스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

요약

스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.

초록

여기에서 우리는 포유류 세포 및 네 마 테 ode 난 모에 있어서의 단백질의 수 모 화 및 그들의 하위 세포 국 소화를 연구 하는 신규 한 방법을 제시 하 고 있다. 이 방법은 변형 된 스모-포착 단백질 단편, kmUTAG, Ulp1 스모 프로 테아 제 로부터 유래 된, 스트레스 내성 신진 효 모 클 루 근 균을 활용 한다. 우리는 항 체를 사용 하지 않고 다양 한 모델 시스템에서 수 모 닐 화를 연구 하기 위한 목적으로 kmUTAG의 특성을 적용 했습니다. 스모의 연구에 대 한, KmUTAG 항 체 기반 접근 방식에 비해 몇 가지 이점이 있다. 이 스트레스에 강한 스모-포착 시 약은 재조합 적으로 생산 되며, 많은 종에서 자생 하는 스모이 소 양식을 인식 하 고, 시판 되는 항 체와는 달리 무료, 비 접합 스모에 대 한 친화도를 감소 보여줍니다. 여기에 표시 된 대표적인 결과는 포유류 조직 배양 세포 및 네 마 테 오드 모 난 모에 있어서의 스모 컨 쥬 게이트의 국 소화를 포함 한다.

서문

이 방법의 목적은 재조합 스모-포착 UTAG (ULp 도메인 태그) 단백질을 사용 하 여 스모 컨 쥬 게이 터 단백질의 연구 및 분석을 용이 하 게 하기 위한 것 이다. 아래에 설명 된 바와 같이, UTAG는 스모 변성 단백질을 정화, 검출 및 시각화 하기 위한 다른 시 약과 접근법을 대신 하 여 사용할 수 있습니다. 성장 조건에 따라 세포는 스모 또는 스모 사슬로 수정 된 수백 또는 수천 개의 단백질을 함유 할 수 있습니다 (검토를 위해 커 셔 외 2006¹ 과 케르 셔 2016²). 이것은 특정 스모 변성 단백질의 기능적 분석에 대 한 상당한 어려움을 나타내며, 특히 특정 수 모 닐 화 대상의 분 획만이 실제로³개 수정 되기 때문 이다. 전사 조절, 단백질 항상성, 세포 스트레스에 대 한 반응, 유사 분열 증 및 감수 분열 시 염색 질 리 모델링이 같은 필수적인 세포 과정에서의 역할에 더하여; 이제는 스모, 스모 변성 단백질, 스모 통로 성분이 암 및 퇴행 성 신경 장애 등의 병리학에 대 한 바이오 마커로 서 잠재력을가지고 있다는 것이 충분히 명백 해지고 있다^{4,5,6 ,7}. 이는 다양 한 세포 및 샘플에서 스모 변성 단백질의 검출 및 기능적 분석을 위한 견고 하 고 안정적 이며 쉽게 사용할 수 있는 도구와 혁신적인 접근법의 필요성을 강조 합니다.

많은 시스템에서, 스모 특이 적 항 체는 스모 변성 단백질의 검출, 분리 및 기능적 분석을 위한 선택의 시 약 이다^8,9. 그러나, 일부 상업적으로 입수 가능한 스모 특이 적 항 체는 비싸고, 수량 또는 가용성이 제한적 이며, 격렬 한 가변 친화도 및 교차 반응성을 나타내는 경향이 있으며, 일부 경우에는 재현성¹⁰이 결여 된다. 하나의 대안적 접근법은 형질 전환 된 세포 및 유기 체에서에 피토 프 태그 스모의 발현 이지만, 스모에 피토 프 태그를 연결 하는 것은 인위적으로 단백질 표적¹¹에 대 한 그의 컨 쥬 게이 션을 낮출 수 있다. 추가적으로,에 피토 프는 형질 전환 되지 않은 세포 또는 조직이 평가 될 때 유용 하지 않다.

