Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Özet

Bu protokol, 0-4 gün eski farelerin derisinden melanosit ve fibroblast kültürlerini eşzamanlı olarak oluşturmak için hızlı bir yöntem özetliyor. Bu primer kültürler, cilt hücresi biyolojisi, pigmentasyon, yara iyileşmesi ve melanom dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili süreçlerin çeşitli çalışma için muhafaza ve manipüle edilebilir.

Özet

Fibroblast veya melanosit fonksiyonunda hatalar, zayıf bariyer fonksiyonu, arızalı yara iyileşmesi, pigmentasyon kusurları ve kanser gibi cilt hastalıkları ile ilişkilidir. Bu hastalıkların anlaşılması ve iyileştirilmesi için hayati önem taşıyan primer fibroblast ve melanosit kültürlerinde deneyler vardır. Bununla birlikte, melanosit izolasyonu için geçerli protokoller cildin Epidermal ve dermal katmanlarının tripsinize ve el ile ilişkilendirilmemiş olmasını gerektirir. Bu işlem zaman alıcı, teknik olarak zorlu ve tutarsız verimler katkıda bulunur. Ayrıca, aynı zamanda aynı doku örneğinden saf fibroblast kültürlerini aynı anda oluşturmak için yöntemler kolayca kullanılabilir değildir. Burada, postnatal günlerde 0-4 farelerin derisinden melanosit ve fibroblastlar izole etmek için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokolde, tüm cilt mekanik bir doku helikopteri kullanılarak homojenize ve sonra kısaca kolajenaz ve tripsin ile sindirilir. Hücre nüfusu daha sonra seçici kaplama ile G418 tedavi takip izole edilir. Bu prosedür, tek bir fareyle 90 dakikadan az bir sürede tutarlı melanosit ve fibroblast verimleri ile sonuçlanır. Bu protokol de kolayca ölçeklenebilir, araştırmacılar el-zamanında önemli bir artış olmadan hayvanların büyük Kohortlar işlemek için izin. Bu protokol kullanılarak kurulan kültürlerin melanosit veya fibroblastlar için son derece zenginleşmesini sağlayan akış cytometrik değerlendirmelerini gösteriyoruz.

Giriş

Mammalin derisi, vücudu yabancı patojenlere ve ultra menekşe ışınlarına (UVR) karşı koruyan çok katmanlı bir organıdır. Deri aynı zamanda yara iyileşmesi, sıcaklık düzenlemesi ve D vitamini üretimi^1,2,3gibi homeostatik süreçlerde de kritik bir rol oynar. Memeli cilt üç büyük hücre türlerinden oluşur: melanosit, fibroblastlar ve keratinositler. Bu hücre türleri cildin farklı katmanlarını doldurur, epidermis yapan keratinositler, dermis ve melananosit epidermal-dermal kavşak ve saç folikülleri lokalize yaşayan fibroblastlar⁴. Burada, duvar derisinden primer melanosit ve fibroblast kültürlerinin eşzamanlı üretimi sağlayan basit bir prosedür ayrıntılarıyla.

Melanosit, bazal epidermis, İris, koklea, beyin ve saç folikülleri⁵de dahil olmak üzere insan vücudu boyunca birçok yerde bulunan pigment üreten hücrelerdir. Melanositlerin primer işlevi, melanom^5,6olarak adlandırılan melanin içeren veziküller oluşturmak ve salgılayacaktır. Melanosomes melanin iki ana sınıfları içerir: kahverengi/siyah eumelanin ve sarı/kırmızı pheomelanin^5/6. Melanosit içinde biyokimyasal süreçler her melananin türünün göreceli bolluk düzenleyen ve saç belirlemek için yardım, cilt ve göz rengi^8,9. Melanin de UVR absorbe ve mutagenez¹⁰güneş maruz dokular korumak için hizmet vermektedir.

