Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente

Resumen

El SUMO es una proteína modificadora de ubiquitina, esencial y muy conservada. En este protocolo Describimos el uso de una proteína de captura de SUMO recombinante con tolerancia al estrés (kmUTAG) para visualizar conjugados de SUMO nativos, sin etiquetar y su localización en una variedad de tipos de células.

Resumen

Aquí presentamos un método novedoso para estudiar la sumoyación de las proteínas y su localización subcelular en las células de mamíferos y los nematodos ovocitos. Este método utiliza un fragmento de proteína de captura de SUMO modificado recombinante, kmUTAG, derivado de la proteasa de SUMO Ulp1 de la levadura en ciernes tolerante al estrés Kluyveromyces marxianus. Hemos adaptado las propiedades del kmUTAG con el fin de estudiar la sumoyación en una variedad de sistemas modelo sin el uso de anticuerpos. Para el estudio de SUMO, KmUTAG tiene varias ventajas en comparación con los enfoques basados en anticuerpos. Este reactivo de captura de SUMO tolerante al estrés se produce de forma recombinante, reconoce isoformas de SUMO nativos de muchas especies y, a diferencia de los anticuerpos disponibles comercialmente, muestra una afinidad reducida para el SUMO libre y no conjugada. Los resultados representativos que se muestran aquí incluyen la localización de los conjugados de sumo en las células de cultivo de tejidos de mamíferos y los nematodos ovocitos.

Introducción

El propósito de este método es facilitar el estudio y análisis de las proteínas conjugadas por el SUMO usando la proteína UTAG ( etiquetade dominioULP) recombinante de sumo-atrapante. Como se detalla a continuación, UTAG se puede utilizar en lugar de otros reactivos y enfoques para purificar, detectar y visualizar las proteínas de SUMO modificado. Dependiendo de las condiciones de crecimiento, las células pueden contener cientos o miles de proteínas que se modifican con las cadenas SUMO o SUMO (para revisión ver Kerscher et al. 2006¹ y kerscher 2016²). Esto representa una dificultad considerable para los análisis funcionales de proteínas específicas de SUMO modificado, especialmente porque sólo una fracción de un objetivo de sumoyación en particular se modifica realmente³. Además de sus funciones en procesos celulares esenciales como la regulación transcripcional, la homeostasis proteica, la respuesta al estrés celular, y la remodelación de la cromatina durante la la mitosis y la meiosis; ahora se ha vuelto suficientemente claro que el sumo, las proteínas modificadas por el sumo y los componentes de la vía de sumo también tienen potencial como biomarcadores para patologías como el cáncer y los trastornos neurodegenerativos^{4,5,6 ,7}. Esto subraya la necesidad de herramientas sólidas, fiables y fácilmente disponibles y enfoques innovadores para la detección y el análisis funcional de las proteínas de SUMO modificado en una variedad de células y muestras.

En muchos sistemas, los anticuerpos específicos de sumo son los reactivos de elección para la detección, el aislamiento y los análisis funcionales de las proteínas de sumo modificado^8,9. Sin embargo, algunos anticuerpos específicos de SUMO disponibles comercialmente son caros, limitados en cantidad o disponibilidad, propensos a exhibir afinidades extremadamente variables y reactividad cruzada, y en algunos casos carecen de reproducibilidad¹⁰. Un enfoque alternativo es la expresión de SUMO con etiqueta epitópica en células y organismos transformados, pero vincular las etiquetas epítopos a SUMO puede reducir artificialmente su conjugación a los objetivos proteicos¹¹. Además, los epítopos no son útiles cuando se evalúan las células o los tejidos no transformados.

Ulp1 es una proteasa SUMO conservada de S. cerevisiae que procesa el precursor de sumo y desumolates proteínas conjugadas de sumo¹². Desarrollamos el reactivo de utag basado en la observación fortuítica de que una mutación de la cisteina cisteína (C580S) en Ulp1's sumo procesamiento ULP dcrear (Ud) no sólo previene el escote de sumo sino que también atrapa las proteínas conjugadas del sumo con altos avidez¹². Para simplificar, nos hemos referido a este fragmento de Ulp1 (C580S) carboxy-terminal que atrapa el SUMO como UTAG (abreviatura de UD TAG). UTAG es una proteína de reventado de pan-SUMO recombinante que representa una alternativa útil a los anticuerpos anti-SUMO utilizados para el aislamiento y la detección de proteínas de SUMO modificado. Es importante destacar que reconoce específicamente el SUMO conjugada, doblado de forma nativa y no solo uno o varios epítopos en SUMO. Para mejorar tanto la estabilidad proteica como la fuerza de unión de SUMO de UTAG, generamos una variante de UTAG de la levadura tolerante al estrés Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG une estrechamente conjugados de SUMO con afinidad nanomolares¹³. Adicionalmente, kmUTAG es resistente a temperaturas elevadas (42 ° c), agentes reductores (5 mM TCEP-Tris (2-carboxietil) clorhidrato de fosfina), desnaturants (hasta 2 M de urea), agentes oxidantes (0,6% peróxido de hidrógeno), y detergentes no iónicos. Esta tolerancia al estrés es beneficiosa durante condiciones de purificación duras y tiempos de incubación prolongados, asegurando su estabilidad y la actividad de captura de SUMO. Sin embargo, no es de extrañar que la actividad de captura de SUMO de KmUTAG sea incompatible con los reactivos modificadores de la cisteína, los detergentes iónicos y los extractos proteicos completamente desnaturalizadas. La notable afinidad y propiedades de KmUTAG indican que este reactivo puede formar parte del repertorio estándar para el estudio de proteínas sumoiladas en múltiples especies.

Aquí proporcionamos un método simple para detectar proteínas de SUMO modificado en células de mamíferos y nematodos utilizando una proteína de fusión mCherry-KmUTAG fluorescente recombinante (kmUTAG-FL).

Protocolo

1. detección de SUMO en células de cultivo de tejido fijo utilizando proteína de captura de SUMO KmUTAG-FL recombinante

1. Crecen las células de cultivo de tejido de elección en los resbalones redondos de 22 mm en placas TC de 6-Well hasta 70% – 80% confluentes. Realice los pasos 1.2 – 1.8 en la placa de 6-well.
2. Lave brevemente las células con 1 mL de DPBS (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco)
3. Para la fijación, prepare una solución fresca de 4% de solución de paraformaldehído (PFA) (diluido en DPBS). Para fijar las células, añadir 2 mL 4% PFA en DPBS a cada pozo. Incubar las células durante 20 min a temperatura ambiente. Nota: todos los pasos con PFA deben realizarse en una campana de seguridad de laboratorio y la PFA debe desecharse correctamente.
4. Lavar las celdas fijas 3x en 1 mL de DPBS mientras se está nutando la placa, 5 min cada lavado.
5. Para permeabilizar las células, incubar durante 15 min con 0,1% Triton X-100 en DPBS
6. Lavar las células 3x en 1 mL de DPBS mientras se está nutando la placa, 5 min cada lavado
7. Incubar las células con 500 μL de 0,1 M Glycine-HCL (pH 2,0) durante 10 s, a continuación, neutralizar el pH inmediatamente con 500 μL de tampón de proteasa de SUMO 10x (SPB).
8. Lavar las células 3x en 1 mL de DPBS mientras que la placa de nutante, 5 min cada lavado
9. Retire los cubreobjetos del pozo y colóquelo en una cámara de humedad. A continuación, proceda con las incubaciones en el resguardo de la siguiente manera:
   1. Sólo para tinción UTAG-FL: mezclar 1 μg UTAG-FL con 100 μL de 1x SPB conteniendo 5 mM TCEP en un tubo, pipetear la mezcla sobre las células en el coberteo, e incubar a temperatura ambiente durante 1 h en la cámara de humedad.
   2. Opcionalmente, para la cotinción de anticuerpos UTAG-FL y anti SUMO1, proceda con lo siguiente:
      1. Mezclar en un tubo 1 μg UTAG-FL y 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (obtenido para estudios de desarrollo Hybridoma Bank⁹) con 100 μl de tampón bloqueante, pipetear la mezcla en el cubrito e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      2. Lavar las células en la portada 3 veces con 200 μL de DPBS, 5 min cada lavado.
      3. Mezclar en un tubo 0,5 μL anti-ratón Alexa Fluor 488 conjugados anticuerpo con 100 μL tampón de bloqueo, pipetear la mezcla en el coberteo, e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
10. Para lavar los cubreobjetos, pipetear 200 μL de DPBS en cada cubreobjetos y dejar en su lugar durante 10 min. Repita el lavado 2 veces más.
11. Retire el cobertor del último lavado e invertirlo en una diapositiva de microscopía prelimpiada con una gota de soporte de montaje (ver tabla de materiales).
12. Almacene durante la noche en un congelador de-20 ° c antes de verlo bajo el microscopio. Visualice utilizando los conjuntos de filtros apropiados para DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) y Alexa Fluor 488 (si se realiza la cotinción opcional SUMO2/3).

2. detección de SUMO en gónadas de nematodo fijo utilizando UTAG-FL

1. Transferir hermafroditas adultas a una gota de 8 μL de tampón de huevo¹⁴ en un portaobjetos de carga Plus que ha sido recubierto con poli-L-lisina. Suelte las gónadas de los gusanos con 27,5 G de agujas. Proceda con el etiquetado de anticuerpos o el etiquetado UTAG-FL.
2. Para muestras de etiquetado de anticuerpos, proceda de la siguiente manera:
   1. Congelar-agrietar muestras en nitrógeno líquido y luego fijar durante la noche en-20 ° c metanol en un frasco de Coplin.
   2. También en frascos de Coplin, lave los portaobjetos 3 veces en 1x PBS, luego bloquee durante 20 min en PBS conteniendo 0,5% de BSA y 0,1% Tween 20.
   3. Añadir 30 μL de anticuerpo anti-SUMO 6F2 (1:10) a cada diapositiva que cubra las muestras. Incubar durante la noche en una cámara de humedad a 4 ° c.
      Nota: SUMO 6F2 se obtuvo de los estudios de desarrollo Hybridoma Bank¹⁵.
   4. En frascos de Coplin, lave los portaobjetos durante 2 min en 1x PBS, luego cubra e incube los especímenes con 30 μL de DyLight 488 cabra-anti-anticuerpo secundario de ratón (1:200) durante 1,5 horas en una cámara de humedad a temperatura ambiente.
   5. En frascos de Coplin, lave los portaobjetos durante 2 min en 1x PBS, realice una inmersión rápida en dH₂0, y luego Monte las diapositivas con medio de montaje (ver tabla de materiales).
3. Para el etiquetado KmUTAG-FL, proceda con lo siguiente:
   1. Para fijar las células, añadir 1 volumen de 8% PF a las muestras para una concentración final de 4% PF. Fije durante 10 min en una cámara de humedad y luego apague la reacción transfiriendo diapositivas a un frasco de Coplin que contenga 1x PBS con 0,1 M de glicina durante al menos 5 min.
   2. En frascos de Coplin, lave las células durante 5 min en 1x PBS, luego permeabiliza las muestras en 1x PBS conteniendo 0,1% Triton-X durante 10 min.
   3. Lavar en un frasco de Coplin durante al menos 5 min en 1x PBS, luego añadir 200 μL de 0,1 M Glycine-HCl (pH = 2,0) a las muestras en la diapositiva durante 10 segundos. Añadir inmediatamente 200 μL de 10x SPB para neutralizar el pH.
   4. Lave el portaobjetos en 1x PBS en un frasco de Coplin durante 5 min.
   5. Retirar la corredera de lavado y Pipetear 100 μL de 1x SPB + 5mM TCEP conteniendo 2 μg de UTAG-FL a los nematodos en las diapositivas, e incubar en cámara de humedad durante 1 h sin balancearse.
   6. Devuelva la diapositiva al frasco de Coplin y lave durante 15 min en 1x PBS
   7. Retire la diapositiva del lavado, utilice una toallita de laboratorio para secar alrededor de la muestra y, a continuación, Monte las diapositivas con 5 μL de medio de montaje (consulte la tabla de materiales). Almacene las diapositivas a 4 ° c. Visualice el uso de los conjuntos de filtros apropiados para DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) y DyLight 488 (SUMO2/3).

Resultados

KmUTAG-FL es una proteína de captura de SUMO con etiquetas de mCherry recombinante. Para producir kmUTAG-FL, clonamos un mCherry-kmUTAG de codón optimizado en el plásmido de sobreexpresión bacteriana pSPOT1 (figura 1). Después de la inducción, la proteína kmUTAG-FL se purificó en Spot-TRAP, se elugió y se congeló hasta su uso posterior. Para garantizar la actividad de captura de SUMO de KmUTAG-FL, confirmamos la Unión a las perlas conjugadas con SU...

Discusión

Aquí presentamos el uso de kmutag-FL, una proteína recombinante, para estudios funcionales de sumo en células de mamífero fijas y gónadas de nematodos disecado. KmUTAG-FL es un reactivo específico de pan-SUMO tolerante al estrés que reconoce y atrapa las proteínas conjugadas y las cadenas de SUMO nativas del SUMO. Dado que la estructura terciaria de SUMO está muy conservada, es muy probable que las variantes de SUMO de los sistemas adicionales de modelo y no modelo puedan analizarse con el reactivo kmUTAG-FL. Co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
6-Well Cell Culture Plates	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	50-246-93)	Mounting media in step 1.11
FLUORO-GEL with DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG reagents are available on Kerafast.com
Oneblock Western-CL blocking buffer	Prometheus	20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher BioReagents	BP3994
PNT2 cell line	Sigma-Aldrich	95012613	Normal prostate epithelium immortalized with SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Antibody 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Used as a reducing agent at a concentration of 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)