Ulp1는 스모 접합 단백질¹²를 모두 처리 하 고 모 전 구체를 공정 하 게 하는 s. 세레 비시 로부터 보존 된 스모 프로 테아 제 이다. 뜻밖 관찰에 기초한 UTAG 시 약을 개발 하 여 Ulp1's 스모 가공에 있어서의 촉매 시스테인 (C580S)의 돌연변이가 스모의 분열을 예방할 뿐만 아니라, 스모 접합 단백질을 높은 것으로 함정에도 조류 패¹². 편의상이 카 르 복 시-말단 스모-트래핑 Ulp1 (C580S) 단편을 UTAG (UD 태그에 대 한 짧은) 라고 합니다. UTAG는 스모 변성 단백질의 분리 및 검출에 사용 되는 항 스모 항 체에 대 한 유용한 대안을 나타내는 재조합 범 스모 포획 단백질 이다. 특히 스모에는 하나 또는 여러 개의에 피토 프만이 아니라, 기본적으로 접힌, 공액 스모를 인식 하는 것이 중요 합니다. UTAG의 단백질 안정성과 스모 결합 강도를 모두 개선 하기 위해, 스트레스에 강한 효 모 근 종 균 (Km)에서 utag의 변형을 생성 했습니다. KmUTAG는 스모 컨 쥬 게이트를 나노 몰 친화도¹³으로 단단히 묶습니다. 또한, kmUTAG는 높은 온도 (42 ° c), 환 원제 (5mm carboxyethyl) 포스 핀 히드로 클로 라 이드 (변성 제), 산화 제 (0.6% 과산화 수소) 및 비 이온 성 세제에 내성이 있습니다. 이 응력 허용 오차는 가혹한 정화 조건 및 장기간의 인큐베이션 시간 동안에 유익 하 여 안정성과 스모 포착 활동을 보장 합니다. 그러나 놀랍게도 KmUTAG의 스모 포획 활동은 시스테인 변성 시 약, 이온 성 세제 및 완전히 변성 된 단백질 추출 물과 호환 되지 않습니다. KmUTAG의 현저한 친화도 및 특성은이 시 약이 여러 종의 수 모 화 단백질의 연구를 위한 표준 레 퍼 토리의 일부가 될 수 있음을 나타낸다.

여기에서 우리는 재조합 형광 mCherry-KmUTAG 융합 단백질 (kmUTAG fl)을 이용 하 여 포유류 세포 및 선 충에서 스모 변성 단백질을 검출 하는 간단한 방법을 제공 한다.