Melanosit disfonksiyon pigmente kusurları neden olabilir ve cilt kanseri duyarlılığını artırabilir. Örneğin, hiper-pigmentli cilt melazma karakteristik yamalar fokal melanin aşırı üretim sonucudur, ancak germline genetik mutasyonlar, melanin sentezi, albinizm neden katılan genler taviz^11,12 . Melanosit biyolojisinin samimi bilgisi, bu tür pigmente kusurları düzeltecek ve sonuçta bu hastalıklarla oluşan bireylerin psikososyal refah kalitesini artıran stratejiler geliştirmek için gereklidir. Melanin üretimindeki açıkları ve/veya feomelanin Tercihli sentezini de artan cilt kanseri riski ile ilişkilidir¹⁰. Bu risk düşük UVR koruma^6,13sonucu olduğuna inanılmaktadır. Böylece, melanositlerde eumelanin üretimini geliştirmek veya geri yüklemek için yöntemler bu nüfusun cilt kanseri insidansı azaltabilir.

Mezenkimal fibroblastlar cilt¹⁴dermal tabakası dahil olmak üzere vücudun tüm organları için bağ dokusu ve yapısal destek kurmak. Kollajen, elastin, laminin ve fibronektin gibi proteinlerin atılımı, fibroblastların doku bütünlüğü için gerekli olan (ECM) ekstrellüler matrisini oluşturmaya olanak tanır^1,14. Fibroblastlar da yara iyileşmesi, inflamasyon, anjiyojenez ve kanser oluşumu/ilerlemesi^1,15,16gibi süreçlerde temel roller oynar.

Melanositlere benzer şekilde, fibroblast aktivasyonu ve fonksiyonunda kusurlar tümörijenezde ve hastalığı teşvik edebilir. Örneğin, uygunsuz fibroblast aktivasyonu genellikle fibrozis oluşumuna yol açar ve bu da aşırı ECM bileşenlerinin çevreleyen dokuya gelişmiş birikmesinden kaynaklanan. Fibroblastlar vücudun yapısal bütünlüğünü çok koruyup, fibrozis idiyopatik pulmoner fibrozis, sistemik skleroz, karaciğer sirozu ve kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere çok sayıda doku ve organı etkileyen hastalıkları teşvik etmektedir¹⁵. Fibroblastlar da kanserde kritik rol oynamaktadır¹⁶. Kanser ilişkili fibroblastlar (CAFs) birçok tümörlerin mikroortamında en bol olmayan malign hücreler. Cafs doku sertliği, yerel sitokin üretimi ve bağışıklık fonksiyonu¹⁶modüle tarafından tümör proliferasyonu, progresyon ve terapötik direnç teşvik gösterilmiştir.

Primer Hücre kültürleri, hastalıklara yol açacak melanosit ve fibroblast kusurları tanımlamak ve azaltmak için genetiği izlenmeli modeller ile araştırmacılar sağlar. Ancak, melanosit kültürlerini kurmak için geçerli yöntemler zaman alıcı ve teknik olarak zordur. Tripsinizasyon ve epidermis ve dermis hassas ayrılması için ihtiyaç deneysel verim değişkenliğine katkıda bulunur ve zor büyük ölçekli deneyler gerçekleştirmek için yapar. Ayrıca, protokollerin aynı anda tüm cildin melanosit ve fibroblastları izole etmek için şu anda alanda eksik.

Aynı tüm cilt örneğinden melanosit ve fibroblast kültürlerini kurmak için gereken işlem adımlarını, değişkenliği ve zamanı azaltmak için bir yöntem geliştirdik. Kısa bir sindirimi takiben mekanik homojenizasyon yöntemi kullanılarak, stratejimiz, eşzamanlı fibroblast yalıtımı sağlayarak primer melanositlerin yalıtılması için gerekli olan el süresini önemli ölçüde azaltır. Artan hız, verimlilik ve bu protokol tutarlılık, 0-4 gün eski fareler melanosit yalıtma yeteneği ile birlikte, araştırmacılar daha önce mümkün olandan daha geniş bir dizi denemeler yapmak için esneklik sağlar.

Protokol

Bu veya hayvanları içeren başka bir çalışma başlamadan önce kurumsal hayvan etiği komitesinden onay alın. Bu protokolde gerçekleştirilen deneyler Ohio State Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıayuc, protokol #2012A00000134) tarafından onaylanmıştır.

1. protokol hazırlığı

Not: Aşağıdaki reaktif hazırlama talimatları tek bir fareyle 9 cm² melanosit ve fibroblast kültürlerinin oluşturulması için uygundur. Daha büyük ölçek yalıtımları için Tablo 1 ' deki reaktif hazırlama kılavuzuna bakın.

