Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

SUMO temel ve son derece uyumlu, küçük Ubiquitin-gibi değiştirici protein. Bu protokolde biz bir stres toleranslı rekombinant SUMO-bindirme proteini (kmUTAG) yerel, etiketlenmemiş SUMO konjugleri ve çeşitli hücre türlerinde lokalizasyonu görselleştirmek için kullanımını tarif ediyoruz.

Özet

Burada proteinlerin sumoylation ve memelide hücreler ve Nematot oositlerde alt hücresel lokalizasyonu incelemek için bir yeni yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, rekombinant değiştirilmiş bir SUMO-bindirme protein parçası, kmUTAG, stres toleranslı tomurcuklanan Maya Kluyveromyces marxianusUlp1 Sumo proteaz türetilir kullanır. Biz antikorlar kullanmadan çeşitli model sistemlerinde sumoylation okumak amacıyla kmUTAG özelliklerini adapte ettik. SUMO çalışması için, KmUTAG antikor tabanlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları vardır. Bu stres toleranslı Sumo-bindirme reaktif rekombinantly üretilir, birçok türün yerel Sumo izoformlarının tanır, ve ticari olarak mevcut antikorlar aksine ücretsiz, bilirubinin Sumo için azaltılmış yakınlık gösterir. Burada gösterilen temsili sonuçlar, memeli doku kültürü hücrelerinde ve Nematot oositlerde SUMO konjugatın lokalizasyonunu içerir.

Giriş

Bu yöntemin amacı, rekombinant SUMO-bindirme UTAG (ULP Domain Tag) proteini kullanarak Sumo-konjueli proteinlerin çalışma ve analizini kolaylaştırmaktır. Aşağıda ayrıntılı olarak, UTAG diğer reaktifler ve yaklaşımlar arındırmak, algılamak ve SUMO-modifiye proteinleri görselleştirmek yerine kullanılabilir. Büyüme koşullarına bağlı olarak, hücreler, SUMO veya SUMO zincirleri ile değiştirilmiş yüzlerce veya binlerce protein içerebilir (gözden geçirmek için bkz: Kerscher ve al. 20061 ve kerscher 20162). Bu özel SUMO-modifiye proteinlerin fonksiyonel analizleri için önemli bir zorluk temsil eder, özellikle bir sumoylation hedef sadece bir kısmı aslında değiştirilmiş beri3. Transkripsiyon düzenlemesi, protein homeostaz, hücresel stres tepkisi ve mitoz ve Meiosis sırasında kromatin remodeling gibi temel hücresel süreçlerde rollerine ek olarak; Şimdi, sumo, sumo-modifiye proteinlerin ve sumo yolu bileşenlerinin kanser ve nörodejeneratif bozukluklar gibi patolojiler için biyolojik olarak potansiyeline sahip olduğu yeterince açık hale gelmiştir4,5,6 ,7. Bu, çeşitli hücreler ve örneklerde SUMO-değiştirilmiş proteinlerin algılanması ve işlevsel analizi için sağlam, güvenilir ve kolaylıkla kullanılabilen araçlara ve yenilikçi yaklaşımlara ihtiyaç duydukları altını çiziyor.

Birçok sistemde, sumo spesifik antikorlar, sumo modifiye proteinlerin algılama, yalıtım ve fonksiyonel analizleri için tercih edilen reaktifler8,9. Ancak, bazı piyasadaki Sumo özgü antikorlar pahalı, miktar veya kullanılabilirlik sınırlı, çılgınca değişken benzeşimleri ve çapraz-reaktivite sergiler eğilimli, ve bazı durumlarda eksikliği tekrarlanabilirlik10. Bir alternatif yaklaşım, dönüştürülmüş hücreler ve organizmalarda epitopu etiketli Sumo ifadesidir, fakat epitopu etiketlerini Sumo 'ya bağlamak, konjugasyonu protein hedefleri11' e yapay olarak düşürebilir. Ayrıca, dönüştürülmüş hücreler veya dokularda değerlendirildiğinde epiterler yararlı değildir.

