Modelo murino de estenosis venosa central usando fístula aortocaval con una estenosis de salida

Resumen

Una fístula aortófica fue creada perforando la aorta renal murina a través de ambas paredes en la vena cava inferior y fue seguida por la creación de una estenosis en su salida a través de la ligadura parcial de la vena cava inferior. Este modelo reproducible se puede utilizar para estudiar la estenosis venosa central.

Resumen

La estenosis venosa central es una entidad importante que contribuye a la insuficiencia de la fístula arteriovenosa (AVF). Un modelo de AVF murino fue modificado para crear una ligadura parcial de la vena cava inferior (IVC) en la salida de la fístula, imitando la estenosis venosa central. Se introducen aspectos técnicos de este modelo. La aorta y la CIV se exponen, después de una incisión abdominal. La aorta infrarrenal y la CIV se diseccionan para la sujeción proximal, y la aorta distal está expuesta para la punción. El CIV en el punto medio entre la vena renal izquierda y la bifurcación aórtica se disecciona cuidadosamente para colocar un 8-0 sutura debajo de la CIV. Después de sujetar la aorta y la CIV, se crea un AVF punzándose la aorta infrarrenal a través de ambas paredes en el CIV con una aguja de 25 G, seguido de ligar un catéter intra-venoso (IV) de 22 G y un IVC juntos. Luego se retira el catéter, creando una estenosis venosa reproducible sin oclusión. La aorta y la CIV no se sujetan después de confirmar la hemostasis primaria. Este novedoso modelo de estenosis venosis central es fácil de realizar, reproducible y facilitará los estudios sobre el fallo de la AVF.

Introducción

Las fístulas arteriovenosas (AVF) son los accesos más comunes para la hemodiálisis, con una latencia superior y una infección reducida en comparación con otros accesos como injertos o catéteres venosos centrales. Sin embargo, hasta el 60% de AVF no puede madurar^1,2,3; una revisión sistemática reciente informó que las tasas de paciencia primaria en 1 año fueron sólo 60%⁴. La estenosis a lo largo de la salida venosa causa predominantemente el fracaso de la maduración de la AVF^5,6. Hay ciertos lugares característicos propensos a la estenosis proximal a la fístula: el segmento de oscilación yuxtaanastomotica para la fístula radiocéfala, la región del arco cefálico para la fístula braquiocéfala y la vena central de la fístula con catéteres subclavistas ipsilaterales colocados o venas yugulares internas^7,8.

La estenosis venosa central es a menudo asintomática en pacientes sin AVF, pero puede causar edema ipsilateral en las extremidades porhipertensión venosa, así como fracaso de la maduración de la fístula cuando se le reta por el flujo de fístula 9. La fisiopatología de la estenosis venosa central probablemente está relacionada con la inflamación y la cascada de coagulación activada después de la colocación del dispositivo. Además, el movimiento constante de la punta del catéter, así como el aumento del flujo de la fístula pueden alterar la tensión de cizallamiento, lo que resulta en la deposición plaquetaria y el engrosamiento de la pared venosa¹⁰. Para entender los mecanismos básicos subyacentes a la falla de AVF causada por la estenosis venosa central, se requiere un modelo animal que imita la estenosis venosa central con un AVF.

Hemos establecido un modelo de fístula aortocaval murino que es fácil de realizar y dominar y recapitula el curso clínico de AVF humana. ¹¹ Aplicamos los conceptos y la técnica de varios modelos murinos previamente establecidos para crear un modelo de AVF murino novedoso con estenosis venosa. Introducimos un modelo de fístula de aortocaval murino con una estenosis IVC en la fístula de salida que se puede utilizar para el estudio de la estenosis venosa central.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC).

1. Anestesia y procedimientos preoperatorios

1. Esterilice todos los instrumentos y materiales quirúrgicos mediante autoclave. Encienda el dispositivo de soporte térmico para estar seguro de que está caliente (40-42 oC).
2. Coloque un ratón C57BL/6 de 9-11 semanas en una cámara de inducción de acrílico y anestetizarlo con isoflurano vaporizado al 2,5% y oxígeno de 0,8 L/min. La inducción de la anestesia toma alrededor de 3 min.
3. Retire el ratón de la cámara. Confirme un plano profundo de anestesia con un pellizco de dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del día, un pellizco para la oreja y un pellizco de cola. Coloque el ratón en posición supina en el área quirúrgica y entregue un 2,5% de isoflurano con mascarilla de silicona. Proporcionar buprenorfina a 0,1 mg/kg analgésico y aplicar pomada oftálmica a los ojos.
4. Retire el pelaje del lado ventral del cuello hasta la parte inferior del abdomen usando Nair, un removedor de pelo.
5. Limpie y desinfecte el sitio quirúrgico utilizando un exfoliante de dos pasos con 10% de povidona-yodo y 70% de isopropanol. Aplique una cortina quirúrgica.

