הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.

Abstract

פגמים בטיפול בפיברולגון או בתפקוד מלנוציט קשורים למחלות עור, כולל תפקוד המכשול המסכן, ריפוי בפצע פגום, פגמים בפיגמנטציה וסרטן. חיוני להבנה ולנאום של מחלות אלו הם ניסויים בתרבויות היסוד בגידולים ובתרביות מלנוציט. עם זאת, הפרוטוקולים הנוכחיים עבור בידוד מלנוציט דורשים כי שכבות באפידרמיס העורי של העור הם טריסינטזציה ומנותק ידנית. תהליך זה הוא זמן רב, טכנית מאתגרת ותורמת התפוקה לא עקבית. יתר על כן, שיטות לייצר בו תרבויות טהור העור מאותו דגימת רקמות אינם זמינים בקלות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור בידוד המלנוציטים והפיברוהכדורים מהעור של העכברים ביום לאחר הלידה 0-4. בפרוטוקול זה, העור השלם הוא הומוגניים מכנית באמצעות מסוק רקמה ולאחר מכן מתעכל בקצרה עם הקולגן וטריפסין. אוכלוסיות תאים מבודדות אז באמצעות ציפוי סלקטיבי ואחריו טיפול G418. הליך זה מביא התשואות עקבית מלנוציט ופיברוהפיצוץ מעכבר בודד פחות מ 90 דקות. פרוטוקול זה גם מדרגי בקלות, ומאפשר לחוקרים לעבד כפות גדולות של בעלי חיים ללא עלייה משמעותית בזמן. אנו מציגים באמצעות שימוש בהערכות הסייטוטומטריות שתרבויות שהוקמו באמצעות פרוטוקול זה מועשר במידה רבה עבור מלנוציטים או פיברוהריות.

Introduction

העור הוא איבר רב שכבתי המגן על הגוף מפני פתוגנים זרים והקרנה אולטרה סגולה (UVR). העור גם משחק תפקיד קריטי הומסטטי תהליכים כגון ריפוי הפצע, בקרת טמפרטורה וויטמין D הפקה^1,2,3. העור של המיונקים מורכב משלושה סוגי תאים עיקריים: מלנוציטים, פיברונוציטים ו keratinocytes. אלה סוגי תאים לאכלס שכבות שונות של העור, עם keratinocytes ממציא את האפידרמיס, הגידולים המתגוררים בתוך דרמיס ו מלנוציטים לקשר באפידרמיס העור וזקיקי השיער⁴. כאן, אנו מפרטים הליך פשוט המאפשר את הדור המקביל של התרבויות הראשיות מלנוציט ופיברובלסט מעור מורלין.

מלנוציטים הם תאים המייצרים פיגמנט נמצא במקומות רבים ברחבי הגוף האנושי, כולל האפידרמיס הבזליים, איריס, שבלול, המוח וזקיקי השיער⁵. הפונקציה העיקרית של מלנוציטים היא לייצר ולהפריש מלנין המכילים שלפוחיות בשם מלאנוזומים^5,6. מלאנוזומים מכילים שני מחלקות עיקריות של מלנין: מלנין חום/שחור וצהוב/בצבע אדום-פאומאלאנין^6,7. תהליכים ביוכימיים בתוך המליוציט מווסת את השפע היחסי של כל מיני מלנין ומסייעים לקבוע את צבע השיער, העור והעין^8,9. מלנין משמש גם לקלוט UVR ולהגן על רקמות חשופות השמש מ מוטגנזה¹⁰.

תפקוד מלנוציט יכול לגרום לפגמים פיגמנטרים ולהגדיל את הרגישות לסרטן העור. לדוגמה, העור hyper-פיגמנט מאפיין המאפיינים של מלזמה הם תוצאה של ייצור overproduction מלנין מוקד, ואילו germline מוטציות גנטיות אשר להתפשר על גנים מעורב סינתזה מלנין להוביל לבקנות^11,12 . ידע אינטימי של ביולוגיה של מלנוציט נדרש לפתח אסטרטגיות שיתקנו פגמים פיגמנטרים כאלה ובסופו של דבר לשפר את הרווחה הפסיכופסיכו של אנשים הנגועים במחלות אלה. להגרעונות בייצור מלנין ו/או הסינתזה המוועדף של פאנדואנאין משויכים גם לסרטן העור מוגבר סיכון¹⁰. סיכון זה הוא האמין תוצאה של הגנה מופחתת uvr^6,13. כך, שיטות לשפר או לשחזר הייצור האומלנין במלנוציטים עשוי להפחית את השכיחות של סרטן העור באוכלוסיות אלה.

מססניקל פיברולליים לבסס את רקמת החיבור ואת התמיכה המבנית עבור כל אברי הגוף, כולל השכבה העורי של העור¹⁴. הפרשה של חלבונים כגון קולגן, אלסטין, למינציה ו fibronectin לאפשר פיברוהפיצוצים כדי ליצור את מטריקס מסחטות (ecm) כי הוא חיוני עבור שלמות רקמות^1,14. פיברותקיעות גם לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים כגון ריפוי הפצע, דלקת, אנגיוגנזה והיווצרות סרטן/התקדמות^1,15,16.

בדומה למלנוציטים, פגמים בהפעלת פיברובלסט ובתפקוד יכולים לקדם את המחלה בטווריגנזה ובמחלות. לדוגמה, הפעלה בלתי הולמת פיברוהפיצוץ מוביל בדרך כלל להיווצרות פיברוזיס, וכתוצאה מכך ההצהרה המשופרת של רכיבי ECM עודף לתוך הרקמה הסובבת. כמו הפיברותקיעות לשמור על הרבה של הגוף שלמות מבנית, פיברוזיס מקדם מחלות המשפיעות על רקמות ואיברים רבים, כולל פיברוזיס הריאות אידיופטית, טרשת מערכתית, שחמת הכבד ופיברוזיס של הלב¹⁵. פיברותקיעות גם לשחק תפקיד קריטי בסרטן¹⁶. סרטן הקשורים לפיברותקיעות (CAFs) הם התאים הנפוצים ביותר שאינם ממאירים ב מיקרוסביבה של גידולים רבים. CAFs הוכחו לקדם התפשטות הגידול, התקדמות ההתנגדות הטיפולית על ידי קשיות רקמות מאופייגטיים, הייצור cy, המקומי ותפקוד החיסון¹⁶.

תרביות תאים ראשוניים לספק חוקרים עם מודלים מגנטי מגנטית לזהות ולהמתיק פגמים מלנוציט ופיברובלסט המובילים למחלות. עם זאת, שיטות נוכחיות להקמת תרבויות מלנוציט הן זמן רב ומאתגרות באופן טכני. הצורך בטריסיזציה והפרדה עדינה של האפידרמיס והדרסטיות תורמת לשונות בתפוקה הניסיונית ומקשה על ביצוע ניסויים בקנה מידה גדול. יתר על כן, הפרוטוקולים לבידוד בו הפיברוציטים מעור שלם חסרים כרגע בשדה.

פיתחנו שיטה כדי להפחית את שלבי העיבוד, השונות והזמן הנדרש כדי ליצור תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מאותה דגימת עור כולה. באמצעות שיטת הומוקות מכנית ולאחריה עיכול קצר, האסטרטגיה שלנו מקטינה באופן משמעותי את כמות הידיים על הזמן הנדרש כדי לבודד את המלנוציטים הראשוניים תוך הפיכת בידוד פיברופיצוץ במקביל. מהירות מוגברת, יעילות ועקביות של פרוטוקול זה, בשילוב עם היכולת לבודד מלנוציטים מ 0-4 ביום העכברים הישנים, מספק לחוקרים את הגמישות לבצע מגוון רחב יותר של ניסויים מאשר אפשרי בעבר.

Protocol

קבל אישור מוועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים לפני שאתה מתחיל את זה או כל מחקר אחר המעורב בבעלי חיים. ניסויים שבוצעו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת אוהיו (IACUC, פרוטוקול2012A00000134).

1. הכנה לפרוטוקול

הערה: הוראות הכנה הכימית הבאות מתאימות לדור של 9 ס מ² תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מעכבר אחד. עיין במדריך להכנה מגיב בטבלה 1 לצורך הדלצות בקנה מידה גדול יותר.