1. 0,1 M buzul asetik asit içinde 50 μg/mL kollajen içeren kollajen çözeltisi 1,5 mL hazırlayın.
2. Bir laminar akış kabininde, 8 μg/cm² (1,44 ml) kollajen çözeltisi ile 6-iyi hücre kültürü çanak bir kat iyi. İyi tamamen kollajen solüsyonu ile kaplıdır emin olun. Çanak, 37 °C ' de 3 saat veya 4 °C ' de bir gecede. Kullanım öncesinde, 1,35 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) (1 cm²başına 150 μL) ile kollajen kaplamalı kuyusu iki kez yıkayın.
3. Dikkatle doku Chopper platformuna bir doğrama diski yerleştirerek ve taşınabilir kol steril bir bıçak güvenliğini sağlayarak bir laminar akış kabine doku Chopper birleştirin.
4. Steril PBS 'de 100x antibiyotik/Antimikotik stok çözeltisi seyreltilerek 3 mL 1x antibiyotik/Antimycotik çözelti hazırlayın.
5. Hazırlamak 3 ml taze cilt sindirim tampon içeren 10% fetal Sığır serum, 1% penisilin/streptomisin çözeltisi, 1% L-glutamin, 10 mg/ml kolajenaz tip ı, 0,25% domuz tripsin ve 0,02 mg/ml deoksirribonuclease ı rpmi 1640.
6. Hazırlamak 6 ml taze melanosit medya içeren 10% fetal sığır serumu, 7% at serumu, 1% penisilin/streptomisin çözeltisi, 1% L-glutamin, 0,5 mm di-butyryl döngüsel amfi (dbcamp), 20 Nm tetradecanoylphorbol 13-asetat (TPA) ve 200 PM Kolera toksin (CT) Besin Mix F-12 ham 'ın medya.
   Not: Konsantre dbcAMP, TPA ve CT hisse senedi çözümleri, > 1 yıl-80 °C ' ye kadar alınabilir ve depolanabilir. Bu bileşenlerin bulunmayan temel medya 4 °C ' de 1 aya kadar depolanabilir.
7. % 10 fetal sığır serumu, 1% penisilin/streptomisin ve Dulbecco 'nun değiştirilmiş kartal ortamında% 1 L-glutamin içeren 4 mL fibroblast medya hazırlayın. Bu medya 1 aya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
8. PBS 'de% 16 civarında formaldehite seyreltilerek 40 ml% 4 civarında formaldehite çözeltisi hazırlayın. 4 °C ' de 1 ay veya-20 °C ' ye kadar 1 yıla kadar herhangi bir fazlalığını saklayın.
9. Saponin tamamen çözünene kadar 37 °C ' de 50 mL PBS 'de 0,5 g saponin karıştırılarak% 1 saponin stok solüsyonu hazırlayın. 0,2 μm PES filtresine sahip 50 mL şırıngayı kullanarak uzun süreli depolama için solüsyonu sterilize edin. Elde edilen saponin stok çözeltisi 1 ay boyunca 4 °C ' de tutulabilir.
10. % 3 Sığır serum albümin (BSA) içeren PBS 'de% 1 saponin stok çözümünü seyreltilerek, fare başına 200 μL% 0,1 saponin çözeltisi hazırlayın.
11. 1 ml PBS 'de 1 μL düzeltilebilir canlılığı boya seyreltilerek 1 ml canlılığı solüsyonu hazırlayın.

2. melanosit ve fibroblast yalıtım

1. Ötenize 0-4 gün-yaşlı erkek ve/veya kadın C57Bl/6J pups delevite ve cerrahi makas kullanarak ötenize fareler ekstremite kaldırın.
2. Bir laminar akış kabininde, kısaca% 70 etanol içeren steril Petri çanak her fare gövde rulo. Etanol gelen gövde çıkarın ve boş, steril Petri çanak içine yerleştirin.
3. 70% etanol içinde sterilize cerrahi makas kullanarak, kuyruk boyun başlayarak gövdenin ventral tarafında cilt bir kesi yapmak. Steril forseps kullanarak fare gövdesinin cilt soyma.
4. Cilt DermIS yan aşağı yerleştirin 6-iyi yemek içeren 3 mL 1x antibiyotik/Antimikotik eriyik ve oda sıcaklığında inkük 2-3 dk.
5. Aşağıdaki ayarlarla doku helikopterini açın: dilim kalınlığı: 1 μm; Bıçak kuvveti: ~% 60 maksimum; Hız: ~% 50 maksimum.
6. Cilt, dermis yan aşağı, steril bir doku helikopter diske aktarın ve tamamen aktif doku helikopter aracılığıyla cilt geçmek 3 kez.
7. Homojenize deri steril, 15 mL konik Tüp 3 mL cilt sindirim tampon içeren aktarın. Bir P1000 mikropipet ile 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme elde edilen süspansiyon karıştırın.
8. Konik tüpü kap ve numuneyi 37 °C ' lik su banyosuna 15 dakika boyunca, her 3-5 dakikada bir tüp ters çevirir.
9. Cilt hücreleri Pellet bir sallanan kova rotor içinde konik tüp santrifüpleme tarafından Homojenat 750 x g oda sıcaklığında 5 dakika.
10. Bir P1000 mikropipet kullanarak, yavaşça ve tamamen cilt sindirim tampon Pelet rahatsız etmek için dikkatli olmak kaldırmak.
    Not: Tüm cildin bir kısmı bu aşamada kaydedilebilir ve adım 3 için bir kontrol olarak kullanılan: hücresel saflık onayı. Bir 70 μm hücre süzgeci ile bu hücreleri strain ve daha sonra adım 3,5 daha fazla işleme için başlar.
11. Bir P1000 mikropipet ile 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetleme tarafından 1 ml melanosit medya hücre Pelet iyice pelletini. Elde edilen hücre solüsyonu, 1 mL Meloksit medya içeren 6-kuyu çanak kaplanmamış bir iyi dropwise ekleyin.
12. 37 °C ve% 5 CO 2 ' de yer alan bir doku kültürü kuluçteninde kaplama cilt homojenini yerleştirin_. Kültürler 40 dk için inkübe izin verin.
    Not: Bu süre zarfında, melanosit ve keratinositler askıya alınırken deri Homojenat bazı fibroblastlar kaplanmamış çanak uyacaktır.
13. Kültür süpernatant kaplanmamış çanak bir iyi bir önceden yıkanmış, kollajen kaplı 6-well yemek aktarın. Son konsantrasyon 100 ng/mL gibi ortama G418 ekleyin.
14. Şimdi yapışan fibroblastlar içeren, kaplamasız yemeğin bir kuyusu için fibroblast medya 2 mL ekleyin.
15. 37 °C ' de ve% 5 CO₂' de bulunan bir doku kültürü küvatörü içinde her iki kültürü de kuluçat.
16. Ayrı olarak medya ve her kültürden herhangi bir enkaz Aspire, 16-24 h kaplama sonra. 1 mL steril PBS ile iki kez her çanak yıkayın ve sonra 2 mL taze melanosit medya artı 100 ng/mL G418 melanosit kültürü ve 2 mL taze fibroblast medya fibroblast kültüre ekleyin.
17. Melanosit kültürler 48 h için G418 ile tedavi edildikten sonra, iki kez steril PBS 1 mL ile hücreleri yıkayın ve kültür için G418 olmadan taze Meloksit medya 2 mL ekleyin.
    Not: Melanosit kültüründeki fibroblastlar Post-G418 tedavisi dışında ölmeye devam ederken, ölü hücreleri kaldırmak ve taze melanosit Media eklemek için steril PBS ile çanak yıkayın. Melanosit ve fibroblast kültürler% 70-80 konfluency ulaştığında geçmeli.

3. hücresel saflık onayı

1. Her kültürden medyayı aspirate ve her çanak 1 mL steril PBS ile dikkatlice yıkayın.
2. Her kültürde% 0,25 tripsin 0,7 ml ekleyin ve 37 °c ' de tripsin kültürlerini ve 1 dakika boyunca% 5 Co₂ ' sini inküyeyin.
3. Bir P1000 mikropipet kullanarak çanak alt karşı tripsin pipetleme hücreleri dislodge.
4. Her tripsinized kültür için uygun medya 0,7 mL ekleyin ve bir 1,5 mL mikrosantrifüjle tüp içine hücre çözümünü aktarın.
5. Oda sıcaklığında 2 dakika için 750 x g 'de santrifüjleme ile hücreleri Pellet. Bir P1000 mikropipet kullanarak süpernatant dikkatle kaldırın ve atın.
   Not: 3.1-3.5 adımlar melanosit ve fibroblast kültürlerine geçiş için kullanılabilir. Elde edilen Pelet uygun medyada resuspended ve yeni bir yerleştirilir olmalıdır, kaplanmamış (fibroblastlar) veya önceden yıkanmış, kollajen kaplı (melanosit) çanak.
6. 0,5 ml buz-soğuk PBS içinde hücre Pelet resuspend.
7. 500.000 hücreleri önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne numaralandırın ve aktarın.
8. 3,5 adım yineleyin ve sonra 100 μL viability çözüm hücreleri yeniden pelletini. Hücre süspansiyonunu karanlıkta 4 °C ' de 30 dakika boyunca inküat.
9. 3,5-3.6 arasındaki adımları iki kez yineleyin.
10. Adım 3,5 tekrarlayın, daha sonra 100 μL buz soğuk% 4 Paraformaldehyde çözeltisi içinde Pelet resuspending tarafından hücreleri düzeltin. Süspansiyonu, karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kulyatın.
11. Adım 3,5 iki kez yineleyin, her seferinde 1x PBS 'de 0,5 mL% 3 BSA 'da Pelet resuspending.
12. 3,5 adım yineleyin, sonra 100 μL% 0,1 saponin çözeltisi içinde hücre Pelet pelletini. Süspansiyonu, karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kulyatın.
13. Adım 3,5 tekrarlayın, sonra 100 μL içinde 0,1% saponin çözümü, tavşan Anti-GP100 antikor, 0,5 μg tavşan Anti-fibroblast-spesifik protein 1 (FSP1) antikor ve 0,025 μg fare Anti-sitozatin 14 (K14) antikor içeren 0,5 μg hücre Pelet pelletini. Süspansiyon, karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkük.
    Not: K14 antikor Alexa Fluor 647 için önceden konjuç satın alındığında, GP100 ve FSP1 antikorları sırasıyla CF 555 ve CF 488 ' ye konjuç edildi. Kontrol nüfuslarının boyama da bu adımda başlaması gerekir. Denetim hücresi nüfusu kültürden yalıtılmış ve 3.5-3.12 adımlarda açıklandığı gibi işlenir.
14. Herhangi bir ilişkisiz antikor kaldırmak için iki kez adım 3,11 yineleyin.
15. 3,5 adımı tekrarlayın, sonra da 1x PBS 'de 200-400 μL 'de% 3 BSA 'da hücre Pelet 'ini yeniden pelletini.
16. 40 μm hücre süzgeci ile hücre çözümünü 5 mL polistiren yuvarlak alt tüpüne geçirin ve Akış sitometrisi ile gergin hücreleri analiz edin.

Sonuçlar

Erkek ve kadın C57Bl/6J fareler postnatal günlerde ötenize edildi 0-4 ve kesme cildi yukarıda açıklandığı gibi mekanik ayrışma maruz kalmıştır. Doğrama sonrasında, cilt herhangi bir yapısal doku belirtisi bulunmayan viskoz bir bulamaç oluşturdu. Bu Bulamaç santrifüjleme konik tüp altında büyük bir hücre peleti oluşumu ve süper natant üzerinde yüzen adipoz bir katman sonuçlandı. Kalan hücre Pelet resuspended ve 6-well çanak bir kaplanmamış iyi transfer iken bu yağ tabakası süpernatan...

Tartışmalar

Primer melanosit ve fibroblastların in vitro kültürü, cilt biyolojisi ve hastalığı anlayışımızda önemli gelişmelere yol açtı. Bu protokol, cilt fibroblastları eşzamanlı izolasyonu için izin verirken tutarlı melanosit kültürler oluşturmak için gerekli zaman ve teknik savvy azaltarak önceden melanosit yalıtım yöntemleri üzerine geliştirir. Bir roman, bu prosedürün zaman kazandıran unsuru dermis ve epidermis ayrı olması gerekmez olmasıdır. Bunun yerine, cilt hücreleri, seçici medya ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100