Un modelo de xenoinjerto humanizado de sangre periférica humana (PBMC) para la investigación de inmunooncología traslacional (I-O)

Resumen

Describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de ratón xenoinjerto humanizado basado para la investigación traslacional de inmunooncología. Este protocolo podría servir como una guía general para establecer y caracterizar modelos similares para la evaluación de la terapia I-O.

Resumen

El descubrimiento y desarrollo de la terapia inmunooncología (I-O) en los últimos años representa un hito en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, los desafíos del tratamiento persisten. Los modelos animales robustos y relevantes para la enfermedad son recursos vitales para la investigación y el desarrollo preclínicos continuos con el fin de abordar una serie de puntos de control inmune adicionales. Aquí, describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de xenoinjerto humanizado basado. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticuerpo anti-PD-1 humanizado en investigación en el desarrollo clínico en etapas tardías, se utiliza como ejemplo para discutir la configuración de la plataforma, la caracterización del modelo y las evaluaciones de eficacia de los medicamentos. Estos ratones humanizados apoyan el crecimiento de la mayoría de los tumores humanos probados, permitiendo así la evaluación de las terapias I-O en el contexto de la inmunidad humana y los cánceres humanos. Una vez establecido, nuestro modelo es comparativamente rentable y en tiempo y costo, y por lo general produce resultados altamente reproducibles. Sugerimos que el protocolo descrito en este artículo podría servir como una guía general para establecer modelos de ratón reconstituidos con PBMC humano y tumores para la investigación de I-O.

Introducción

La inmunooncología (I-O) es un campo de tratamiento oncológico en rápida expansión. Los investigadores han comenzado recientemente a apreciar el potencial terapéutico de las funciones moduladoras del sistema inmunitario para atacar tumores. Los bloqueos de puntos de control inmune han demostrado actividades alentadoras en una variedad de tipos de cáncer, incluyendo melanoma, carcinoma de células renales, cabeza y cuello, cáncerdemnes de pulmón, vejiga y próstata^1,2. Contrariamente a las terapias dirigidas que matan directamente las células cancerosas, lasterapias I-O potencian el sistema inmunitario del cuerpo para atacar los tumores 3.

Hasta la fecha, se han establecido numerosos modelos animales I-O relevantes. Estos incluyen: 1) líneas celulares tumorales de ratón o homoinjerto tumoral en ratones singéricos; 2) tumores espontáneos derivados del ratón genéticamente diseñado (GEM) o de la inducción de carcinógenos; 3) GEMs quiméricos con el golpe de diana(s) de drogas humanas en un sistema inmunitario murino funcional; y 4) ratones con inmunidad humana reconstituida trasplantada con células cancerosas humanas o xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Cada uno de estos modelos tiene ventajas obvias, así como limitaciones, que han sido descritas y revisadas extensamente en otros lugares⁴.

La reconstitución de la inmunidad humana en ratones inmunodeficientes se ha apreciado cada vez más como un enfoque clínicamente relevante para la investigación traslacional de I-O. Esto se logra generalmente a través de 1) injerto de células inmunitarias adultas (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PMBC))^5,6o 2) injerto de células madre hematopoyéticas (HSC) de, por ejemplo, sangre de cordón umbilical o sangre hígado^7,8. Estos ratones humanizados podrían apoyar el crecimiento de tumores humanos, permitiendo así la evaluación de las terapias I-O en el contexto de la inmunidad humana y los cánceres humanos. A pesar de las ventajas, las aplicaciones de ratones humanizados en la investigación de I-O generalmente se vieron obstaculizadas por varias preocupaciones, como el largo tiempo de desarrollo del modelo y un costo considerablemente alto.

