Localisation des protéines modifiées par SUMO à l’aide de protéines de piégeage du sumo fluorescent

Résumé

Le SUMO est une protéine modificatrice essentielle et très conservée, de petite taille, comme l’ubiquitine. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’une protéine de piégeage de SUMO recombinant tolérante au stress (kmUTAG) pour visualiser les conjugués de SUMO natifs et non marqués et leur localisation dans une variété de types de cellules.

Résumé

Nous présentons ici une nouvelle méthode pour étudier la sumoylation des protéines et leur localisation sous-cellulaire dans les cellules de mammifères et les ovocytes des nématodes. Cette méthode utilise un fragment de protéine de piégeage de SUMO modifié recombinant, kmUTAG, dérivé de la protéase de SUMO Ulp1 de la levure de bourgeonnement tolérante au stress Kluyveromyces marxianus. Nous avons adapté les propriétés de la kmUTAG dans le but d’étudier la sumoylation dans une variété de systèmes modèles sans l’utilisation d’anticorps. Pour l’étude de SUMO, KmUTAG a plusieurs avantages par rapport aux approches basées sur les anticorps. Ce réactif de piégeage du SUMO à tolérance de stress est produit de façon recombinante, il reconnaît les isoformes de SUMO indigènes de nombreuses espèces, et contrairement aux anticorps disponibles dans le commerce, il montre une affinité réduite pour le SUMO libre et non conjugué. Les résultats représentatifs présentés ici comprennent la localisation des conjugués SUMO dans les cellules de culture tissulaire de mammifères et les ovocytes de nématodes.

Introduction

Le but de cette méthode est de faciliter l’étude et l’analyse des protéines conjuguées au SUMO à l’aide de la protéine recombinante SUMO-piégeage UTAG ( étiquettede domaineULP). Comme détaillé ci-dessous, UTAG peut être utilisé en lieu et place d’autres réactifs et approches pour purifier, détecter et visualiser les protéines modifiées par le SUMO. Selon les conditions de croissance, les cellules peuvent contenir des centaines ou des milliers de protéines qui sont modifiées avec les chaînes SUMO ou SUMO (pour examen voir Kerscher et al. 2006¹ et kerscher 2016²). Cela représente une difficulté considérable pour les analyses fonctionnelles de protéines spécifiques de SUMO, d’autant plus que seule une fraction d’une cible de sumoylation particulière est réellement modifiée³. En plus de leurs rôles dans les processus cellulaires essentiels tels que la régulation transcriptionnelle, l’homéostasie des protéines, la réponse au stress cellulaire, et le remodelage de la chromatine pendant la mitose et la méiose; Il est maintenant devenu suffisamment clair que le sumo, les protéines modifiées par le sumo et les composants de la voie de sumo ont également un potentiel comme biomarqueurs pour des pathologies telles que le cancer et les troubles neurodégénératifs^{4,5,6 ,7}. Cela souligne la nécessité d’outils robustes, fiables et facilement disponibles et d’approches novatrices pour la détection et l’analyse fonctionnelle des protéines modifiées par le SUMO dans une variété de cellules et d’échantillons.

Dans de nombreux systèmes, les anticorps spécifiques au sumo sont les réactifs de choix pour la détection, l’isolement et les analyses fonctionnelles des protéines modifiées par le sumo^8,9. Cependant, certains anticorps spécifiques au SUMO disponibles dans le commerce sont coûteux, limités en quantité ou en disponibilité, enclins à présenter des affinités à variables sauvagement et une réactivité croisée, et, dans certains cas, manquent de reproductibilité¹⁰. Une autre approche est l’expression du SUMO marqué par l’épitope dans les cellules et les organismes transformés, mais la liaison des étiquettes d’épitope au SUMO peut artificiellement abaisser sa conjugaison aux cibles protéiques¹¹. En outre, les épitopes ne sont pas utiles lorsque des cellules ou des tissus non transformés sont évalués.

Ulp1 est une protéase de SUMO conservée de S. cerevisiae qui les deux traite le précurseur de sumo et desumoylates les protéines conjuguées de sumo¹². Nous avons développé le réactif UTAG sur la base de l’observation fortuit qu’une mutation de la cystéine catalytique (C580S) dans Ulp1's traitement SUMO ULP domain (UD) non seulement prévient le clivage du sumo, mais piège également les protéines conjuguées au Sumo avec des l’avidité¹². Pour simplifier, nous nous sommes référés à ce fragment carboxy-terminal SUMO-piégeage Ulp1 (C580S) comme UTAG (abréviation de UD TAG). UTAG est une protéine de piégeage de Pan-SUMO recombinante qui représente une alternative utile aux anticorps anti-SUMO utilisés pour l’isolement et la détection des protéines modifiées par le SUMO. Plus important encore, il reconnaît spécifiquement le SUMO en mode natif, conjugué et non pas seulement un ou plusieurs épitopes sur SUMO. Pour améliorer à la fois la stabilité protéique et la force de liaison SUMO de UTAG, nous avons généré une variante de l’UTAG de la levure tolérante au stress Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG lie étroitement les conjugués de SUMO à l’affinité nanomolaire¹³. De plus, kmUTAG résiste aux températures élevées (42 ° c), aux agents réducteurs (chlorhydrate de 5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) phosphine), aux dénaturants (jusqu’à 2 M d’urée), aux agents oxydants (0,6% de peroxyde d’hydrogène) et aux détergents non ioniques. Cette tolérance au stress est bénéfique pendant l’état de purification sévère et les durées d’incubation prolongées, assurant sa stabilité et son activité de piégeage du SUMO. Toutefois, il n’est pas surprenant que l’activité de piégeage de SUMO de KmUTAG soit incompatible avec les réactifs modifiant la cystéine, les détergents ioniques et les extraits protéiques entièrement dénaturés. L’affinité et les propriétés remarquables de KmUTAG indiquent que ce réactif peut faire partie du répertoire standard pour l’étude des protéines sumoylées chez plusieurs espèces.

Nous fournissons ici une méthode simple pour détecter les protéines modifiées par le SUMO dans les cellules de mammifères et les nématodes à l’aide d’une protéine de fusion mCherry-KmUTAG fluorescente recombinante (kmUTAG-FL).

Protocole

1. détection de SUMO dans des cellules de culture tissulaire fixe utilisant la protéine recombinante KmUTAG-FL SUMO-piégeage

1. Cultiver des cellules de culture tissulaire de choix sur des feuillets de 22 mm de couverture ronde dans des plaques de 6-Well TC jusqu’à 70% – 80% confluent. Effectuez les étapes 1.2 à 1.8 dans la plaque de 6 puits.
2. Laver brièvement les cellules avec 1 mL de DPBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco)
3. Pour la fixation, préparer une solution fraîche de 4% de paraformaldéhyde (PFA) solution (dilué dans DPBS). Pour fixer les cellules, ajouter 2 mL 4% PFA dans DPBS à chaque puits. Incuber les cellules pendant 20 min à température ambiante. Remarque: toutes les étapes utilisant le PFA doivent être effectuées dans un capot de sécurité de laboratoire et le PFA doit être éliminé correctement.
4. Laver les cellules fixes 3x dans 1 mL DPBS tout en cassant la plaque, 5 min chaque lavage.
5. Pour perméabilize les cellules, incuber pendant 15 min avec 0,1% Triton X-100 dans DPBS
6. Laver les cellules 3x dans 1 mL DPBS tout en cassant la plaque, 5 min chaque lavage
7. Incuber les cellules avec 500 μL de 0,1 M de glycine-HCL (pH 2,0) pendant 10 s, puis neutraliser le pH immédiatement avec 500 μL de tampon de protéase de SUMO 10x (SPB).
8. Laver les cellules 3x dans 1 mL DPBS tandis que la plaque de noix, 5 min chaque lavage
9. Retirez les lamelles du puits et placez-les dans une chambre d’humidité. Ensuite, procéder aux incubations sur la bavette comme suit:
   1. Pour la coloration UTAG-FL seulement: mélanger 1 μg UTAG-FL avec 100 μL de 1x SPB contenant 5 mM TCEP dans un tube, Pipetter le mélange sur les cellules de la lèvre, et incuber à température ambiante pendant 1 h dans la chambre d’humidité.
   2. En option, pour la co-coloration des anticorps UTAG-FL et anti SUMO1, procédez comme suit:
      1. Mélanger dans un tube 1 μg UTAG-FL et 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (obtenu pour les études de développement Hybridoma Bank⁹) avec 100 μl de tampon bloquant, Pipetter le mélange sur la lèvre, et incuber à température ambiante pendant 1 h.
      2. Laver les cellules sur la lamelle 3 fois avec 200 μl de DPBS, 5 min chaque lavage.
      3. Mélanger dans un tube 0,5 μL anti-souris Alexa Fluor 488 anticorps conjugués avec 100 μL tampon bloquant, Pipetter le mélange sur la lèvre et incuber à température ambiante pendant 1 h.
10. Pour laver les lamelles, Pipetter 200 μl de DPBS sur chaque lamelle et laisser en place pendant 10 min. répéter le lavage 2 fois de plus.
11. Enlevez le rebord du dernier lavage et inversez-le sur une glissière de microscopie préalablement nettoyée avec une goutte de support de montage (voir tableau des matériaux).
12. Entreposer la nuit dans un congélateur de-20 ° c avant de regarder sous le microscope. Visualisez à l’aide des ensembles de filtres appropriés pour DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) et Alexa Fluor 488 (si la cocoloration optionnelle SUMO2/3 est effectuée).

2. détection de SUMO dans des gonades de nématodes fixes utilisant UTAG-FL

1. Transférer les hermaphrodites adultes à une gouttelette de 8 μL de tampon d’oeufs¹⁴ sur une glissière plus chargée qui a été enduite de poly-L-lysine. Relâchez les gonades des vers à l’aide de 27,5 aiguilles G. Procédez à l’étiquetage des anticorps ou à l’étiquetage UTAG-FL.
2. Pour les échantillons d’étiquetage d’anticorps, procédez comme suit:
   1. Congeler des échantillons de crack dans de l’azote liquide, puis fixer la nuit dans le méthanol-20 ° c dans un bocal de Coplin.
   2. Aussi dans les pots de Coplin, laver les lames pour 3 fois dans 1x PBS, puis bloquer pendant 20 min dans PBS contenant 0,5% BSA et 0,1% Tween 20.
   3. Ajouter 30 μL d’anticorps anti-SUMO 6F 2 (1:10) à chaque diapositive couvrant les spécimens. Incuber pendant la nuit dans une chambre d’humidité à 4 ° c.
      NOTE: le SUMO 6F2 a été obtenu à partir des études de développement Hybridoma Bank¹⁵.
   4. Dans les pots de Coplin, laver les lames pendant 2 min dans 1x PBS, puis recouvrir et incuber les spécimens avec 30 μL d’anticorps secondaire DyLight 488 chèvre-anti souris (1:200) pendant 1,5 heures dans une chambre d’humidité à température ambiante.
   5. Dans les pots de Coplin, laver les lames pendant 2 min dans 1x PBS, effectuer une trempette rapide en dH₂0, puis monter les glissières avec support de montage (voir tableau des matériaux).
3. Pour l’étiquetage KmUTAG-FL, procédez comme suit:
   1. Pour fixer les cellules, ajouter 1 volume de 8% PF aux échantillons pour une concentration finale de 4% PF. fixer pendant 10 min dans une chambre d’humidité, puis éteindre la réaction en transférant les lames dans un bocal de Coplin contenant 1x PBS avec 0,1 M de glycine pendant au moins 5 min.
   2. Dans les pots de Coplin, laver les cellules pendant 5 min dans 1x PBS, puis perméabilize les échantillons dans 1x PBS contenant 0,1% Triton-X pendant 10 min.
   3. Laver dans un bocal de Coplin pendant au moins 5 min dans 1x PBS, puis ajouter 200 μL de 0,1 M de glycine-HCl (pH = 2,0) aux échantillons sur la diapositive pendant 10 secondes. Ajouter immédiatement 200 μL de 10x de SPB pour neutraliser le pH.
   4. Lavez la glissière dans un récipient de Coplin de 1x PBS pendant 5 min.
   5. Retirer la lame du lavage et Pipetter 100 μL de 1x SPB + 5mM TCEP contenant 2 μg d’UTAG-FL aux nématodes sur les lames, et incuber dans la chambre d’humidité pendant 1 h sans bascule.
   6. Retournez la glissière dans le bocal de Coplin et lavez-la pendant 15 min en 1x PBS
   7. Retirez la glissière du lavage, utilisez une lingette de laboratoire pour sécher autour de l’échantillon, puis montez les lames avec 5 μL de support de montage (voir tableau des matériaux). Rangez les lames à 4 ° c. Visualisez à l’aide des ensembles de filtres appropriés pour DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) et DyLight 488 (SUMO2/3).

Résultats

KmUTAG-FL est une protéine recombinante, mCherry-tag SUMO-piégeage. Pour produire kmUTAG-FL, nous avons cloné un mCherry-kmUTAG optimisé pour le codon dans le plasmide bactérien de surexpression bactérienne de pSPOT1 (figure 1). Après l’induction, la protéine kmUTAG-FL a été purifiée sur spot-TRAP, éluée et congelée jusqu’à utilisation ultérieure. Pour assurer l’activité de piégeage de SUMO de KmUTAG-FL, nous avons confirmé la liaison...

Discussion

Ici, nous introduisons l’utilisation de kmUTAG-FL, une protéine recombinante, pour des études fonctionnelles de SUMO dans des cellules de mammifères fixes et des gonades de nématodes disséqué. KmUTAG-FL est un réactif spécifique au PAN-SUMO tolérant le stress qui reconnaît et piège les protéines conjuguées au SUMO et les chaînes de SUMO indigènes. Étant donné que la structure tertiaire de SUMO est très conservée, il est très probable que des variantes de SUMO issues de systèmes supplémentaires de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
6-Well Cell Culture Plates	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	50-246-93)	Mounting media in step 1.11
FLUORO-GEL with DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG reagents are available on Kerafast.com
Oneblock Western-CL blocking buffer	Prometheus	20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher BioReagents	BP3994
PNT2 cell line	Sigma-Aldrich	95012613	Normal prostate epithelium immortalized with SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Antibody 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Used as a reducing agent at a concentration of 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)