Ulp1, hem SUMO öncüleri hem de SUMO-konjuli proteinlerin12' sini işleyen S. cerevisiae 'den kullanılan bir sumo proteaz. Biz serendipitous gözlem dayalı UTAG reaktif geliştirilen katalitik sistein bir mutasyon (C580S) içinde Ulp1's SUMO işleme ULP domain (UD) sadece Sumo yarık önler ama aynı zamanda tuzaklar Sumo-konjuge proteinleri yüksek avidite12. Basitlik için, bu karboky-Terminal SUMO-bindirme Ulp1 (C580S) parçası UTAG (UD TAG için kısa) olarak adlandırılır. UTAG, SUMO-modifiye proteinlerin yalıtımı ve tespiti için kullanılan anti-SUMO antikorları için yararlı bir alternatif gösteren rekombinant Pan-SUMO bindirme proteindir. Önemlisi, özellikle yerel-katlanmış, konjuge Sumo ve sadece bir veya birkaç epitopları Sumo tanır. Hem protein istikrar ve UTAG SUMO bağlama gücü geliştirmek için, biz stres toleranslı Maya Kluyveromyces marxianus (km) utag bir varyantı oluşturdu. KmUTAG, SUMO-conjugates ' i nanomolar yakınlık13ile sıkıca bağlar. Ayrıca, kmutag yüksek sıcaklıklara (42 °c), azaltıcı maddeler (5 mm tcep-Tris (2-karbokoksit) phosphine hidroklorür), denatüranlar (en fazla 2 M Urea), oksitleyici maddeler (0,6% hidrojen peroksitler) ve Non-İyonik deterjanlar dayanıklıdır. Bu stres toleransı, sert arıtma durumu ve uzun süreli kuluçak süreleri sırasında yararlıdır, istikrar ve SUMO bindirme etkinliğini sağlayarak. Ancak, KmUTAG 'ın SUMO bindirme aktivitesi, sistein değiştiren reaktifler, iyonik deterjanlar ve tam denatüre protein özler ile uyumsuzdur. KmUTAG 'ın olağanüstü yakınlık ve özellikleri, bu reaktif, birden fazla türün sumoylated proteinlerin çalışması için standart repertuar bir parçası haline gelebilir gösterir.

Burada bir rekombinant floresan mCherry-KmUTAG Fusion protein (kmUTAG-FL) kullanarak memeliler hücrelerinde ve nematdes içinde SUMO-modifiye proteinleri algılamak için basit bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

1. rekombinant KmUTAG-FL SUMO bindirme proteini kullanarak sabit doku kültürü hücrelerinde SUMO tespiti

  1. 6-iyi TC plakaları 22 mm yuvarlak kapak fişi üzerinde seçim doku kültürü hücreleri Grow 70%-80% konfluent kadar. 6-kuyu plakasında 1,2 – 1.8 arasındaki adımları gerçekleştirin.
  2. 1 mL DPBS (Dulbecco fosfat-tamponlu tuz) ile hücreleri kısaca yıkayın
  3. Sabitleme için,% 4 Paraformaldehyde (PFA) çözeltisi (DPBS 'de seyreltilmiş) yeni bir çözelti hazırlayın. Hücreleri düzeltmek için, her iyi için DPBS 2 mL 4% PFA ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inküat. Not: PFA kullanan tüm adımlar bir laboratuar Güvenlik kaputu içinde yapılmalıdır ve PFA doğru şekilde atılmalıdır.
  4. Sabit hücreleri 3x 1 mL DPBS 'de yıkarken plaka, 5 dak her yıkamada yıkayın.
  5. Hücreleri geçirgen için, DPBS 'de% 0,1 Triton X-100 ile 15 dakika boyunca inküye yapın
  6. Hücreleri 3x 1 mL DPBS 'de yıkarken plaka, 5 dk her yıkama
  7. Hücreleri 10 s için 0,1 M Glycine-HCL (pH 2,0) ile 500 μL ile kulbe ederek, sonra da pH 'yi hemen% 10d (SPB) olan 500 μL ile nötralize eder.
  8. 1 mL DPBS 'de hücreleri 3x yıkarken plaka, 5 dk her yıkama
  9. Kuyunda coverfları çıkarın ve bir nem odasına yerleştirin. Sonra aşağıdaki gibi lamel magazini üzerinde inküsleler ile devam:
    1. Sadece utag-fl boyama için: Mix 1 μg utag-fl ile 100 μL 1x SPB içeren 5 mm tcep bir tüp, kaplama üzerindeki hücrelere karışımı pipet, ve oda sıcaklığında inküye 1 h nem odasında.
    2. İsteğe bağlı olarak, utag-fl ve anti SUMO1 antikor Co-boyama için aşağıdaki devam edin:
      1. Mix bir tüp 1 μg UTAG-FL ve 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (gelişim çalışmaları için elde edilen Hybridoma Bank9) Ile 100 μL engelleme tamponu, karışımı coverslip üzerine pipet ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inküye yapın.
      2. 200 μL dpbs, her yıkamada 5 dk ile lamel magazini üzerindeki hücreleri 3 kez yıkayın.
      3. Mix bir tüp 0,5 μL Anti-fare Alexa Fluor 488 konjuate antikor ile 100 μL engelleme tamponu, karışımı coverslip üzerine pipet ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçk.
  10. Kapak kuponları yıkamak için, pipet 200 her lamel magazini üzerinde μL dpbs ve 10 dakika yerinde bırakın. yıkama 2 kez daha tekrarlayın.
  11. Son yıkama lamel magazini çıkarın ve montaj orta bir damla (bkz. malzeme tablosu) ile önceden temizlenmiş bir microkopi slayt üzerine tersine çevirin.
  12. Mikroskop altında görüntülemeden önce gece-20 °C dondurucu içinde saklayın. DAPı (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) ve Alexa Fluor 488 (isteğe bağlı SUMO2/3 Co-boyama işlemi yapıldığında) için uygun filtre kümelerini kullanarak görselleştirin.

