Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Zusammenfassung

SUMO ist ein essentielles und hoch konserviertes, kleines, ubiquitin-ähnliches Modifikatorprotein. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines stresstoleranten rekombinanten, rekombinanten SUMO-Fantifen-Proteins (kmUTAG) zur Visualisierung von nativen, nicht markierten SUMO-Konjugaten und deren Lokalisierung in einer Vielzahl von Zelltypen.

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine neuartige Methode vor, um die Sumoylierung von Proteinen und ihre subzelluläre Lokalisierung in Säugetierzellen und Nematoden-Eizellen zu untersuchen. Bei dieser Methode wird ein rekombinant modifiziertes SUMO-Fangscheiben-Protein-Fragment, kmUTAG, verwendet, abgeleitet von der Ulp1 SUMO Protease der stresstoleranten angehenden Hefe Kluyveromyces marxianus. Wir haben die Eigenschaften der kmUTAG angepasst, um Sumoylierung in einer Vielzahl von Modellsystemen ohne Antikörper zu studieren. Für die Studie von SUMO hat die KmUTAG im Vergleich zu Antikörper-basierten Ansätzen mehrere Vorteile. Dieses stresstolerante SUMO-Fallreagenz wird rekombinant produziert, es erkennt einheimische SUMO-Isoformen von vielen Arten, und im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Antikörpern zeigt es eine reduzierte Affinität für freie, unkonjugierte SUMO. Zu den repräsentativen Ergebnissen, die hier gezeigt werden, gehören die Lokalisierung von SUMO-Konjugaten in Säugegewebekulturzellen und Nematoden-Oozyten.

Einleitung

Ziel dieser Methode ist es, die Erforschung und Analyse von SUMO-konjugierten Proteinen mit dem rekombinanten SUMO-Fallen UTAG (Ulp domainTag) Protein zu erleichtern. Wie im Folgenden beschrieben, kann die UTAG anstelle anderer Reagenzien und Ansätze zur Reinigung, Erkennung und Visualisierung von SUMO-modifizierten Proteinen eingesetzt werden. Je nach Wachstumsbedingungen können Zellen hunderte oder Tausende von Proteinen enthalten, die mit SUMO oder SUMO-Ketten modifiziert werden (siehe Kerscher et al. 2006¹ und Kerscher 2016²). Dies stellt eine erhebliche Schwierigkeit für die funktionelle Analyse bestimmter SUMO-modifizierter Proteine dar, zumal nur ein Bruchteil eines bestimmten Sumoylierungsziels tatsächlich verändert^{wird 3}. Zusätzlich zu ihren Rollen in wesentlichen zellulären Prozessen wie Transkription Regulierung, Protein-Haffinase, die Reaktion auf Zellstress und Chromatinumbau bei Mitose und Meiose; Inzwischen ist hinreichend klar geworden, dass SUMO, SUMO-modifizierte Proteine und SUMO-Pfadkomponenten auch als Biomarker für Pathologien wie Krebs und neurodegenerative Erkrankungen 4^{, 5,6 Potenzial haben. ,7}. Dies unterstreicht die Notwendigkeit robuster, zuverlässiger und leicht verfügbarer Werkzeuge und innovativer Ansätze zur Erkennung und funktionellen Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen in einer Vielzahl von Zellen und Proben.

In vielen Systemen sind SUMO-spezifische Antikörper die Reagenzien der Wahl für die Erkennung, Isolierung und funktionelle Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen 8,9^. Einige kommerziell erhältliche SUMO-spezifische Antikörper sind jedoch teuer, in der Menge oder Verfügbarkeit begrenzt, neigen dazu, völlig variable Affinitäten und Querreaktivität zu zeigen, und in einigen Fällen fehlt esan Reproduzierbarkeit 10. Ein alternativer Ansatz ist der Ausdruck von epitop getaggten SUMO in transformierten Zellen und Organismen, aber die Verknüpfung von Eitop-Tags mit SUMO^kannseine Konjugation mit Proteinzielen 11 künstlich verringern. Außerdem sind Epitope nicht sinnvoll, wenn unveränderte Zellen oder Gewebe ausgewertet werden.

Ulp1 ist eine konservierte SUMO-Protease von S. cerevisiae , die sowohl den SUMO-Vorläufer als auch die Desumoylate von SUMO-konjugierten Proteinen 12 verarbeitet. Auf der Grundlage der serviösen Beobachtung, dass eine Mutation des katalytischen Cysteine (C580S) in der SUMO-Verarbeitung von Ulp1 nicht nur die SUMO-Kalkung verhindert, sondern auch SUMO-konjugierte Proteine mit hohem Avidität¹². Aus Gründen der Einfachheit haben wir dieses Carbox-Terminal SUMO-Fallen Ulp1-C580S) als UTAG (kurz für UD TAG) bezeichnet. Die UTAG ist ein rekombinantes Pan-SUMO-Fangrettiein, das eine nützliche Alternative zu Anti-SUMO-Antikörpern darstellt, die zur Isolierung und Erkennung von SUMO-modifizierten Proteinen verwendet werden. Wichtig ist, dass es speziell einnehmend gefaltete, konjugierte SUMO erkennt und nicht nur ein oder mehrere Epitope auf SUMO. Um sowohl die Proteinstabilität als auch die SUKO-Bindungsfestigkeit der UTAG zu verbessern, haben wir aus der stresstoleranten Hefe Kluyveromyces marxianus (Km) eine Variante der UTAG entwickelt. KmUTAG bindet SUMO-konjugate eng mit Nanomolaraffinität¹³. Darüber hinaus ist kmUTAG gegen erhöhte Temperaturen (42 ° C) beständig, Reduktion von Wirkstoffen (5 mM TCEP-Tris-2-Carboxyethyl) Phosphin-Hydrochlorid), Denaturanten (bis zu 2 M Urea), Oxidationsmittel (0,6% Wasserstoffperoxid) und nicht-ionische Reinigungsmittel. Diese Stresstoleranz ist bei rauen Reinigungsbedingungen und längeren Inkubationszeiten vorteilhaft, um ihre Stabilität und SUMO-Fangtätigkeit zu gewährleisten. Es überrascht jedoch nicht, dass die SUMO-Fanging-Aktivität von KmUTAG mit zysteinmodifizierenden Reagenzien, ionischen Reinigungsmitteln und vollständig denaturierten Proteinextrakten unvereinbar ist. Die bemerkenswerte Affinität und Eigenschaften der KmUTAG deuten darauf hin, dass dieses Reagenz zum Standard-Repertoire für die Erforschung von sumoylierten Proteinen in mehreren Arten werden kann.

Hier bieten wir eine einfache Methode an, um SUMO-modifizierte Proteine in Säugetierzellen und Nematoden mit einem rekombinanten Fluoreszenz-MCherry-KmUTAG-Fusionsprotein (kmUTAG-fl) zu erkennen.