2. Procedimientos operativos

1. Exposición de los sitios de abrazaderas y punción
   1. Preparar instrumentos estériles y usar guantes estériles para mantener la esterilidad durante toda la cirugía.
   2. Haz una incisión abdominal de línea media profunda en la piel con un bisturí desde el nivel del borde inferior del hígado hasta justo por encima del pubis. Cortar a través de la musculatura con tijeras para abrir la cavidad abdominal.
   3. Inserte un retractor en el abdomen y tire de los intestinos hacia el lado derecho. Manténgalos húmedos envolviéndolos en una gasa empapada de salina. Retreive la vejiga y las vesículas seminales (en ratones machos) y sáquelas al lado caudal. Diseccionar el mesenteria entre el recto y el retroperitoneo con un soporte de microaguja para obtener una vista completa de la aorta y la CIV.
   4. Dissección de la aorta infrarrenal y la CIV en bloque de los tejidos retroperitoneales laterales y dorsales circundantes con un soporte de microaguja para coirlos.
   5. Diseccionar los tejidos circundantes para exponer el sitio de la punción aórtica a aproximadamente tres cuartas partes de la distancia desde la vena renal izquierda hasta la bifurcación aortica.
2. Disección de CIV
   1. Diseccionar entre la CIV infrarrenal y la aorta inmediatamente distal a la vena renal izquierda. Extienda la disección de forma distal a la mitad entre la vena renal izquierda y la bifurcación aórtica, de modo que la CIV infrarrenal, tanto aguas arriba como aguas abajo de la estenosis, se pueda observar postoperatoriamente.
      NOTA: La disección contundente entre la CIV y la aorta se debe realizar de forma inmediata distal a la vena renal izquierda, donde el tejido conectivo entre la CIV y la aorta está relativamente suelto.
   2. Haga una ventana para separar el CIV de la aorta en ese nivel y diseccionar el ICV del tejido circundante. Coloque un 8-0 sutura monofilamento de poliamida en primer lugar debajo de la IVC y la aorta (Figura1A),luego coloque la sutura debajo solamente de la IVC (Figura 1B) tirando del extremo de la sutura a través de la ventana.
      NOTA: Dado que el CIV es frágil, disecting a lo largo de la aortica es útil para hacer una ventana para evitar que el CIV, así como pequeñas iVC o ramas aórticas se dañen. Si se produce sangrado, es probable que sea incontrolable. Si el CIV tiene ramas laterales distintas, coloque un 8-0 sutura discada a las ramas.
3. Creación de AVF
   1. Doble una aguja de 25 G en un ángulo de 45-60o en un punto de 4 mm desde la punta de la aguja.
   2. Sujete la aorta infrarrenal y la CIV aplicando un clip microquirúrgico.
   3. Gire la aorta medialmente y caudalmente agarrando el tejido conectivo que rodea la bifurcación para exponer el sitio de punción de la aorta estirado ligeramente al lado ventral.
   4. Sosteniendo la aorta en una posición adecuada, perforar a través de la aorta en el IVC utilizando la aguja preparada de 25 G (Figura1C).
   5. Suelte la aorta y cubra el lugar de la punción con el tejido circundante tirando hacia arriba desde el lado izquierdo de la aorta. Saque la aguja y presione suavemente el sitio de la punción con un hisopo con punta de algodón para la hemostasis.
4. Creación de la estenosis del CIV
   1. Coloque una punta de un catéter de 22 G IV (ver la Tabla de Materiales)sobre el IVC longitudinalmente. Ligar el catéter IV y iVC junto con un 8-0 sutura (Figura1D)y, a continuación, retire el catéter IV.
   2. Confirme la hemostasis primaria (Figura1E) y luego desenganche la aorta y la CIV. Cubra el lugar de la punción 1 min más para asegurar la hemostasis.
      NOTA: No apriete demasiado tiempo para evitar la trombosis IVC distal a la estenosis.
   3. Devolver los órganos a sus posiciones originales y cerrar el abdomen con 6-0 suturas.

3. Procedimientos postoperatorios

1. Después del cierre de la herida abdominal, interrumpa la inhalación de isoflurano. Coloque el ratón en una jaula individual sin ropa de cama y coloque la jaula en un dispositivo de soporte térmico para evitar la hipotermia.
   NOTA: El ratón se observa hasta que logran y mantienen la recumbencia esternal. Aplicar atención postoperatoria incluyendo analgesia y cuidado de heridas de acuerdo con las recomendaciones de la IACUC local. Para la analgesia utilizamos buprenorfina a 0,1 mg/kg por vía intrasmuscular cada 12 h durante 48 horas siguiendo los procedimientos quirúrgicos y posteriormente según sea necesario.
2. Confirme la patencia de AVF postoperatoria mediante el ultrasonido Doppler (consulte la Tabla de materiales). Además, mida otras características de recipiente y flujo según sea necesario.

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Resultados

Los ratones machos se sometieron a la operación mencionada anteriormente para crear un AVF y una estenosis de CIV. Los ratones de control sólo se sometieron a laparotomía y disección de los tejidos que rodean el CIV, por ejemplo, un procedimiento falso, o sólo la creación de una estenosis de CIV sin la creación simultánea de un AVF.

El IVC se observó con ultrasonido Doppler el día 7 después del procedimiento quirúrgi...

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Discusión

El modelo aFIA murino se ha utilizado para estudiar los mecanismos básicos y los eventos moleculares que conducen a la maduración de la AVF^13,14. En este estudio, modificamos un modelo aVF murino establecido para crear un modelo de fístula aortocaval murino novedoso con una estenosis IVC en el tracto de salida de la fístula. Nuestro modelo de ligadura es similar a varios modelos murinos descritos anteriormente que utilizan ligadura vascular. Se creó un model...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-60 Mhz scan head	VisualSonics Inc.	RMV-704
8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle	AROSuture	T06A08N14-13	polyamide monofilament sutures
Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H	VetEquip	941444
Isoflo, Isoflurane liquid	Zoetis	26675-46-7
Mice, C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
Pet Bed Microwave Heating Pad	Snuggle Safe	6250
PrecisionGlide Needle 25G	BD	305122
Surflo I.V. Catheter 22G	Terumo	SR-OX2225CA	0.85mm outer diameter
Vascular clamp	Roboz Surgical Instrument	RS-5424
Vevo770 High Resolution Imaging System	VisualSonics Inc.	770