1. להכין 1.5 mL של הפתרון קולגן המכיל 50 μg/mL קולגן בשנת 0.1 חומצה אצטית קרחוני.
2. בארון זרימה למינארי, מעיל אחד טוב של צלחת התרבות 6-היטב עם 8 μg/cm² (1.44 ML) קולגן פתרון. ודא כי הבאר מכוסה לחלוטין על ידי פתרון קולגן. מודחת את המנה ב-37 ° c למשך 3 שעות או ב -4 ° c בלילה. לפני השימוש, לשטוף את הקולגן מצופה היטב פעמיים עם 1.35 mL של מלוחים סטרילית פוספט באגירה (PBS) (150 μL של PBS לכל 1 ס מ²).
3. להרכיב את המסוק רקמות בארון זרימה למינארי על ידי הצבת בזהירות דיסק חיתוך על פלטפורמת המסוק הרקמה ואבטחת להב סטרילי לזרוע ההזזה.
4. להכין 3 mL של 1 x אנטיביוטי/Antimycotic פתרון על ידי דילול 100x אנטיביוטי/Antimycotic מניות פתרון ב-PBS סטרילי.
5. הכינו 3 מ ל של מאגר עיכול טרי העור המכיל 10% סרום של שור עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין פתרון, 1% L-גלוטמין, 10 מ"ג/ml קולגן מסוג i, 0.25% חזירי טריפסין ו 0.02 mg/ml deoxyribonuclease i ב RPMI 1640.
6. הכינו 6 מ ל של מדיה מלנוציט טרי המכיל 10% סרום של שור עוברי, 7% סרום הסוס, 1% פניצילין/סטרפטומיצין פתרון, 1% L-גלוטמין, 0.5 mM די בוטיל מחזורי המגבר (dbcAMP), 20 ננומטר כולרה 13-אצטט (הסברתי) ו 200 pM כולירה טוקסין (CT) ב מזון מיקס F-12. התקשורת של האם
   הערה: מרוכז dbcAMP, הסברתי ו-CT פתרונות מניות ניתן לעשות, מצוטט ומאוחסן עבור > 1 שנה ב-80 ° c. מדיית בסיס החסרה רכיבים אלה, יכולה להיות מאוחסנת עד חודש אחד ב-4 ° c.
7. הכינו 4 מ ל של מדיה פיברובלסט המכיל 10% סרום של שור עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין ב בינוני הנשר של דולבקה שונה. ניתן לאחסן מדיה זו ב-4 ° צ' עד לחודש אחד.
8. הכינו 40 mL של 4% הפתרון פאראפורמלדהיד על ידי דילול 16% פאראמפורמלדהיד ב PBS. אחסן כל עודף ב -4 ° c במשך חודש או עד 20 ° c עד שנה אחת.
9. הכינו 1% סאפונין פתרון מניות על ידי ערבוב 0.5 g של סאפונין ב 50 mL של PBS ב 37 ° צ' עד סאפונין יש התפרקה לחלוטין. לחטא את הפתרון לאחסון לטווח ארוך באמצעות מזרק 50 mL מצויד במסנן 0.2 יקרומטר-PES. את הפתרון המתקבל סאפונין מניות ניתן לשמור ב 4 ° צ' עבור 1 חודש.
10. להכין 200 μl של 0.1% סאפונין פתרון לכל העכבר על ידי דילול 1% סאפונין פתרון מניות ב-PBS המכיל 3% בסרום שור אלבומין (bsa).
11. הכינו 1 מ ל של פתרון הכדאיות על ידי דילול 1 μL של לתקן את היכולת לתקן הכדאיות 1 מ ל של PBS.

2. בידוד מלנוציט ופיברובלסט

1. המתת חסד 0 ל -4 ביום זכר ו/או נקבה C57Bl/6J כלבלבים על ידי עריפת ראש ולהסיר את הגפיים מן העכברים מורדמים באמצעות מספריים כירורגי.
2. בארון זרימה למינארי, התגלגל בקצרה את תא המטען של כל עכבר בצלחת פטרי סטרילית המכילה 70% אתנול. הסירו את הגזע מהאתנול והניחו אותו לצלחת פטרי ריקה וסטרילית.
3. באמצעות מספריים כירורגית, מעוקר ב 70% אתנול, לעשות חתך בעור בצד הגחוני של הגזע החל מהצוואר אל הזנב. לקלף את העור מתוך תא המטען של העכבר באמצעות מלקחיים סטרילי.
4. מניחים את העור דרמיס למטה במנה 6-היטב המכיל 3 מ ל של 1x אנטיביוטי/Antimycotic פתרון ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2-3 דקות.
5. הפעל את מסוק הרקמה עם ההגדרות הבאות במקום: עובי פרוסה: 1 μm; כוח להב: ~ 60% מהמקסימום; מהירות: ~ 50% של המקסימום.
6. להעביר את העור, דרמיס בצד למטה, אל הדיסק המסוק סטרילי הנייר ולהעביר את העור לחלוטין דרך המסוק רקמות שהופעלו 3 פעמים.
7. להעביר את העור הומוגניים כדי סטרילי, 15 מ"ל שפופרת חרוט המכיל 3 מ ל של מאגר עיכול העור. מערבבים את ההשעיה שנוצר על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10-15 פעמים עם מיקרופיפטה P1000.
8. Cap שפופרת חרוט ו מודטה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עבור 15 דקות, היפוך הצינור כל 3-5 דקות.
9. גלולה את התאים בעור המגון אכלו על ידי תפרידו את צינור חרוט ברוטור דלי מנופף ב 750 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. באמצעות P1000 מיקרופיפטה, לאט לחלוטין להסיר את מאגר העיכול העור להיזהר לא להפריע את הגלולה.
    הערה: חלק של עור שלם ניתן לשמור בשלב זה ומשמש כפקד עבור שלב 3: אישור של טוהר הסלולר. מסננים תאים אלה באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר ולאחר מכן להתחיל בשלב 3.5 לעיבוד נוסף.
11. השעיית מחדש ביסודיות את הגלולה הסלולרית ב-1 מ ל של מלנוציט מדיה על-ידי ליטוף למעלה ולמטה 15-20 פעמים עם מיקרופיפטה P1000. הוסף את פתרון התאים המתקבל dropwise לבאר בלתי מצופה של מאכל 6-טוב המכיל 1 מ ל של מלנוציט מדיה.
12. מניחים את העור מצופה הומוזה בחממה תרבית רקמה להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO_2. לאפשר לתרבויות לדגירה עבור 40 דקות.
    הערה: במהלך הזמן הזה, כמה התקיעות בעור המגון לאכול יהיה לדבוק במנה הבלתי מצופה בעוד המלנוציטים ו keratinocytes נשארים בהשעיה.
13. העבר את התרבות supernatant מן המנה הבלתי מצופה לבאר אחת של מראש שטף, קולגן מצופה מאכל 6-היטב. הוסף G418 למדיה כגון הריכוז הסופי הוא 100 ng/mL.
14. הוסף 2 מ ל של מדיה פיברובלסט לבאר אחת של המנה הבלתי מצופה, כיום המכיל פיברופפיצוצים.
15. דגירה שתי התרבויות לילה בחממה תרבות רקמה להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
16. בנפרד מולף את התקשורת ואת כל הפסולת מכל תרבות, 16-24 h לאחר ציפוי. לשטוף כל מנה פעמיים עם 1 מ ל של ה-PBS סטרילי, ולאחר מכן להוסיף 2 מ ל של מדיה טריים מלנוציט בתוספת 100 ng/mL G418 לתרבות מלנוציט 2 מ ל של מדיה פיברובלסט טרי לתרבות פיברובלסט.
17. לאחר התרבויות מלנוציט טופלו עם G418 h, 48 לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ ל של PBS סטרילי ולהוסיף 2 מ ל של מדיה מלנוציט טרי מבלי G418 לתרבות.
    הערה: כאשר הגידול בתרבות המללנוציט ממשיך למות ביטול הטיפול post-G418, לשטוף את התבשיל עם ה-PBS הסטרילי כדי להסיר תאים מתים ולהוסיף מדיה מלנוציט טרייה. בתרבויות מלנוציט ו פיברובסט יש להיות בגיל כאשר הם מגיעים 70-80% השטף.