Aquí, describimos un modelo humano basado en PBMC que podría ser ampliamente aplicado para estudios de I-O traslacionales. Este modelo es comparativamente rentable y en tiempo y costo con alta reproducibilidad en estudios de eficacia. Se ha utilizado internamente para las evaluaciones de varias terapias de I-O actualmente bajo desarrollo preclínico y clínico. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticuerpo anti-PD-1 humanizado en investigación 9, se utiliza como ejemplo para discutir el desarrollo del modelo, la caracterización y las posibles aplicaciones para los análisis de eficacia antitumoral.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en estudios en los que participaron en personas se ajustaron a las normas éticas de BeiGene y/o del comité nacional de investigación y con la declaración de Helsinki de 1964 y sus modificaciones posteriores o normas éticas comparables. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes individuales incluidos en el estudio. Todos los procedimientos realizados en estudios con animales fueron aprobados por la Junta de Revisión Interna de BeiGene. Este protocolo se ha ajustado específicamente para la evaluación de BGB-A317 (Tislelizumab) en ratones NOD/SCID humanizados.

1. Establecimiento de un modelo humano basado en PBMC

1. Mieloablación de ratones NOD/SCID utilizando ciclofosfamida: determinación de dosis óptimas
   1. Comprar ratones hembra NOD/SCID (6-8 semanas).
      NOTA: Todos los ratones involucrados en este estudio eran hembras.
   2. Preparar la ciclofosfamida (CP) a diferentes dosis (50, 100 y 150 mg/kg) en salina. Preparar el disulfiram (DS) en 0,8% de Tween-80 en salina a 125 mg/kg.
      NOTA: Se prepararon diferentes concentraciones de CP para permitir la administración de volúmenes iguales de solución farmacológica a ratones que reciben diferentes dosis de CP.
   3. Tratar a los animales con CP (i.p.) y DS (p.o.) una vez al día durante 2 días. Dar DS (p.o.) 2 h después de cada dosis de CP.
      NOTA: DS disminuye la urotoxicidad de CP en ratones, y se ha sugerido que la CP combinada con DS tiene neutropenia más duradera que los animales tratados solo con CP¹⁰ El régimen de dosis de CP podría necesitar ser predeterminado antes de los estudios reales y se encontró que varía ligeramente entre diferentes cepas de ratón inmunodeficientes.
   4. Recoger muestras de sangre del seno venoso orbital y transferir a tubos recubiertos edTA-K en hielo en el día 0 (1 h antes de la^1a dosis), día 2 (24 h después de la 2a dosis) y día 4 (72 h después de la 2a dosis).
   5. Examine el efecto de mieloablación después del tratamiento con CP y DS por FACS. Utilice rat antiratón CD11b (M1/70), rat antiratón Ly6C (HK1.4, ) y rat antiratón Ly6G (1A8) para el gating CD11b⁺ Ly6G^alto como neutrófilos, CD11b⁺Ly6C^alto como monocitos^11,12.
   6. Registre el peso corporal y las condiciones de salud de los ratones diariamente durante una semana. La dosis óptima de CP y DS se determina como el régimen que resulta en el agotamiento máximo de neutrófilos y monocitos sin causar toxicidad grave para los ratones.
2. Trasplante de PBMC humano e injerto tumoral: configuración del modelo
   1. Aísle los PMAC humanos de los donantes sanos por centrifugación de gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Pre-tratar a los ratones con CP y DS como se indica en los pasos 1.1.2 y 1.1.3 para aumentar la eficiencia del trasplante.
   3. 20 a 24 h después de la segunda dosis de CP y DS, inyectar la línea celular tumoral humana como las células A431 (ATCC, 2.5 x 10⁶) y 5 x 10⁶ PMC aislados (mezclados en un total de 200 Solución salina con fosfato de L.L (PBS) que contiene 50% Matrigel) , o fragmentos tumorales (3 x 3 x 3 mm³, en un volumen total de 200 áL de PBS que contenga 50% Matrigel) y 200 ml de 5 x 10⁶ PPM (100 ml cada uno al lado izquierdo y derecho del fragmento tumoral injertado) (s.c.) por vía subcutánea en el flanco derecho de los animales.
   4. Mida el volumen del tumor primario y registre dos veces por semana durante 4-6 semanas.
      NOTA: Los ratones serán eutanasiados una vez que sus pesos corporales pierdan más del 20% o su volumen tumoral alcance los 2.000 mm³ o el tumor se ulcere.
   5. Eutanasia a los ratones en cámaras de gas con dióxido de carbono. Recoger los tejidos tumorales enteros en ratones sacrificados con tijeras oftálmicas y procesarlos para el análisis de histología e inmunohistoquímica (IHC). Examine las expresiones Human CD8, PD-1 y PD-L1 en estos tejidos. Consulte el paso 4 del protocolo.

