Быстрое поколение первичных культур Мурин Меланоцит и Фибробласт

Резюме

Этот протокол излагает быстрый метод одновременного генерации меланоцитов и фибробластных культур из кожи 0-4 дневных мышей. Эти первичные культуры могут быть сохранены и манипулировать в пробирке для изучения различных физиологически значимых процессов, в том числе биологии клеток кожи, пигментации, заживления ран и меланомы.

Аннотация

Дефекты функции фибробласта или меланоцита связаны с заболеваниями кожи, включая плохую барьерную функцию, дефектное заживление ран, дефекты пигментации и рак. Важнейшими для понимания и улучшения этих заболеваний являются эксперименты в первичных фибробластных и меланоцитных культурах. Тем не менее, текущие протоколы для изоляции меланоцитов требуют, чтобы эпидермальные и кожные слои кожи пробифицировались и вручную отмежевались. Этот процесс занимает много времени, технически сложной и способствует несовместимым урожаям. Кроме того, невсегдаен доступ к методам одновременного генерации чистых фибробластных культур из одного образца тканей. Здесь мы описываем улучшенный протокол для изоляции меланоцитов и фибробластов из кожи мышей в послеродовые дни 0-4. В этом протоколе, вся кожа механически гомогенизированы с помощью вертолета ткани, а затем кратко усваивается с коллагеназой и трипсином. Популяции клеток затем изолированы через селективное покрытие, за которым следует лечение G418. Эта процедура приводит к последовательной меланоцитов и фибробластов дает от одной мыши менее чем за 90 минут. Этот протокол также легко масштабируется, что позволяет исследователям обрабатывать большие когорты животных без значительного увеличения времени. Мы показываем через поток цитометрических оценок, что культуры, созданные с помощью этого протокола, высоко обогащены меланоцитами или фибробластами.

Введение

Кожа млекопитающих является многослойным органом, который защищает организм от инородных патогенов и ультрафиолетового облучения (УВР). Кожа также играет важную роль в гомеостатических процессов, таких как заживление ран, регулирование температуры и витамина D производства^1,2,3. Кожа млекопитающих состоит из трех основных типов клеток: меланоцитов, фибробластов и кератиноцитов. Эти типы клеток населяют различные слои кожи, с кератиноцитами, составляющими эпидермиса, фибробластов, проживающих в дерме и меланоцитах, локализованных в эпидермально-дермальных соединения хищных и волосяных фолликулов⁴. Здесь мы подробно простую процедуру, которая позволяет одновременное поколение первичных меланоцитов и фибробластных культур из кожи мурин.

Меланоциты пигментных клеток, найденных во многих местах по всему человеческому телу, в том числе базальных эпидермис, радужная оболочка, улитка, мозг и волосяные фолликулы⁵. Основная функция меланоцитов заключается в генерации и выделении меланиносодержащих пузырьков, называемых меланосомами^5,6. Меланосомы содержат два основных класса меланина: коричневый/черный эумеланин ижелтый/красный феомеланин 6,⁷. Биохимические процессы в меланоцитах регулируют относительное изобилие каждого вида меланинаи помогают определить цвет волос, кожи и глаз 8,⁹. Меланин также служит для поглощения UVR и защиты солнечных тканей от мутагенеза^10.

Меланоцит дисфункции может вызвать пигментные дефекты и увеличить восприимчивость рака кожи. Например, гиперпигментированные участки кожи, характерные для меланомы, являются результатом перепроизводства фокусного меланина, в то время как зародышевые генетические мутации, которые компрометируют гены, участвующие в синтезе меланина, приводят к альбинизму^11,12 . Интимное знание биологии меланоцитов требуется для разработки стратегий, которые позволят исправить такие пигментные дефекты и в конечном итоге улучшить психосоциальное благополучие людей, страдающих этими заболеваниями. Дефицит в производстве меланина и / или преференциальный синтез феомеланина также связаны с повышенным риском рака кожи¹⁰. Этот риск, как полагают, в результате снижения защиты UVR^6,13. Таким образом, методы повышения или восстановления производства эумеланина в меланоцитах могут снизить заболеваемость раком кожи в этих популяциях.

Мезенхимальные фибробласты устанавливают соединительную ткань и структурную поддержку для всех органов тела, включая кожный слой кожи^14. Выделение белков, таких как коллаген, эластин, ламинин и фибронектин позволяют фибробластам формировать внеклеточную матрицу (ECM), которая необходима для целостности тканей^1,14. Фибробласты также играют важную роль в таких процессах, как заживление ран, воспаление, ангиогенез и образование рака/прогрессирование^1,15,16.

