanociti che si localizzano alla giunzione epidermal-dermica e follicoli piliferi⁴. Qui, dettagliamo una semplice procedura che consente la generazione simultanea di colture primarie di melanociti e fibroblasti dalla pelle murina.

I melanociti sono cellule che producono pigmenti che si trovano in molte posizioni in tutto il corpo umano, tra cui l'epidermide basale, l'iride, la coclea, il cervello e i follicoli piliferi⁵. La funzione principale dei melanociti è quella di generare e secernere vesciche contenenti melanina chiamate melanosomi^5,6. I melanosomi contengono due classi principali di melanina: eumelanina marrone/nera e feomelanina giallo/rosso^6,7. I processi biochimici all'interno del melanocito regolano l'abbondanza relativa di ogni specie di melanina e aiutano a determinare il colore dei capelli, della pelle e degli occhi^8,9. La melanina serve anche ad assorbire UVR e proteggere i tessuti esposti al sole dalla mutagenesi¹⁰.

La disfunzione melanocite può causare difetti pigmentari e aumentare la suscettibilità al cancro della pelle. Ad esempio, le macchie di pelle iperpigmentate caratteristiche del melasma sono il risultato della sovrapproduzione di melanina focale, mentre le mutazioni genetiche germinali che compromettono i geni coinvolti nella sintesi della melanina portano all'albinismo^11,12 . La conoscenza intima della biologia del melanocite è necessaria per sviluppare strategie che correggano tali difetti pigmentari e, in ultima analisi, migliorino il benessere psicosociale degli individui afflitti da queste malattie. I deficit nella produzione di melanina e/o la sintesi preferenziale della feomelanina sono anche associati con un aumento del rischio di cancro della pelle¹⁰. Si ritiene che questo rischio risulti deriva dalla protezione UVR ridotta^6,13. Così, metodi per migliorare o ripristinare la produzione di eumelanina in melanociti possono ridurre l'incidenza del cancro della pelle in queste popolazioni.

I fibroblasti mesenchymi stabiliscono il tessuto connettivo e il supporto strutturale per tutti gli organi del corpo, compreso lo strato dermico della pelle¹⁴. L'escrezione di proteine come collagene, elastina, laminina e fibronectina consentono ai fibroblasti di formare la matrice extracellulare (ECM) che è essenziale per l'integrità del tessuto^1,14. I fibroblasti svolgono anche un ruolo essenziale in processi come la guarigione delle ferite, l'infiammazione, l'angiogenesi e la formazione/progressione del cancro^1,15,16.

Simile ai melanociti, i difetti nell'attivazione e nella funzione del fibroblasto possono promuovere la tumorigenesi e la malattia. Ad esempio, l'attivazione inappropriata del fibroblasto porta comunemente alla formazione di fibrosi, risultante dalla maggiore deposizione di componenti ECM in eccesso nel tessuto circostante. Come fibroblasti mantengono gran parte dell'integrità strutturale del corpo, fibrosi promuove malattie che colpiscono numerosi tessuti e organi, tra cui fibrosi polmonare idiopatica, sclerosi sistemica, cirrosi epatica e fibrosi cardiaca¹⁵. I fibroblasti svolgono anche un ruolo fondamentale nel cancro¹⁶. I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono le cellule non maligne più abbondanti nel microambiente di molti tumori. I CAF hanno dimostrato di promuovere la proliferazione tumorale, la progressione e la resistenza terapeutica modulando la rigidità dei tessuti, la produzione di citochine locali e la funzione immunitaria¹⁶.

Le colture cellulari primarie forniscono ai ricercatori modelli geneticamente trattabili per identificare e mitigare i difetti del melanocito e del fibroblasto che portano alla malattia. Tuttavia, gli attuali metodi per stabilire le culture melanocite richiedono molto tempo e sono tecnicamente impegnativi. La necessità di provare e la delicata separazione dell'epidermide e del dermide contribuisce alla variabilità nella resa sperimentale e rende difficile eseguire esperimenti su larga scala. Inoltre, attualmente mancano protocolli per isolare simultaneamente melanociti e fibroblasti da tutta la pelle.

Abbiamo sviluppato un metodo per ridurre le fasi di lavorazione, la variabilità e il tempo necessario per stabilire le colture di melanociti e fibroblasti dallo stesso campione di pelle intero. Utilizzando un metodo di omogeneizzazione meccanica seguito da una breve digestione, la nostra strategia riduce significativamente la quantità di tempo pratico necessario per isolare i melanociti primari consentendo l'isolamento simultaneo del fibroblasto. L'aumento della velocità, dell'efficienza e della coerenza di questo protocollo, in combinazione con la capacità di isolare i melanociti dai topi vecchi di 0-4 giorni, offre ai ricercatori la flessibilità necessaria per eseguire una gamma più ampia di esperimenti rispetto a prima possibile.

Protocollo

Ottenere l'approvazione dal comitato istituzionale per l'etica degli animali prima di iniziare questo o qualsiasi altro studio sugli animali. Gli esperimenti condotti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protocollo #2012A00000134) della Ohio State University.

1. Preparazione del protocollo

NOT: Le seguenti istruzioni di preparazione del reagente sono appropriate per la generazione di colture di 9 cm² melanociti e fibroblastda da un singolo topo. Fare riferimento alla guida alla preparazione dei reagenti nella Tabella 1 per gli isolamenti su scala più ampia.

1. Preparare 1,5 mL di soluzione di collagene che contiene 50 g/mL di collagene in acido acetico glaciale da 0,1 m.
2. In un armadio a flusso laminare, ricoprite un pozzo di un piatto di coltura a 6 pozze mobili con 8 g/cm² (1,44 mL) Di collagene. Assicurarsi che il pozzo sia completamente coperto dalla soluzione di collagene. Incubare il piatto a 37 gradi centigradi per 3 h o a 4 gradi durante la notte. Prima dell'uso, lavare il collagene rivestito bene due volte con 1,35 mL di fosfato sterile tampinato salina (PBS) (150 - L di PBS per 1 cm²).
3. Assemblare l'elicottero dei tessuti in un armadio a flusso laminare posizionando con attenzione un disco di taglio sulla piattaforma dell'elicottero dei tessuti e fissando una lama sterile al braccio mobile.
4. Preparare 3 mL di 1x Antibiotic/Antimycotic Solution diluendo 100x soluzione di riserva antibiotico/antimiocotico in PBS sterile.
5. Preparare 3 mL di fresco Skin Digestion Buffer contenente 10% siero bovino fetale, 1% penicillin/streptomycin soluzione, 1% L-glutamina, 10 mg/mL collagenase tipo I, 0.25% porcine trypsin e 0.02 mg/mL deoxyribonuclelease I in RPMI 1640.
6. Preparare 6 mL di Melanocite Media fresco contenente il 10% di siero bovino fetale, 7% siero di cavallo, 1% penicillina/streptomycin soluzione, 1% L-glutamina, 0,5 mM di-butyryl cyclic AMP (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbol 13 acetati (TPA) e 200 pM cholera tossina (CT) in Nutrient Mix F-12 Supporti di Ham.
   NOT: Le soluzioni di stock concentrate dbcAMP, TPA e CT possono essere realizzate, rivestite e conservate per >1 anno a -80 gradi centigradi. I supporti di base privi di questi componenti possono essere conservati per un massimo di 1 mese a 4 gradi centigradi.
7. Preparare 4 mL di Fibroblast Media contenente il 10% di siero bovino fetale, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di L-glutamina nel mezzo aquila modificato di Dulbecco. Questo supporto può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
8. Preparare 40 mL del 4% di soluzione di paraformaldeide diluindo il 16% di paraformaldeide in PBS. Conservare l'eccesso a 4 gradi centigradi per 1 mese o -20 gradi centigradi per un massimo di 1 anno.
9. Preparare una soluzione di scorta di saponin a 1% mescolando 0,5 g di saponina in 50 mL di PBS a 37 gradi centigradi fino a quando la saponina non si è completamente sciolta. Sterilizzare la soluzione per lo stoccaggio a lungo termine utilizzando una siringa da 50 mL dotata di un filtro PES da 0,2 m. La soluzione di riserva di saponin risultante può essere mantenuta a 4 gradi centigradi per 1 mese.
10. Preparare in PBS una soluzione Saponin pari allo 0,1% dello 0,1% di Saponin mediante il diluizione di una soluzione di stock di saponin dell'1% in PBS contenente il 3% di albumina del siero bovino (BSA).
11. Preparare la soluzione di 1 mL di fattibilità diluindo 1 ll di tintura di vitalità fissabile in 1 mL di PBS.

2. Isolamento melanocito e fibroblasto

1. Eutanasia da 0 a 4 giorni maschi e/o femmine C57Bl/6J cuccioli di decapitazione e rimuovere le estremità dai topi eutanasia utilizzando forbici chirurgiche.
2. In un armadio a flusso laminare, rotolare brevemente il tronco di ogni topo in una parabola Petri sterile contenente il 70% di etanolo. Togliere il tronco dall'etanolo e metterlo in un piatto Petri vuoto e sterile.
3. Utilizzando forbici chirurgiche, sterilizzate nel 70% di etanolo, fare un'incisione nella pelle sul lato ventrale del tronco a partire dal collo alla coda. Sbucciare la pelle dal tronco del topo utilizzando pinze sterili.
4. Mettere il derma della pelle in un piatto a 6 pozze contenente 3 mL di 1x Soluzione antibiotica / antimicotica e incubare a temperatura ambiente per 2-3 min.
5. Accendere l'elicottero di tessuto con le seguenti impostazioni in posizione: spessore Slice: 1 m; Forza lama: il 60% del massimo; Velocità: 50% del massimo.
6. Trasferire la pelle, derma lato verso il basso, su un disco di taglio di tessuto sterile e passare la pelle completamente attraverso l'elicottero di tessuto attivato 3 volte.
7. Trasferire la pelle omogeneizzata su un tubo conico sterile da 15 mL contenente 3 mL di buffer per la digestione della pelle. Mescolare la sospensione risultante convogliando su e giù 10-15 volte con una micropipetta P1000.
8. Far fronte al tubo conico e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 15 min, invertendo il tubo ogni 3-5 min.
9. Pellet le cellule nella pelle omogenea centrifusando il tubo conico in un rotore secchio oscillante a 750 x g per 5 min a temperatura ambiente.
10. Utilizzando una micropipetta P1000, rimuovere lentamente e completamente il buffer di digestione della pelle facendo attenzione a non disturbare il pellet.
    NOT: Una porzione di pelle intera può essere salvata in questa fase e utilizzata come controllo per la Fase 3: Conferma della purezza cellulare. Filtrare queste cellule attraverso un colino cellulare di 70 m e quindi iniziare al passaggio 3.5 per un'ulteriore elaborazione.
11. Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 1 mL di Melanocyte Media pipetting su e giù 15-20 volte con una micropipetta P1000. Aggiungere la soluzione cellulare risultante dropwise a un pozzo non rivestito di un piatto di 6 pozze contenente 1 mL di Melanocite Media.
12. Collocare l'omogenea della pelle placcata in un'incubatrice di coltura tissutale impostata a 37 e 5% di CO_2. Lasciare che le colture incubano per 40 min.
    NOT: Durante questo periodo, alcuni fibroblasti nella pelle omogenea aderiscono al piatto non rivestito mentre i melanociti e i cheratinociti rimangono in sospensione.
13. Trasferire la coltura supernatante dal piatto non rivestito a un pozzo di un piatto pre-lavato e rivestito di collagene 6 pozzetti. Aggiungere G418 al supporto in modo che la concentrazione finale sia 100 ng/mL.
14. Aggiungere 2 mL di Fibroblast Media in un pozzo del piatto non rivestito, ora contenente fibroblasti aderenti.
15. Incubare entrambe le colture durante la notte in un'incubatrice di coltura tissutale fissata a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂.
16. Separatamente aspirare i media e gli eventuali detriti da ogni coltura, 16-24 h dopo la placcatura. Lavare ogni piatto due volte con 1 mL di PBS sterile, quindi aggiungere 2 mL di Melanocyte Media fresco più 100 ng/mL G418 alla coltura melanocite e 2 mL di supporti fibroblasti freschi alla coltura fibroblasta.
17. Dopo che le colture melanocite sono state trattate con G418 per 48 h, lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS sterile e aggiungere 2 mL di Melanocyte Media fresco senza G418 alla coltura.
    NOT: Poiché i fibroblasti nella coltura melanocite continuano a morire durante il trattamento post-G418, lavare il piatto con PBS sterile per rimuovere le cellule morte e aggiungere supporti melanociti freschi. Le colture di melanociti e fibroblasti devono essere accompagnate quando raggiungono il 70-80% di confluenza.