2. utag-fl kullanarak sabit nematod gonadlar içinde Sumo tespiti

  1. Yetişkin Hünsa Poly-L-lizin ile kaplanmış bir artı şarjlı slayt üzerinde yumurta tampon14 8 μL damlacık için aktarın. 27,5 G iğneler kullanarak solucanların gonadlar bırakın. Ya antikor etiketleme veya UTAG-fl etiketleme ile devam edin.
  2. Antikor etiketleme örnekleri için aşağıdaki gibi devam edin:
    1. Sıvı nitrojen içinde Freeze-crack örnekleri ve sonra bir gece-20 °C metanol bir Coplin kavanozda düzeltin.
    2. Ayrıca Coplin kavanozlarda, 1x PBS 'de 3 kez yıkanır, ardından% 0,5 BSA ve% 0,1 ara 20 içeren PBS 'de 20 dakika engelleyin.
    3. Numuneleri kaplayan her slayda 30 μL Anti-SUMO 6F2 antikor (1:10) ekleyin. Bir gecede 4 °C ' de nem odasında inküye yapın.
      Not: SUMO 6F2 gelişimsel çalışmalar Hybridoma Bankası15elde edildi.
    4. Coplin kavanozlarında, 1x PBS 'de 2 dakika boyunca kaymaları yıkayın, ardından 30 μL DyLight 488 keçi-Anti fare ikincil antikor (1:200) ile numuneleri oda sıcaklığında bir nem odasında 1,5 saat boyunca koruyun.
    5. Coplin kavanozlarında, 1x PBS 'de 2 dakika boyunca kaydırır, dH20 ' da hızlı bir daldırma gerçekleştirin ve ardından slaytları montaj ortamına bağlayın ( malzeme tablosunabakın).
  3. KmUTAG-fl etiketleme için aşağıdakilere devam edin:
    1. Hücreleri düzeltmek için,% 4 PF 'nin son konsantrasyonu için örneklere 1 hacim% 8 PF ekleyin. bir nem odasında 10 dakika için Fix ve daha sonra en az 5 dakika için 0,1 M gcine ile 1x PBS içeren bir Coplin kavanozu slaytlar aktararak reaksiyonu gidermek.
    2. Coplin kavanozlarda, 1x PBS 'de 5 dakika boyunca hücreleri yıkayın, sonra 10 dakika boyunca% 0,1 Triton-X içeren 1x PBS 'de örnekleri geçirgen.
    3. Bir Coplin kavanozu 1x PBS 'de en az 5 dakika yıkayın, ardından 200 μL 0,1 M Glycine-HCl (pH = 2,0) ile 10 saniye boyunca slayttaki örneklere ekleyin. Hemen pH nötralize etmek için 10X SPB 200 μL ekleyin.
    4. 5 dakika boyunca bir Coplin kavanozunda 1x PBS 'de slaytı yıkayın.
    5. Sürgülü yıkama ve pipet 100 μL 1x SPB + 5mM TCEP, 2 μg UTAG-fl ' y i slaytlardaki nematinlara içerir ve 1 saat boyunca sallanmaya gerek kalmadan nem odasında kuluçkay
    6. Slaytı Coplin kavanozuna geri dönün ve 1x PBS 'de 15 dakika yıkayın
    7. Kaydırağı yıkamadan çıkarın, numunenin etrafında kurumak için bir laboratuar silme kullanın ve ardından 5 μL montaj ortamına sahip slaytları bağlayın (bkz. malzeme tablosu). Slaytları 4 °C ' de saklayın. DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) ve DyLight 488 (SUMO2/3) için uygun filtre kümelerini kullanarak görselleştirin.