프로토콜

1. 재조합 KmUTAG-FL 스모를 사용 하 여 고정 조직 배양 세포에서 스모 검출 단백질을 포착

1. 6 웰 TC 플레이트에서 선택의 조직 배양 세포를 22 mm 원형 커버에서 70% ~ 80%까지 성장 6 웰 플레이트에서 1.2 ~ 1.8 단계를 수행 합니다.
2. DPBS (Dulbecco의 인산 완충 식 염 수가 1 mL)로 세포를 짧게 씻으십시오.
3. 고정용으로, DPBS에 희석 한 4% 파라 포름알데히드 (PFA) 용액의 신선한 용액을 준비 하십시오. 세포를 고정 하려면 DPBS에 2 mL의 4% PFA를 각 웰에 추가 하십시오. 실 온에서 20 분 동안 세포를 배양 합니다. 참고: PFA를 사용 하는 모든 단계는 실험실 안전 후드에서 수행 해야 하며 PFA를 올바르게 배치 해야 합니다.
4. 플레이트를 1 mL DPBS로 세척 하 고 5 분간 각 세척 하 여 고정 세포를 3 배 씻어 냅니다.
5. 세포 투과를 위해 DPBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용 하 여 15 분 동안 배양 합니다.
6. 플레이트를 변이 하는 동안 1 mL DPBS에서 3 배 셀을 세척 하 고, 5 분간 각 세척
7. 10s 0.1의 500 µ l 글리신 (ph 2.0)을 사용 하 여 세포를 배양 한 다음, µ의 10 배 스모 프로 테아 제 버퍼 (SPB) 500로 즉시 pH를 중화 시킵니다.
8. 1 mL DPBS에서 세포 세 배를 세척 하 고, 5 분간 각 세척
9. 우물에서 커버 슬립을 제거 하 고 습도 챔버에 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립의 인큐베이터를 다음과 같이 진행 합니다.
   1. UTAG-fl 염색만을 위해: 튜브에 5mm TCEP를 포함 하는 100 µ L와 함께 1 µ g의 UTAG-fl을 혼합 한 후 커버 슬립의 셀에 혼합 한 후, 습도 챔버에서 1 시간 동안 실 온에서 배양 합니다.
   2. 선택적으로, UTAG-FL 및 안티 SUMO1 항 체 공동 염색을 위해, 다음을 진행:
      1. 튜브 1 µ g UTAG-FL 및 0.5 µ L SUMO2/38A2 (개발 연구를 위해 얻어진 하이브 리도 마 뱅크⁹)를 차단 완충 액의 100 µ l로 혼합 하 고, 커버 슬립 상에 서 혼합을 피 펫 하 고 1 시간 동안 상 온에서 배양 한다.
      2. 커버 슬립의 셀을 200 µ L DPBS로 3 회 세척 하 고 각각 5 분간 세척 합니다.
      3. 튜브 0.5 µ L 안티 마우스 알 렉 사 Fluor 488 공액 항 체와 100 µ L 차단 완충 액을 혼합 하 고 커버 슬립 위에 혼합 한 후 실 온에서 1 시간 동안 배양 합니다.
10. 커버 슬립을 세척 하기 위해, 피 펫 200 µ L DPBS를 각 커버 미 끄 러 짐에 넣고 10 분 동안 제자리에 둡니다. 2 회 이상 세탁을 반복 합니다.
11. 마지막 세척에서 커버 슬립을 제거 하 고 장착 매체 한 방울로 사전 세척 된 현미경 슬라이드에 뒤집어 놓습니다 ( 재료 표참조).
12. 현미경으로 보기 전에-20°c 냉동 고에 하룻밤 보관 하십시오. DAPI에 대 한 적절 한 필터 세트를 사용 하 여 시각화, 텍사스 레드 (kmUTAG fl) 및 알 렉 사 Fluor 488 (옵션 SUMO2/3 공동 염색이 수행 되는 경우).

2. 우 태그-fl을 사용 하 여 수정 된 오 마 충 생식의 스모 탐지

1. Μ를 폴 리 라이 신으로 코팅 된 더하기 충전 된 슬라이드에 8 개의 계란 버퍼 (¹⁴ )로 성인 암수를 양도 한다. 27.5 G 바늘을 사용 하 여 웜에서 생식 광고를 풀어. 항 체 라벨링 또는 UTAG-fl 라벨링 중 하나를 진행 합니다.
2. 항 체 라벨링 샘플의 경우, 다음과 같이 진행 하십시오.
   1. 액체 질소에서 샘플을 동결 하 고 Coplin 항아리에-20°c 메탄올에서 밤새 고정 시킵니다.
   2. 또한 Coplin 항아리에, 1 개 PBS에서 3 회 슬라이드를 세척 한 다음 0.5% BSA와 0.1% 트윈 20을 포함 하는 PBS에서 20 분 동안 차단 합니다.
   3. 시 편을 덮고 있는 각 슬라이드에 30 µ L의 항 스모 6F2 항 체 (1:10)를 추가 한다. 4°c의 습도 챔버에서 밤새 배양 한다.
      주의: 스모 6F2는 개발 연구에서 하이브 리도 마 은행 (¹⁵) 로부터 얻었다.
   4. Coplin 항아리에, 1 개 PBS에서 2 분 동안 슬라이드를 세척 한 후 30 µ L의 DyLight 488 염소 안티 마우스 2 차 항 체 (1:200)를 사용 하 여 실 온의 습도 챔버에서 1.5 시간 동안 시료를 처리 합니다.
   5. Coplin 항아리에 1 개의 PBS에서 2 분 동안 슬라이드를 씻고 dH₂0에서 빠른 딥을 수행한 다음 장착 매체가 있는 슬라이드를 장착 합니다 ( 재질 표참조).
3. KmUTAG-fl 라벨링의 경우 다음을 진행 하십시오.
   1. 셀을 고정 하려면 샘플에 1 부피의 8% PF를 추가 하 여 최종 농도가 4% PF가 되도록 하십시오. 습도 챔버에서 10 분 동안 수정 하 고 0.1 M 글리신을 가진 1x PBS를 포함 하는 Coplin 항아리에 슬라이드를 적어도 5 분 동안 전달 하 여 반응을 냉각 시킵니다.
   2. Coplin 항아리에서, 세포를 1x PBS에서 5 분 동안 세척 한 다음 샘플을 10 분 동안 0.1%의 트리톤-X를 포함 하는 1x PBS에 침투 시킵니다.
   3. Coplin 용기에 1x PBS에서 적어도 5 분 동안 세척 한 다음, 슬라이드의 샘플에 µ의 0.1 M 글리신 (ph=2.0)을 10 초간 200 추가 합니다. 즉시 200 µ L을 추가 하 여 pH를 무력화 합니다.
   4. Coplin 항아리에 1x PBS로 슬라이드를 5 분간 씻으십시오.
   5. 슬라이드의 선 충 선 2 µ g를 포함 하는 µ의 1x SPB + 5mm tcep의 세척 및 피 100 펫에서 미 끄 러 지는 것을 제거 하 고, 흔들림 없이 1 시간 동안 습도 챔버에서 배양 합니다.
   6. Coplin 항아리에 슬라이드를 반환 하 고 1x PBS에서 15 분 동안 세척
   7. 세척에서 슬라이드를 제거 하 고 실험실 와이프를 사용 하 여 샘플 주위를 말린 다음 5 µ의 장착 매체와 함께 슬라이드를 장착 하십시오 ( 재료 표참조). 슬라이드를 4°c에 보관 하십시오. DAPI (DNA), 텍사스 레드 (kmUTAG fl) 및 DyLight 488 (SUMO2에 대 한 적절 한 필터 집합을 사용 하 여 시각화 합니다.

결과

KmUTAG-fl은 재조합, mCherry 태그 스모 포획 단백질. KmUTAG-fl을 생산 하기 위해, 코 돈에 최적화 된 mCherry-kmUTAG를 pSPOT1 세균과 발현 플라스 미드에 클로닝 하였다 (도 1). 유도 후, kmUTAG-fl 단백질을 스팟 트랩에 정제 하 고, 용 출 하 고, 추후 사용 될 때까지 냉동 시켰다. KmUTAG fl의 스모 포획 활동을 보장 하기 위해, SUMO1 융합 단백질의 침전 및 강 우에 대 한 ?...

토론

여기에서 우리는 고정 포유류 세포에서 스모의 기능적 연구를 위한 재조합 단백질 인 kmutag-fl의 사용을 소개 하 고, 선 충 생식 기를 해 부 한다. KmUTAG-fl은 기본 스모 컨 쥬 게이 터 단백질과 스모 체인을 인식 하 고 트래핑 하는 스트레스를 견 디는 팬 스모 특정 시 약입니다. 스모의 3 차 구조는 고도로 보존 되어 있기 때문에 추가 모델과 비 모델 시스템에서 스모 변형이 kmUTAG-fl 시 약으로 분석 될 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
6-Well Cell Culture Plates	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	50-246-93)	Mounting media in step 1.11
FLUORO-GEL with DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG reagents are available on Kerafast.com
Oneblock Western-CL blocking buffer	Prometheus	20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher BioReagents	BP3994
PNT2 cell line	Sigma-Aldrich	95012613	Normal prostate epithelium immortalized with SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Antibody 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Used as a reducing agent at a concentration of 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)