3. אישור לטוהר הסלולר

1. מנושף את התקשורת מכל תרבות ושוטף בזהירות כל מנה עם 1 מ ל של הערוץ הסטרילי.
2. הוסיפו 0.7 mL של 0.25% טריפסין לכל תרבות ומודחלת את התרבויות בטריפסין ב-37 ° צ' ו -5% CO₂ עבור 1 דקות.
3. באמצעות ליטוף הטריפסין בתחתית המנה באמצעות מיקרופיפטה P1000.
4. הוסיפו 0.7 מ ל של המדיה המתאימה לכל התרבויות הטריסידיות, והעבירו את פתרון התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 750 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר ולמחוק את supernatant באמצעות P1000 מיקרופיפטה.
   הערה: שלבים 3.1-3.5 ניתן להשתמש לעבר תרבויות מלנוציט ופיברובלסט. את הגלולה כתוצאה יש להשעות מחדש את המדיה המתאימה ומושם חדש, לא מצופה (פיברותקיעות) או מראש, מצופה קולגן (מלנוציטים) הצלחת.
6. השהה מחדש את הגלולה ב0.5 מ ל. של הערוץ הקרח הקר
7. לספור ולהעביר 500,000 תאים לצינור טרום מקורר 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
8. חזור על שלב 3.5 ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-100 μL של פתרון הכדאיות. מכבית את המתלה לתא במשך 30 דקות ב -4 ° c בחשיכה.
9. חזור על שלבים 3.5-3.6 פעמיים.
10. חזור על השלב 3.5, ואז לתקן את התאים על ידי השעיית הגלולה ב 100 μL של קרח קר 4% הפתרון פאראפורמלדהיד. מודקון את ההשעיה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
11. חזור על שלב 3.5 פעמיים, בכל פעם השעיית מחדש את הגלולה ב 0.5 mL של 3% BSA ב-1x PBS.
12. חזור על שלב 3.5, לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה התא ב 100 μL של 0.1% Saponin פתרון. מודקון את ההשעיה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
13. חזור על שלב 3.5, לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה תא ב 100 μL של 0.1% Saponin פתרון המכיל 0.5 μg של הארנב anti-gp100 נוגדן, 0.5 μg של ארנב אנטי פיברוסט ספציפי חלבון 1 (FSP1) נוגדן ו 0.025 μg של העכבר נגד ציטוקרטין 14 (K14) נוגדן. . בטמפרטורת החדר בחשיכה
    הערה: בעוד את הנוגדן K14 נרכש מראש מעלה מעלה לאלקסה Fluor 647, gp100 ו FSP1 נוגדנים היו מצוקדים ל-CF 555 ו CF 488, בהתאמה. כתמים של אוכלוסיות השליטה צריך גם להתחיל בשלב זה. יש לבודד אוכלוסיות תאים מהתרבות ולעבד אותן כמתואר בשלבים 3.5-3.12.
14. חזור על שלב 3.11 פעמיים, כדי להסיר נוגדן לא מאוגד.
15. חזור על שלב 3.5, לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה התא ב 200-400 μL של 3% BSA ב-1x PBS.
16. להעביר את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא 40 יקרומטר לתוך 5 מ ל פוליסטירן מוקצף עגול-התחתון ולנתח את התאים המתוחים על ידי לזרום cy, לנסות.

תוצאות

עכברים זכר ונקבה C57Bl/6j הורדמים על ימים לאחר הלידה 0-4 ואת העור עזרתי היה נתון דיסוציאציה מכנית כמתואר לעיל. לאחר החיתוך, העור יצר מחסור צמיגי חסר כל סימן לרקמה מבנית. הצנטריפוגה של המשקע הביא להיווצרות מיכל תא גדול בתחתית הצינורית החרוטית ושכבת אדיפוז שצפה בראש הסופרנטאנט. שכבת האדיפוז הזאת ...

Discussion

התרבות החוץ-גופית של המלנוציטים והפיברומוטיות הראשונית הובילה להתקדמות משמעותית בהבנת הביולוגיה והמחלות של העור. פרוטוקול זה משתפר בשיטות הבידוד הקודמות של מלנוציט על-ידי הפחתת הזמן והניסיון הטכני הדרושים ליצירת תרבויות מלנוציט עקביות תוך התרת הבידוד הסימולטני של העור. רומן, חסכון בזמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100