Sonuçlar

KmUTAG-fl bir rekombinant, mCherry Tagged SUMO-bindirme protein. Kmutag-fl üretmek için, pSPOT1 bakteriyel ekspresyonu Plasmid içine bir kodon optimize MCherry-kmutag klonlanmış (Şekil 1). İndüksiyon sonrası, kmUTAG-fl proteini spot-TRAP üzerinde temizlenmesi, eluted, ve daha fazla kullanım kadar dondurulmuş. KmUTAG-fl SUMO bindirme etkinliğini sağlamak için, biz SUMO1-konjugated boncuklar ve bir SUMO-CAT Fusion protein (veri gösterilmez, anca...

Tartışmalar

Burada kmutag-fl kullanımı, Rekombinant protein, sabit memelinin hücrelerinde Sumo fonksiyonel çalışmalar ve disseke nematod gonads için tanıtmak. KmUTAG-fl bir stres toleranslı Pan-SUMO özel reakajdır tanır ve yerel SUMO konjuti proteinleri ve SUMO zincirleri yakalar. SUMO 'nun üçüncül yapısı son derece iyi bir şekilde saklanmış olduğundan, ek model ve model olmayan sistemlerin SUMO türevleri kmUTAG-fl reakajıyla analiz edilebilir. Bu nedenle, KmUTAG-fl geleneksel antikor boyama protokolleri içi...

Açıklamalar

Rekombinant kmUTAG reaktifler Kerafast.com üzerinden araştırma topluluğuna sağlanmaktadır.

Teşekkürler

Biz onların destek için Kerscher laboratuar tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum, Nathalie Nguyen el yazması kritik okuma için, ve Lidia EPP sıralamayı için. Bu iş Commonwealth Research ticarileştirme Fonu MF16-034-LS OK tarafından desteklenmektedir. W & M öğrencileri için araştırma desteği, Bailey-Huston Araştırma Fonu ve Charles Center Honors Burslar tarafından RY ve CH 'e sağlandı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionElectron Microscopy Sciences30525-89-4
6-Well Cell Culture PlatesGenesee Scientific/Olympus Plastics25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-545-003Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
DPBS, no calcium, no magnesiumFisher ScientificGibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-485-146Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover GlassesFisherbrand12545101
FLUORO-GEL II with DAPIElectron Microscopy Sciences50-246-93)Mounting media in step 1.11
FLUORO-GEL with DABCOElectron Microscopy Sciences17985-02With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5
Glycine-HClFisher BioReagentsBP3815
Glycine-HClACROS Organics6000-43-7
KmUTAG-flKerafastKmUTAG reagents are available on Kerafast.com
Oneblock Western-CL blocking bufferPrometheus20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X SolutionFisher BioReagentsBP3994
PNT2 cell lineSigma-Aldrich95012613Normal prostate epithelium immortalized with SV40.
pSPOT1(ChromoTek GmbH)ev-1https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2DSHBSUMO 6F2SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Antibody 8A2DSHBSUMO-2 8A2SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCLGoldBio51805-45-9Used as a reducing agent at a concentration of 5mM
Triton X-100Fisher BioReagents9002-93-1Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)

Referanslar

  1. Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
  2. Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
  3. Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
  4. Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
  5. Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
  6. Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
  7. Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
  8. Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
  9. Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
  10. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
  11. Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
  12. Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
  13. Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
  14. Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  15. Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
  16. Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
  17. Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
  18. Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
  19. Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
  20. Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
  21. Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 146sumoSmt3smo 1sumoylationC elegansPNT2Maya tomurcuklananutagsumo bindirmeud

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır