Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

Резюме

Сумо является важным и очень консервативны, Малый убиквитин-как модификатор белка. В этом протоколе мы описываем использование устойчивых к стрессу рекомбинантного белка-улавливания сумо (kmUTAG) для визуализации родных, незамаркированных спрятаных концентов сумо и их локализации в различных типах клеток.

Аннотация

Здесь мы представляем новый метод изучения фосфорилировании белков и их суб-клеточной локализации в клетках млекопитающих и не, ооцитов. Этот метод использует рекомбинантные изменения сумо захвата белка фрагмент, kmUTAG, производные от Ulp1 сумо протеазы стресс-терпимой многообещающий дрожжей Клюйверомика marxianus. Мы адаптировали свойства kmUTAG с целью изучения сумоилирования в различных модельных системах без применения антител. Для изучения сумо, KmUTAG имеет несколько преимуществ по сравнению с антителами на основе подходов. Этот стресс-терпимый сумо-захвата реагента производится рекомбинантли, он признает родной сумо изоформы от многих видов, и в отличие от коммерчески доступных антител он показывает снижение сродство для свободного, неприпрянепрямой сумо. Репрезентативные результаты, показанные здесь, включают локализацию контургейтов сумо в клетках культуры млекопитающих и немелях ооцитов.

Введение

Цель этого метода состоит в том, чтобы облегчить изучение и анализ белков сумо-спряга с использованием рекомбинантной белки, удерживающей захват сумо UTAG (ULP доменного тега). Как описано ниже, UTAG может использоваться вместо других реагентов и подходов для очищения, обнаружения и визуализации сумо-модифицированных белков. В зависимости от условий роста, клетки могут содержать сотни или тысячи белков, которые модифицированы с сумо или сумо цепей (для обзора см. Kerscher et al. 2006¹ и кершер 2016²). Это представляет значительные трудности для функционального анализа конкретных сумо-модифицированных белков, тем более, что только часть конкретной цели фосфорилировании фактически изменены³. В дополнение к их роли в основных клеточных процессов, таких как транскрипционного регулирования, белка гомеостаза, ответ на клеточный стресс, и хроматина ремоделирования во время митоза и мейоз; Теперь стало достаточно ясно, что сумо, сумо-модифицированных белков и компонентов сумо пути также имеют потенциал в качестве биомаркеров для патологий, таких как рак и нейродегенеративных расстройств^{4,5,6 ,7}. Это подчеркивает необходимость надежных, надежных и легко доступных инструментов и инновационных подходов для обнаружения и функционального анализа сумо-модифицированных белков в различных клетках и образцах.

Во многих системах антитела, специфическая для сумо, являются реагентами выбора для обнаружения, изоляции и функционального анализа сумо-модифицированных белков^8,9. Однако, некоторые коммерчески доступные сумо-специфические антитела дорогие, ограниченные по количеству или доступности, склонные выставлять дико переменные сходства и перекрестную реактивность, и в некоторых случаях отсутствие воспроизводимости¹⁰. Одним из альтернативных подходов является выражение эпитопа-тегами сумо в трансформированных клетках и организмах, но связывая Теги эпитопа к сумо может искусственно понизить его сопряжение с целями протеина¹¹. Кроме того, эпитопы не полезны при оценке нетрансформиенных клеток или тканей.

Ulp1 является консервативным протеазы сумо из с. цервиии, что оба процесса прекурсоров сумо и desumoylates сумо-спрягается белки¹². Мы разработали реагента UTAG на основе счастливого наблюдения, что мутация каталитического цистеина (C580S) в Ulp1's сумо ULP domain (UD) не только предотвращает расщепление сумо, но и ловушки сумо-спрягается белков с высоким Жадность¹². Для простоты, мы ссылались на этот карквадратные терминала сумо Ulp1 (C580S) фрагмент как UTAG (короткий для UD TAG). UTAG является рекомбинантной Пан-сумо улавливания белка, который представляет собой полезную альтернативу анти-сумо антител, используемых для изоляции и обнаружение сумо-модифицированных белков. Важно отметить, что он специально признает, изначально сложенный, спрягается сумо, а не только один или несколько эпитопов на сумо. Для улучшения как белка стабильности и силы сумо связывания UTAG, мы породили вариант UTAG из стрессоустойчивых дрожжей Клюйверомика marxianus (km). KmUTAG плотно связывает сумо-спрятаврат с наносолнечной сродство¹³. Кроме того, kmUTAG устойчив к повышенным температурам (42 ° с), уменьшающих агенты (5 мм ТВИС-РИЦ (2-карбокезил) фосфин гидрохлорид), денатуранты (до 2 м мочевины), окисляющие вещества (0,6% перекиси водорода) и неионные моющие средства. Этот стресс терпимости выгодно во время суровых условиях очистки и длительное время инкубации, обеспечивая его стабильность и сумо-захвата деятельности. Не удивительно, однако, KmUTAG в сумо-захвата деятельность несовместима с цистеин-модификации реагентов, ионные моющие средства и полностью денатурированного белка экстрактов. Замечательное сходство и свойства KmUTAG показывают, что этот реагент может стать частью стандартного репертуара для исследования sumoylated белков в нескольких видов.