3. Conferma della purezza cellulare

1. Aspirare i mezzi di comunicazione di ogni coltura e lavare con cura ogni piatto con 1 mL di PBS sterile.
2. Aggiungete 0,7 mL dello 0,25% di trypsin a ogni coltura e incubate le colture in trypsin a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂ per 1 min.
3. Spostare le cellule convogliando la trypsin sul fondo del piatto utilizzando una micropipetta P1000.
4. Aggiungere 0,7 mL del supporto appropriato a ogni coltura orpinizzata e trasferire la soluzione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
5. Pellet le cellule per centrifugazione a 750 x g per 2 min a temperatura ambiente. Rimuovere e scartare con cura il supernatante utilizzando una micropipetta P1000.
   NOT: I passaggi da 3.1-3.5 possono essere utilizzati per passare le colture melanociti e fibroblaste. Il pellet risultante deve essere risospeso nel supporto appropriato e collocato in un nuovo piatto non rivestito (fibroblasti) o pre-lavato, rivestito di collagene (melanociti).
6. Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di PBS ghiacciato.
7. Enumerare e trasferire 0,5 milioni di cellule in un tubo di microcentrifuga pre-raffreddato da 1,5 mL.
8. Ripetere il passaggio 3.5 e quindi risospendere nuovamente le celle in 100 gradi l di soluzione di fattibilità. Incubare la sospensione cellulare per 30 min a 4 gradi centigradi al buio.
9. Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,6 due volte.
10. Ripetere il passaggio 3.5, quindi fissare le cellule rispendendo il pellet in 100 - L di ghiaccio freddo 4% Soluzione di paraformaldeide. Incubare la sospensione per 15 min a temperatura ambiente al buio.
11. Ripetere il passaggio 3.5 due volte, ogni volta ripartendo il pellet in 0,5 mL del 3% BSA in 1x PBS.
12. Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare a 100 gradi L di 0,1% Soluzione Saponin. Incubare la sospensione per 15 min a temperatura ambiente al buio.
13. Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare in 100 .L di 0,1% Soluzione Saponin contenente 0,5 g di anticorpo anti-gp100 di coniglio, 0,5 g di anticorpo anti-fibroblasto del coniglio 1 (FSP1) e 0,025 g di anti-Cytokeratin 14 (K14) anticorpo. Incubare la sospensione per 1 h a temperatura ambiente al buio.
    NOT: Mentre l'anticorpo K14 fu acquistato pre-coniugato ad Alexa Fluor 647, gli anticorpi gp100 e FSP1 furono coniugati rispettivamente agli anticorpi CF 555 e CF 488. Anche la colorazione delle popolazioni di controllo dovrebbe iniziare in questa fase. Le popolazioni di cellule di controllo devono essere isolate dalle colture ed elaborate come descritto nei passaggi 3.5-3.12.
14. Ripetere il passaggio 3.11 due volte per rimuovere qualsiasi anticorpo non associato.
15. Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare in 200-400 - L del 3% di BSA in 1x PBS.
16. Passare la soluzione cellulare attraverso un colino di 40 m in un tubo rotondo-inferiore in polistirolo da 5 mL e analizzare le cellule tese per citometria di flusso.

Risultati

I topi Maschi e Femmine C57Bl/6J sono stati eutanasiati nei giorni postnatali 0-4 e la pelle tronica è stata sottoposta a dissociazione meccanica come descritto sopra. Dopo il taglio, la pelle formava un liquame viscoso privo di qualsiasi segno di tessuto strutturale. La centrifugazione di questo liquame ha portato alla formazione di un grande pellet cellulare nella parte inferiore del tubo conico e di uno strato di adiposo galleggiante sulla parte superiore del supernatante. Questo strato adiposo è stato scartato con ...

Discussione

La cultura in vitro dei melanociti primari e dei fibroblasti ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia e della malattia della pelle. Questo protocollo migliora i precedenti metodi di isolamento dei melanociti riducendo il tempo e l'esperto tecnico necessari per generare colture di melanociti coerenti, consentendo al contempo l'isolamento simultaneo dei fibroblasti cutanei. Un nuovo elemento che consente di risparmiare tempo di questa procedura è che il dermide e l'epidermide non hanno...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100