Protokoll

1. SUMO-Erkennung in festen Gewebekulturzellen mit rekombinantem KmUTAG-FL SUMO-Fangneiweiß

1. Wachsen Sie Gewebekulturzellen der Wahl auf 22 mm Rundabdeckung rutschen in 6-Well-TC-Platten bis 70% – 80% konfluent. Führen Sie die Schritte 1.2 – 1,8 in der 6-well-Platte aus.
2. Waschen Sie Zellen kurz mit 1 ml DPBS (Dulbecco es phosphatgepufferte Saline)
3. Für die Fixierung, bereiten Sie eine frische Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung (verdünnt in DPBS). Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 2 mL 4% PFA in DPBS zu jedem Brunnen hinzu. Die Zellen bei Raumtemperatur 20 Minuten lang einordnen. Hinweis: Alle Schritte mit PFA sollten in einer Labor-Sicherenhaube durchgeführt werden und PFA muss ordnungsgemäß entsorgt werden.
4. Waschen Sie die festen Zellen 3x in 1 mL DPBS, während Sie den Teller, 5 min jede Wäsche.
5. Um Zellen zu durchdringen, inkubieren für 15 min mit 0,1% Triton X-100 in DPBS
6. Waschen Sie die Zellen 3x in 1 mL DPBS, während die Nuss der Platte, 5 min jede Wäsche
7. Inkubieren Sie die Zellen mit 500 μL von 0,1 M Glycine-HCL (pH 2.0) für 10 s, dann neutralisieren Sie pH sofort mit 500 μL von 10x SUMO Protease Buffer (SPB).
8. Waschen Sie die Zellen 3x in 1 mL DPBS, während Nussplatte, 5 min jede Wäsche
9. Die Verwickeln aus dem Brunnen entfernen und in eine Feuchtigkeitskammer legen. Dann gehen Sie mit Inkubationen auf der Koppel wie folgt:
   1. Nur für UTAG-fl-Fl-Färbung: 1 μg UTAG-fl mit 100 μL von 1x SPB mit 5 mM TCEP in einem Rohr mischen, die Mischung auf die Zellen auf dem Kopplip kippen und bei Raumtemperatur für 1 h in der Feuchtigkeitskammer inkubieren.
   2. Optional für UTAG-FL und Anti-SUV 1-Antikörper-Co-Färbung, mit folgenden:
      1. Mix in einem Rohr 1 μg UTAG-FL und 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (für Developmental Studies Hybridoma Bank⁹) mit 100 μL Blockpuffer, pipette den Mix auf den Custlip, und inkubieren in Raumtemperatur für 1 h.
      2. Mit 200 μL DPBS 3 Mal Zellen auf dem Kammlip waschen, 5 min pro Wäsche.
      3. In einem Rohr 0,5 μL Anti-Maus Alexa Fluor 488 konjugierten Antikörper mit 100 μL Blocking-Puffer mischen, die Mischung auf die Koppel pipette, und inkubieren in Raumtemperatur für 1 h.
10. Um die Kverslippen zu waschen, pipette 200 μL DPBS auf jedem Coverslip und lassen Sie die Wäsche für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche 2 Mal.
11. Die Spenstift vom letzten Waschen entfernen und auf eine vorgereinigte Mikroskopie-Rutsche mit einem Tropfen Montagemedium umkehren (siehe Materialtabelle).
12. Bewahren Sie über Nacht in einem-20°C Gefrierschrank vor dem Betrachten unter dem Mikroskop. Visualisieren Sie die Verwendung der entsprechenden Filtersätze für DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl) und Alexa Fluor 488 (wenn optionale SUMO2/3-Co-Färbung durchgeführt wird).

2. SUMO-Erkennung in festen Nematoden-Gonaden mit UTAG-fl

1. Übertragen Sie erwachsene Hermaphroditen auf ein 8 μL-Tröpfchen Eierpuffer¹⁴ auf ein plus-geladenes Dia, das mit Poly-L-Lysin beschichtet ist. Relegationsgonads von den Würmern mit 27,5 G-Nadeln. Fahren Sie entweder mit Antikörper-Beschriftung oder UTAG-fl-Beschriftung.
2. Bei Antikörperkennzeichnungsproben gehen Sie wie folgt vor:
   1. Gefrierrisse Proben in flüssigem Stickstoff und dann über Nacht in-20 ° C Methanol in einem Coplin-Glas fixieren.
   2. Auch in Coplin-Gläsern, Waschen Dias für 3 Mal in 1x PBS, dann für 20 Minuten in PBS mit 0,5% BSA und 0,1% Tween 20 zu blockieren.
   3. Fügen Sie 30 μL Anti-SUMO 6F2-Antikörper (1:10) zu jedem Dia hinzu, das die Proben bedeckt. Inkubieren Sie über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer bei 4 ° C.
      NOTE: SUMO 6F2 wurde von der Developmental Studies Hybridoma Bank¹⁵erhalten.
   4. In Coplin-Gläsern 2 min in 1x PBS Wäschetrechen, dann mit 30 μL DyLight 488 Ziegen-anti-Maus-Antikörper (1:200) 1,5 Stunden lang in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur abdecken und inkubieren.
   5. In Coplin-Gläsern 2 min in 1x PBS Wäschetrechen, einen schnellen Eintauchen in dH₂0 durchführen und die Dias dann mit Montagematter montieren (siehe Materialtabelle).
3. Für die KmUTAG-fl-Kennzeichnung, gehen Sie mit folgendem:
   1. Um Zellen zu fixieren, fügen Sie 1 Volumen von 8% PF zu Proben für eine endgültige Konzentration von 4% PF. Fix für 10 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer und dann löschen Sie die Reaktion, indem Sie Dias auf ein Coplin-Glas mit 1x PBS mit 0,1 M Glycin für mindestens 5 min.
   2. In Coplin-Gläsern werden Zellen für 5 min in 1x PBS gewaschen, dann durchdringen Sie die Proben in 1x PBS mit 0,1% Triton-X für 10 min.
   3. In einem Coplin-Glas für mindestens 5 min in 1x PBS waschen, dann 200 μL von 0,1 M Glycine-HCl (pH = 2,0) für 10 Sekunden in die Proben auf dem Dia geben. Fügen Sie sofort 200 μL von 10x SPB hinzu, um den pH-Wert zu neutralisieren.
   4. Waschen Sie die Folie in 1x PBS in einem Coplin-Glas für 5 min.
   5. Entfernen Sie das Dia von der Wäsche und Pipette 100 μL von 1x SPB + 5mM TCEP mit 2 μg UTAG-fl zu den Nematoden auf den Dias, und inkubieren in Feuchtigkeitskammer für 1 h ohne Schaukeln.
   6. Die Folie zum Coplin-Glas zurückgeben und 15 min in 1x PBS waschen
   7. Entfernen Sie das Dia aus der Wäsche, verwenden Sie ein Labor wischen, um die Probe zu trocknen, und dann montieren Sie die Dias mit 5 μL Montamedium (siehe Tabelle der Materialien). Die Dias bei 4 ° C aufbewahren. Visualisieren Sie die Verwendung der entsprechenden Filtersätze für DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl) und DyLight 488 (SUMO2/3).

Ergebnisse

KmUTAG-fl ist ein rekombinantes, mCherry-getagtes SUMO-Fangning-Protein. Um kmUTAG-fl zu produzieren, haben wir eine mit Kabeljau optimierte mCherry-kmUTAG in das bakterielle Überexpression Plasmid pSPOT1 geklont (Abbildung1). Nach der Obduktion wurde das kmUTAG-Fl-Protein auf Spot-TRAP gereinigt, entleert und bis auf weiteres eingefroren. Um die SUMO-Fangtätigkeit von KmUTAG-fl zu gewährleisten, haben wir die Bindung an SUMO1-konjugierte Perlen und den Ni...

Diskussion

Hier stellen wir die Verwendung von kmUTAG-fl, einem rekombinanten Protein, für funktionelle Studien von SUMO in festen Säugetierzellen und zerlegter Nematoden-Gonaden vor. KmUTAG-fl ist ein stresstolerantes Pan-SUMO-spezifisches Reagenz, das einheimische SUMO-konjugierte Proteine und SUMO-Ketten erkennt und eingefangen. Da die tertiäre Struktur von SUMO stark konserviert ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass SUMO-Varianten aus zusätzlichen Modell-und Nicht-Modellsystemen mit dem kmUTAG-fl-Reagenz analysiert werden k...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
6-Well Cell Culture Plates	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	50-246-93)	Mounting media in step 1.11
FLUORO-GEL with DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG reagents are available on Kerafast.com
Oneblock Western-CL blocking buffer	Prometheus	20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher BioReagents	BP3994
PNT2 cell line	Sigma-Aldrich	95012613	Normal prostate epithelium immortalized with SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Antibody 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Used as a reducing agent at a concentration of 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)