Здесь мы предоставляем простой метод для обнаружения сумо-модифицированных белков в клетках млекопитающих и нематод с использованием рекомбинантного флуоресцентный белок-KmUTAG Fusion белка (kmUTAG-FL).

протокол

1. Обнаружение сумо в клетках культуры фиксированной ткани с использованием рекомбинантного белка сумо KmUTAG-FL

1. Выращивать ткань культуры клетки выбора на 22 мм круглый крышка скользит в 6-хорошо TC пластин до 70%-80% свободно. Выполните шаги 1.2-1.8 в 6-хорошо пластины.
2. Мойте клетки кратко с 1 мл DPBS (фосфатно-буферный физиологический раствор Дульбекко)
3. Для фиксации Подготовьте свежее решение 4% раствора параформальдегида (ППН) (разбавленный в DPBS). Чтобы исправить клетки, добавить 2 мл 4% в ДФА в DPBS, чтобы каждый хорошо. Инкубировать клетки в течение 20 минут при комнатной температуре. Примечание: все шаги, с помощью фа должны выполняться в лаборатории безопасности капот и фа должны быть утилизированы надлежащим образом.
4. Вымойте фиксированные клетки 3x в 1 мл DPBS, в то время как намазка пластины, 5 мин каждый мыть.
5. Для проникновения в клетки, инкубировать в течение 15 минут с 0,1% тритон X-100 в DPBS
6. Вымойте клетки 3x в 1 мл DPBS в то время как нукатирования пластины, 5 мин каждый мыть
7. Инкубировать клетки с 500 мкл 0,1 M глицин-СОВМЕСТИМОГО (рН 2,0) для 10 s, затем нейтрализовать рН немедленно с 500 мкл 10x сумо протеазы буфер (СПб).
8. Вымойте клетки 3x в 1 мл DPBS в то время как нюнатирование пластины, 5 мин каждый мыть
9. Удалите покрылисты из колодца и поместите их в камеру влажности. Затем приступить к инкубаций на комбинезон следующим образом:
   1. Для окрашивания UTAG-FL только: Смешайте 1 мкг UTAG-FL с 100 мкл 1x СПб, содержащей 5 мм ТВИС в трубке, пипетите смесь на клетки на покрываете, и Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч в камере влажности.
   2. Необязательно, для UTAG-FL и anti-SUMO1 антитела Co-пятнать, продолжайте с следующими:
      1. Смешайте в трубке 1 мкг UTAG-FL и 0,5 мкл SUMO2/3 8A2 (полученные для развития Гибридообразование банка⁹) с 100 мкл блокирующего буфера, пипетки смеси на покрывало и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч.
      2. Мыть клетки на комбинезон 3 раза с 200 мкл DPBS, 5 мин каждый мыть.
      3. Смешайте в трубке 0,5 мкл анти-мышь Alexa Fluor 488 спрягается антитела с 100 мкл блокировка буфера, пипетки смеси на покрывало, и инкубировать в комнатной температуре в течение 1 ч.
10. Для мытья комбинезон, пипетки 200 мкл DPBS на каждом покрывало и оставить на месте в течение 10 мин. Повторите стирку 2 раза.
11. Удалите покрывало с последнего мытья и переверните его на предварительно очищенного микроскопа слайд с каплей монтажа среды (см. таблицу материалов).
12. Храните ночью в морозильной камере-20 °C перед просмотром под микроскопом. Визуализируйте используя соотвествующие наборы фильтра для DAPI (дна), Texas красный (kmUTAG-FL), и Alexa Fluor 488 (если опционально Co-пятнать SUMO2/3 выполнено).

2. Обнаружение сумо в фиксированных немеле гонады с использованием UTAG-FL

1. Перенесите Взрослый гермафродитами на 8 мкл капли яичного буфера¹⁴ на плюс заряженный слайд, который был покрыт поли-L-лизин. Отпустите гонады из червей с помощью 27,5 G иглы. Продолжайте либо этикетировочных антител или UTAG-FL маркировки.
2. Для маркировки антител образцов, действовать следующим образом:
   1. Пробы стоп-трещины в жидком азоте, а затем зафиксировать на ночь в-20 °C метанол в банке Коплин.
   2. Кроме того, в Коплин банки, мыть слайды в 3 раза в 1x PBS, затем блок для 20 мин в PBS, содержащие 0,5% БСА и 0,1% между 20.
   3. Добавить 30 мкл антитела анти-сумо 6F2 (1:10) на каждый слайд, охватывающий образцы. Инкубировать на ночь в камере влажности при температуре 4 ° c.
      Примечание: сумо 6F2 был получен от развития гибридомы банк исследований¹⁵.
   4. В Коплин банки, мыть слайды для 2 мин в 1x PBS, затем накрыть и инкубации образцов с 30 мкл из DyLight 488 коза-анти мышь вторичного антитела (1:200) в течение 1,5 часов в камере влажности при комнатной температуре.
   5. В Коплин банки, мыть слайды для 2 мин в 1x PBS, выполните быстрое погружение в dH₂0, а затем смонтировать слайды с монтажной среды (см. таблицу материалов).
3. Для маркировки KmUTAG-FL, продолжайте следующее:
   1. Чтобы исправить клетки, добавьте 1 том 8% PF для образцов для окончательной концентрации 4% PF. исправление в течение 10 минут в камере влажности, а затем погасить реакцию путем переноса слайдов в банку coplin содержащие 1x PBS с 0,1 M глицина, по крайней мере 5 мин.
   2. В Коплин банки, мыть клетки в течение 5 минут в 1x PBS, затем проникая образцов в 1x PBS, содержащие 0,1% тритон-X для 10 мин.
   3. Промыть в Коплин банку, по крайней мере 5 минут в 1x PBS, затем добавить 200 мкл 0,1 м глицин-совместимого (pH = 2,0) к образцам на слайде в течение 10 секунд. Немедленно добавьте 200 мкл 10x СПб для нейтрализации рН.
   4. Вымойте слайд в 1x PBS в банке Коплин в течение 5 минут.
   5. Удалите слайд из стирки и пипетки 100 мкл 1x СПб + 5mM ТВИС, содержащий 2 мкг UTAG-FL для нематод на слайдах, и инкубировать в камере влажности для 1 ч без качания.
   6. Верните слайд в банку Коплина и промойте в течение 15 минут в 1x PBS
   7. Снимите слайд с мытья, используйте лабораторную протирайку вокруг образца, а затем установите слайды с 5 мкл монтажных средств (см. таблицу материалов). Храните слайды при температуре 4 °C. Визуализируйте используя соотвествующие наборы фильтра для DAPI (дна), Texas красного (kmUTAG-FL), и DyLight 488 (SUMO2/3).

Результаты

KmUTAG-FL является рекомбинантной, mCherry-меткой сумо-улавливания белка. Для производства kmUTAG-FL, мы клонировали Codon-оптимизированный mCherry-kmUTAG в pSPOT1 бактериального Сверхэкспрессия плазмид (рис. 1). После индукции, протеин kmUTAG-FL был очищен на Spot-ЛОВУШКЕ, увял, и за?...

Обсуждение

Здесь мы вводим использование kmUTAG-FL, рекомбинантного белка, для функциональных исследований сумо в стационарных клетках млекопитающих и расчлененных гомелях. KmUTAG-FL является стресс-терпимым Пан-сумо конкретных реагентов, что признает и ловушки родной сумо-спрятаных белков и сумо цепей...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
6-Well Cell Culture Plates	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	50-246-93)	Mounting media in step 1.11
FLUORO-GEL with DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG reagents are available on Kerafast.com
Oneblock Western-CL blocking buffer	Prometheus	20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher BioReagents	BP3994
PNT2 cell line	Sigma-Aldrich	95012613	Normal prostate epithelium immortalized with SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Antibody 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Used as a reducing agent at a concentration of 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)