Как и меланоциты, дефекты в фибробластной активации и функции могут способствовать опухолевому и заболеванию. Например, неуместная активация фибробластов обычно приводит к образованию фиброза, в результате повышенного осаждения избыточных компонентов ECM в окружающие ткани. Как фибробласты поддерживать большую часть структурной целостности организма, фиброз способствует заболеваний, которые влияют на многочисленные ткани и органы, в том числе идиопатический легочный фиброз, системный склероз, цирроз печени и сердечный фиброз¹⁵. Фибробласты также играют важную роль в раке¹⁶. Связанные с раком фибробласты (ЦАФ) являются наиболее распространенными незлокачественными клетками в микроокружении многих опухолей. Было показано, что ЦАФы способствуют пролиферации опухоли, прогрессированию и терапевтической резистентности путем модулирования жесткости тканей, местного производства цитокинов и иммунной функции^16.

Первичные клеточные культуры предоставляют исследователям генетически убираемые модели для выявления и смягчения дефектов меланоцитов и фибробластов, которые приводят к болезням. Тем не менее, современные методы создания меланоцитов культур ы отнимают много времени и технически сложной задачей. Потребность в трипсинизации и деликатное разделение эпидермиса и дермы способствует изменчивости экспериментальной урожайности и затрудняет проведение крупномасштабных экспериментов. Кроме того, протоколы для одновременного изолировать меланоциты и фибробласты от всей кожи в настоящее время не хватает в поле.

Мы разработали метод снижения этапов обработки, изменчивости и времени, необходимого для создания меланоцитов и фибробластных культур из одного и того же образца всей кожи. Используя метод механической гомогенизации с последующим кратким пищеварением, наша стратегия значительно уменьшает количество практического времени, необходимого для изоляции первичных меланоцитов, позволяя одновременной изоляции фибробластов. Повышенная скорость, эффективность и согласованность этого протокола, в сочетании с возможностью изолировать меланоциты от 0-4-дневных мышей, предоставляет исследователям гибкость для выполнения более широкого спектра экспериментов, чем это было ранее возможно.

протокол

Получить одобрение от вашего институционального комитета по этике животных, прежде чем причавать это или любое другое исследование с участием животных. Эксперименты, проведенные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета штата Огайо (IACUC, протокол #2012A00000134).

1. Подготовка протокола

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие инструкции по подготовке реагента подходят для генерации 9 см² меланоцитов и фибробластных культур из одной мыши. Обратитесь к руководству по подготовке реагентов в таблице 1 для более масштабных изоляций.

1. Приготовьте 1,5 мл коллагенового раствора, содержащего 50 мкг/мл коллагена в 0,1 м ледниковой уксусной кислоты.
2. В ламинарном шкафу потока, пальто один из 6-хорошо ячейки культуры блюдо с 8 мкг /см² (1,44 мл) Коллаген решение. Убедитесь, что скважина полностью покрыта коллагеновым раствором. Инкубировать блюдо при 37 градусах по Цельсию в течение 3 ч или при 4 градусах на ночь. Перед использованием, мыть коллагена покрытием хорошо дважды с 1,35 мл стерильного фосфата буферного солей (PBS) (150 мл ПБС на 1 см²).
3. Соберите траулера ткани в шкаф потока ламинарпуте путем тщательно устанавливать отрубать диск на платформе вертолета ткани и обеспечивать стерильное лезвие к подвижной рукоятке.
4. Приготовьте 3 мл 1x антибиотик/антимикотический раствор, разбавив 100x антибиотик/антимикотический бульонный раствор в стерильных PBS.
5. Подготовка 3 мл свежей кожи пищеварения буфера, содержащего 10% плода крупного рогатого скота сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина раствор, 1% L-глютамина, 10 мг/мл коллагена типа I, 0,25% свина трипсина и 0,02 мг/mL deoxyribonuclease I в 1640.
6. Подготовка 6 мл свежих меланоцитов Media, содержащая 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 7% сыворотки лошади, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% L-глутамина, 0,5 мМ ди-бутирила цикли amp (dbcAMP), 20 nM тетрейданолторбол 13-ace (TPA) и 20m tte Питательный микс F-12 Ветчина сми.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированные dbcAMP, TPA и CT фондовые решения могут быть сделаны, aliquoted и хранится в течение 1 года при -80 градусов по Цельсию. Базовые носители, не имеющие этих компонентов, могут храниться до 1 месяца при 4 градусах Цельсия.
7. Подготовка 4 мл Fibroblast Media, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% L-глютамина в Dulbecco в модифицированных Eagle Medium. Этот носители могут храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 1 месяца.
8. Приготовьте 40 мл 4% раствора параформальдегида, разбавив 16% параформальдегида в PBS. Храните любое превышение при 4 градусах по Цельсию в течение 1 месяца или -20 градусов по Цельсию в течение 1 года.
9. Приготовьте 1% сапонина, перемешивая 0,5 г сапонина в 50 мл PBS при 37 градусах По Цельсия до полного растворения сапонина. Стерилизовать раствор для долгосрочного хранения с помощью 50 мл шприца оснащены 0,2 мкм PES фильтр. Полученный сапонин бульонный раствор может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 1 месяца.
10. Приготовьте 200 л 0,1% Сапонина Раствор на мышь, разбавляя 1% сапонина стокового раствора в PBS, содержащий 3% бычьего сыворотоки альбумина (BSA).
11. Приготовьте 1 мл решения жизнеспособности, разбавив 1 л поправляемого красителя жизнеспособности в 1 мл PBS.