2. Pantalla del donante PBMC

1. Pantalla un panel de donantes de PBMC debido a las variaciones previstas resultantes de los PBMC recogidos de individuos. Utilice células A431 co-inyectantes con PPM de diferentes donantes de acuerdo con los procedimientos indicados en el paso 1.2.
   NOTA: Más de 50 donantes de PBMC sanos fueron examinados en el estudio con el fin de obtener suficiente número de donantes adecuados. Los investigadores que deseen adoptar este protocolo podrían decidir por sí mismos cuántos donantes pBMC sanos se examinarán, basándose en el diseño de los estudios planificados.
2. Controle el volumen del tumor dos veces por semana midiendo con una pinza.
   NOTA: La tasa de crecimiento del tumor puede variar con PBMC de diferentes donantes.
3. Recoger los tejidos tumorales a un volumen promedio de 200-500 mm³ y procesarlos para el análisis histológico e inmunohistoquímico (IHC). Examine las expresiones humanas CD8, PD-1 y PD-L1. Consulte el paso 4 para obtener un protocolo detallado.
4. Seleccione los donantes de PBMC que resulten en un crecimiento tumoral moderado (volumen tumoral > 200 mm³ 14 días después de la inoculación) y expresiones relativamente altas de PD-1, PD-L1 y CD8 (puntuaciones medias de IHC > 2). Consulte el paso 4 para obtener un protocolo detallado de puntuación IHC.

3. Línea celular de cáncer humano y pantalla PDX

1. Las líneas celulares de la pantalla y los PDX de acuerdo con los procedimientos indicados en el paso 1.2, para evaluar la tasa de crecimiento tumoral, la expresión humana de PD-L1 de los tumores y las infiltraciones de células inmunitarias.
   NOTA: Más de 30 líneas celulares de cáncer humano y más de 20 PDX de diferentes tipos de cáncer fueron examinados por los autores. Los datos de los modelos de tumores seleccionados se mostraron en la sección de resultados.

4. Inmunohistoquímica (IHC)

1. Cosecha como se indica en el paso 1.2.5 y fijar los tejidos tumorales sumergiendo en la formalina. Deshidratar e incrustar tejidos fijos en parafina. Seccione los tejidos fijos a 3 m y colóquelos en diapositivas recubiertas de polilisina.
2. Desparaffinizar en xilofenos tres veces 7 min cada uno. Hidratar las secciones a través de alcoholes clasificados: 100% etanol dos veces durante 3 minutos cada uno, seguido de 90%, 80% y 70% etanol a su vez durante 3 min cada uno. Enjuague con H₂O desionizado tres veces y retire el exceso de líquido de los portaobjetos.
3. Realice la recuperación de antígenos colocando las diapositivas en un recipiente y cubra con un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6.0) o Tris-EDTA (pH 9.0). Calentar el recipiente de portaobjetos por microondas durante 3 minutos Hervir en un baño de agua a 95 oC durante 30 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente. Enjuague con H₂O desionizado tres veces y aspire el exceso de líquido de los portaobjetos.
4. Bloquear las secciones en un 3% de albúmina sérica bovina en PBS para 1 h y 0,3% H₂O₂ solución en PBS durante 10 minutos, Mancha por anticuerpos contra CD8 humano (EP334), PD-1 (NAT105, ) y PD-L1 (E1L3N) a 4 oC durante la noche, y HRP conjugado 2^nd anticuerpos en RT durante 1 h. Suelte el sustrato DAB (3,3'-diaminobenzidina) en las diapositivas y controle el tiempo de reacción (segundos a minutos) monitoreando el color marrón desde el microscopio.
5. Cubra los portaobjetos con bálsamo neutro después de sumergir los portaobjetos en alcohol de ácido clorhídrico al 0,5% y 0,5% de agua de amoníaco a su vez durante 5 s cada uno, luego en 80%, 90% y 100% etanol en secuencia durante 3 minutos cada uno, y finalmente en xilomes utilizando tres cambios para 5 min cada uno. Detectar los anticuerpos observando el color marrón de DAB utilizando el microscopio.
   NOTA: La expresión de CD8 y PD-1 humano sobre leucocitos infiltrantes tumorales (TIL) se evaluó asignando una puntuación de expresión en una escala de 5 puntos (puntuación IHC, rango 0-4) con un aumento de objetivos alto (20x, 40x). 0, ausente; 1, intensidad débil / menos de 20% de las células; 2, intensidad débil a moderada / 20%-50% células; 3, intensidad moderada a fuerte / 50%-80% células; 4, intensidad fuerte / más del 80% de las células. La tinción humana de PD-L1 dentro de las células tumorales se puntuó utilizando un sistema de puntuación ajustado en una escala de 5 puntos (puntuación IHC, rango 0-4) debido a su señal relativamente difusa. 0, ausente; 1, intensidad débil / menos de 10% de las células; 2, células de intensidad débil a moderada/10%-30%; 3, células moderadas / 30%-50%; 4, intensidad fuerte / más del 50% de las células.

5. In Vivo eficacia y estudios de farmacodinámica en modelos humanizados de xenoinjerto PBMC-NOD/SCID

1. Pre-tratar ratones NOD/SCID como se indica en el paso 1.1.3. En resumen, tratar a los ratones con 100 mg/kg de CP (i.p.) y 125 mg/kg DS (p.o.) una vez al día durante 2 días.
2. 20 a 24 h después de la segunda dosis, inyectar por vía subcutánea (s.c.) con el número indicado de células cancerosas humanas y 2,5-5 x 10⁶ PPAR (un total de 200 ml de mezcla celular en 50% Matrigel) en el flanco derecho de los animales.
   NOTA: El número de PBMC utilizado para cualquier ratón individual en un solo estudio debe ser el mismo. Sin embargo, debido a las variaciones en la disponibilidad de PBMC aislado total en el momento de cada estudio, los autores han optado por utilizar 2.5 x 10⁶, 4 x 10^6,o 5 x 10⁶ PBMC en diferentes estudios. Aunque esta diferencia de 2 veces en la cantidad administrada de PPBMc podría afectar el grado de humanización, los autores no observan diferencias significativas en la evaluación de las eficacias antitumorales de las inmunoterapias probadas.
3. Para el injerto de PDX, inyectar por vía subcutánea fragmentos tumorales (3 x 3 x 3 mm³) en el flanco frontal derecho de los animales. Inyectar por vía subcutánea 200 l de 5 x 10⁶ PBMCs (100 ml por cada lado) a la izquierda y a la derecha del fragmento tumoral injertado.
   NOTA: Los tejidos tumorales PDX se administraron en una solución de Matrigel, como se describe para los modelos de línea celular.
4. El día de la inoculación celular, agrupar aleatoriamente a los animales y tratar como el protocolo de estudio planificado.  Evaluar la actividad antitumoral de los fármacos candidatos, BGB-A317 (QW, i.p.) en este caso, a las dosis indicadas en varios modelos tumorales.
   NOTA: Las tres líneas celulares de cáncer humano (es decir, A431 (carcinoma epidemoide), SKOV3 (cáncer de ovario) y SK-MES-1 (cáncer de pulmón)), así como dos modelos de PDX (es decir, BCLU-054 (cáncer de pulmón) y BCCO-028 (cáncer de colon)), se consideran buenos modelos de tratamientos tumorales para la terapia de I-O para la terapia de I-O evaluación en este modelo de ratón humanizado.
5. Mida el volumen del tumor primario dos veces por semana, usando una pinza.
   NOTA: Gand pérdida de peso corporal se observaron alrededor de 4-6 semanas después del injerto de PBMC en nuestros estudios, permitiendo una ventana de 1-2 meses para evaluaciones de eficacia terapéutica.
6. Para el análisis farmacodinámico de las células inmunitarias infiltradas tumorales, cortar los tejidos tumorales en trozos pequeños y digerirlos con colagenasa tipo I (1 mg/ml) y DNase I (100 g/ml) en RPMI1640 más 5% de suero bovino fetal (FBS) durante 30 min a 37 oC. Pasar los tejidos digeridos a través de coladores celulares de 40 m para obtener suspensiones de una sola célula.
7. Lave las células y ajuste el número de celda a una concentración de 1 x 10⁷ células/ml en el tampón FACS helado (PBS, 1% FBS) en placas inferiores redondas de 96 pocillos. Lavar las células centrifugando y bloquearlas añadiendo 20 g/ml de IgG humano durante 30 min, seguido de la tinción con anticuerpos antihumanos CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) y PD-1 (MIH4) a 4 oC durante 30 minutos. A continuación, someta las muestras manchadas a la citometría de flujo y analizar usando guavaSoft 3.1.1.

Resultados

Siguiendo los procedimientos presentados aquí, se estableció con éxito un modelo de xenoinjerto humanizado basado en PBMC. En resumen, los efectos de la mieloablación CP en ratones NOD/SCID se determinaron mediante el análisis de citometría de flujo de poblaciones de neutrófilos y monocitos después del tratamiento con CP y DS (Figura1). 100 mg/kg CP más 125 mg/kg DS se determinó como la dosis óptima y se utilizó en estudios posteriores, ya que el régimen da como resultado el ago...

Discusión

Nuestro conocimiento del desarrollo y progresión del cáncer ha avanzado significativamente en los últimos años, centrándose en una comprensión integral tanto de las células tumorales como de su estroma asociado. Aprovechar los mecanismos inmunitarios del huésped podría inducir un mayor impacto contra las células cancerosas, lo que representa una estrategia de tratamiento prometedora. Los modelos murinos con sistemas inmunes de ratón intactos, como los modelos singéneos y GEM, se han utilizado ampliamente para...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMC separation /cell culture
Histopaque-1077	Sigma	10771	Cell isolation
DMEM	Corning	10-013-CVR	Cell culture
DPBS	Corning	21-031-CVR	Cell culture
FBS	Corning	35-076-CV	Cell culture
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140-163	Cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-114	Cell culture
Matrigel	Corning	356237	CDX inoculation
FACS analysis
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	DN25	Sample preparation
Collagenase Type I	Sigma	C0130	Sample preparation
Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody	BioLegend	101206	FACS
Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody	BioLegend	128008	FACS
Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody	BioLegend	127614	FACS
Anti-human CD8 (OKT8) antibody	Sungene Biotech	H10082-11H	FACS
Anti-human CD279 (MIH4) antibody	eBioscience	12-9969-42	FACS
Anti-human CD3 (HIT3a) antibody	4A Biotech	--	FACS
Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer	Millipore	0500-4008	FACS
Tumor/PDX implantation /dosing / measurement
Cyclophosphamide	J&K	Cat#419656, CAS#6055-19-2	In vivo efficacy
Disulfiram	J&K	Cat#591123, CAS#97-77-8	In vivo efficacy
Syringe	BD	300841	CDX inoculation
Hypodermic needles (14G)	Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd.	0.7*32 TW SB	PDX inoculation
Vernier Caliper (MarCal)	Mahr	16ER	Tumor measurement
IVC individual ventilated cages	Lingyunboji Ltd.	IVC-128	Animal facility
IHC
Leica ASP200 Vacuum tissue processor	Leica	ASP200	IHC
Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning	Leica	RM2235	IHC
Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module	Leica	EG1150 H	IHC
Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner	Leica	Ariol	IHC
Anti-human CD8 (EP334) antibody	ZSGB-Bio	ZA-0508	IHC
Anti-human PD1 [NAT105] antibody	Abcam	ab52587	IHC
Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody	Cell Signaling Technology	13684S	IHC
Polink-2 plus Polymer HRP Detection System	ZSGB-Bio	PV-9001/9002	IHC