2. Меланоцит и изоляция фибробластов

1. Эвтаназия от 0 до 4 дневных мужчин и / или женщин C57Bl/6J щенков путем обезглавливания и удалить конечности из эвтанированных мышей с помощью хирургических ножниц.
2. В ламинарном шкафу, кратко рулон ствол каждой мыши в стерильной чашке Петри, содержащий 70% этанола. Снимите ствол с этанола и поместите его в пустую, стерильную чашку Петри.
3. Используя хирургические ножницы, стерилизованные в 70% этанола, делают разрез в коже на брюшной стороне туловища, начиная от шеи до хвоста. Очистите кожу от ствола мыши с помощью стерильных щиптов.
4. Поместите кожу дермы стороной вниз в 6-хорошо блюдо, содержащее 3 мл 1x антибиотик / антимикотический раствор и инкубировать при комнатной температуре в течение 2-3 мин.
5. Включите тканевой измельчитель со следующими настройками на месте: Толщина фрагмента: 1 мкм; Сила лезвия: 60% от максимума; Скорость: 50% от максимума.
6. Перенесите кожу, дерму стороной вниз, на стерильный диск измельчителя ткани и передать кожу полностью через активированный измельчитель ткани 3 раза.
7. Перенесите гомогенизированную кожу в стерильную коническую трубку 15 мл, содержащую 3 мл буфера пищеварения кожи. Смешайте полученную подвеску, повышая и остывая 10-15 раз с микропипеттом P1000.
8. Cap конической трубки и инкубировать образец в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 15 минут, инвертирование трубки каждые 3-5 минут.
9. Пеллетклетки кожи гоменатируют путем центрифугирования конической трубки в размахивая ротор ведро на 750 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
10. Использование p1000 micropipette, медленно и полностью удалить пищеварительной буфера пищеварения быть осторожным, чтобы не беспокоить гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часть всей кожи может быть сохранена на данном этапе и используется в качестве контроля для шага 3: Подтверждение клеточной чистоты. Процедите эти клетки через 70 мкм ячейки ситечко, а затем начать на шаг 3,5 для дальнейшей обработки.
11. Тщательно resuspend клеточной гранулы в 1 мл меланоцитов СМИ путем pipetting вверх и вниз 15-20 раз с p1000 микропайпет. Добавьте результирующее клеточное раствор в непокрытом колодце из 6-ну хорошо блюда, содержащего 1 мл меланоцитов Media.
12. Поместите покрытую кожу гомегенатом в инкубатор культуры тканей, установленный при 37 градусах по Цельсию и 5% CO_2. Разрешить культур инкубировать в течение 40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени, некоторые фибробласты в коже гоменат будет придерживаться непокрытого блюда в то время как меланоциты и кератиноциты остаются в подвеске.
13. Перенесите культурный супернатант из непокрытого блюда в один колодец предварительно промытого, покрытого коллагеном 6-ну хорошо блюдо. Добавьте G418 в СМИ так, что конечная концентрация 100 нг/мл.
14. Добавьте 2 мл Fibroblast Media в один колодец непокрытого блюда, теперь содержащего адепт фибробластов.
15. Инкубировать обе культуры на ночь в инкубаторе культуры тканей, установленном на уровне 37 градусов по Цельсию и 5% CO_2.
16. Отдельно аспирируйте средства массовой информации и любые обломки от каждой культуры, 16-24 ч после покрытия. Вымойте каждое блюдо дважды с 1 мл стерильных PBS, а затем добавить 2 мл свежих меланоцитов СМИ плюс 100 нг /мл G418 в меланоцитов культуры и 2 мл свежих Фибробласт СМИ в фибробласткультурной культуры.
17. После меланоцитов культуры были обработаны G418 для 48 ч, мыть клетки дважды с 1 мл стерильных PBS и добавить 2 мл свежих меланоцитов СМИ без G418 в культуру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как фибробласты в меланоцитов культуры продолжают отмирать после лечения G418, мыть блюдо с стерильными PBS удалить мертвые клетки и добавить свежие меланоцитов СМИ. Меланоциты и фибробластные культуры должны быть проложены, когда они достигают 70-80% confluency.

3. Подтверждение клеточной чистоты

1. Аспирируйте средства массовой информации от каждой культуры и тщательно мыть каждое блюдо с 1 мл стерильных PBS.
2. Добавьте 0,7 мл 0,25% трипсина к каждой культуре и инкубировать культуры в трипсин при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение 1 мин.
3. Выбить клетки путем pipetting трипсина против нижней части блюда с помощью p1000 micropipette.
4. Добавьте 0,7 мл соответствующего носителя к каждой трипсинизированной культуре и перенесите клеточный раствор в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
5. Пелле клетки центрифугации при 750 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Тщательно удалить и отбросить супернатант с помощью микропайпета P1000.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.1-3.5 могут быть использованы для прохождения меланоцитов и фибробластных культур. Полученные гранулы следует переопустить в соответствующие носители и поместить в новое, непокрытое (фибробласты) или предварительно промытые, коллагеновы (меланоциты) блюдо.
6. Приостановите действие клеточной гранулы в 0,5 мл ледяного PBS.
7. Перечислите и перенесите 0,5 миллиона клеток в предварительно охлажденную микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
8. Повторите шаг 3.5, а затем повторно приостановите клетки в 100 злимости решения. Инкубировать клеточную подвеску в течение 30 минут при 4 градусах По Цельсию в темноте.
9. Повторите шаги 3,5-3,6 дважды.
10. Повторите шаг 3.5, затем исправить клетки, повторно приостановив гранулы в 100 л ледяного холода 4% Параформальдегид ареш. Инкубировать подвеску в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
11. Повторите шаг 3,5 дважды, каждый раз, когда повторное приостановление гранулы в 0,5 мл 3% BSA в 1x PBS.
12. Повторите шаг 3.5, затем приостановите клеточные гранулы в 100 Л Л 0,1% Сапонина Раствор. Инкубировать подвеску в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
13. Повторите шаг 3.5, затем resuspend клеточной гранулы в 100 л 0,1% Сапонин Раствор, содержащий 0,5 мкг анти-gp100 кролика антитела, 0,5 мкг кролика антифибробласт-специфического белка 1 (FSP1) антитела и 0,025 мкг мыши анти-Цитокератин 14 (K14) антитела. Инкубировать подвеску на 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как антитела K14 были приобретены предварительно конъюгированные Alexa Fluor 647, антитела gp100 и FSP1 были спряжено к CF 555 и CF 488, соответственно. На этом этапе следует также начать окрашивание контрольных популяций. Популяции контрольно-клеточных элементов должны быть изолированы от культуры и обработаны, как описано в шагах 3.5-3.12.
14. Повторите шаг 3.11 дважды, чтобы удалить любые несвязанные антитела.
15. Повторите шаг 3.5, затем resuspend клеточной гранулы в 200-400 л 3% BSA в 1x PBS.
16. Передайте клеточный раствор через 40 мкм ячейки ситечко в 5 мл полистирола круглого дна трубки и анализировать напряженные клетки по потоку цитометрии.

Результаты

Мужчины и женщины C57Bl/6J мышей были усыплены в послеродовые дни 0-4 и усеченной кожи был подвергнут механической диссоциации, как описано выше. После измельчения, кожа формируется вязкой суспензии не хватает каких-либо признаков структурных тканей. Центругирование этой суспензии привело...

Обсуждение

Культура in vitro первичных меланоцитов и фибробластов привела к значительным достижениям в нашем понимании биологии кожи и болезней. Этот протокол улучшает предыдущие методы изоляции меланоцитов за счет сокращения времени и технической смекалки, необходимой для создания последователь...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100