Un ormone e mezzo umano (PBMC) Un modello di Xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale (I-O)

Riepilogo

Descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello murino xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale. Questo protocollo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli simili per la valutazione della terapia I-O.

Abstract

La scoperta e lo sviluppo della terapia immuno-oncologica (I-O) negli ultimi anni rappresenta una pietra miliare nel trattamento del cancro. Tuttavia, le sfide del trattamento persistono. Modelli animali robusti e rilevanti per le malattie sono risorse vitali per la continua ricerca e sviluppo preclinico al fine di affrontare una serie di ulteriori punti di controllo immunitari. Qui, descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello di xenotrapianto umanizzato. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorpo umanosa sperimentale anti-PD-1 nello sviluppo clinico in fase avanzata, viene utilizzato come esempio per discutere la configurazione della piattaforma, la caratterizzazione del modello e le valutazioni di efficacia dei farmaci. Questi topi umanizzati supportano la crescita della maggior parte dei tumori umani testati, consentendo così la valutazione delle terapie I-O nel contesto dell'immunità umana e dei tumori umani. Una volta stabilito, il nostro modello è relativamente conveniente e conveniente, e di solito produce risultati altamente riproducibili. Suggeriamo che il protocollo descritto in questo articolo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire modelli murini ricostituiti con PBMC umano e tumori per la ricerca I-O.

Introduzione

L'immuno-oncologia (I-O) è un campo di trattamento del cancro in rapida espansione. I ricercatori hanno recentemente iniziato ad apprezzare il potenziale terapeutico di modulare le funzioni del sistema immunitario per attaccare i tumori. I blocchi dei checkpoint immunitari hanno dimostrato attività incoraggianti in una varietà di tipi di cancro, tra cui melanoma, carcinoma a cellule renali, testa e collo, polmone, vescica e tumori della prostata^1,2. Contrariamente alle terapie mirate che uccidono direttamente le cellule tumorali, le terapie I-O potenziano il sistema immunitario del corpo per attaccare i tumori³.

Ad oggi, sono stati istituiti numerosi modelli animali I-O pertinenti. Questi includono: 1) linee cellulari tumorali del topo o tumore ominofotra nei topi sinogenici; 2) tumori spontanei derivati da topo geneticamente ingegnerizzato (GEM) o induzione cancerogena; 3) GEM chimerici con l'abbattimenti di bersagli di droga umana in un sistema immunitario murino funzionale; e 4) topi con immunità umana ricostituita trapiantati con cellule tumorali umane o xenograforiti derivati dal paziente (PDX). Ognuno di questi modelli hanno evidenti vantaggi e limitazioni, che sono stati descritti e rivisti ampiamente altrove⁴.

La ricostituzione dell'immunità umana nei topi immunodeficienti è stata apprezzata come approccio clinicamente rilevante per la ricerca I-O traslazionale. Questo è di solito ottenuto attraverso 1) innesto di cellule immunitarie adulte (ad esempio, cellule mononucleari del sangue periferico (PMBC))^5,6, o 2) innesto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da, ad esempio, sangue cordonale ombelicale o fetale fegato^7,8. Questi topi umanizzati potrebbero sostenere la crescita dei tumori umani, consentendo così la valutazione delle terapie I-O nel contesto dell'immunità umana e dei tumori umani. Nonostante i vantaggi, le applicazioni dei topi umanizzati nella ricerca I-O sono state solitamente ostacolate da diverse preoccupazioni, come lunghi tempi di sviluppo del modello e costi notevolmente elevati.

Qui, descriviamo un modello umano basato su PBMC che potrebbe essere ampiamente applicato per gli studi I-O traslazionali. Questo modello è relativamente conveniente e conveniente con un'elevata riproducibilità negli studi di efficacia. È stato utilizzato internamente per le valutazioni di diverse terapie I-O attualmente in fase di sviluppo preclinico e clinico. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorpo umanoso sperimentale anti-PD-1⁹ , viene utilizzato come esempio per discutere lo sviluppo del modello, la caratterizzazione e le possibili applicazioni per le analisi di efficacia anti-tumorale.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite negli studi che hanno coinvolto partecipanti umani erano conformi agli standard etici di BeiGene e/o comitato nazionale di ricerca e con la dichiarazione di Helsinki del 1964 e le sue successive modifiche o norme etiche comparabili. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i singoli partecipanti inclusi nello studio. Tutte le procedure eseguite negli studi riguardanti animali sono state approvate dall'Internal Review Board di BeiGene. Questo protocollo è stato specificamente modificato per la valutazione del BGB-A317 (Tislelizumab) in topi UMD/SCID umanizzati.

1. Istituzione del modello umano basato su PBMC

1. Mieloablazione dei topi NOD/SCID che utilizzano ciclofosfamide: determinazione delle dosi ottimali
   1. Acquista topi femmina NOD/SCID (6-8 settimane).
      NOT: Tutti i topi coinvolti in questo studio erano di sesso femminile.
   2. Preparare la ciclofosfore (CP) a dosi diverse (50, 100 e 150 mg/kg) in salina. Preparare il disulfiram (DS) in 0,8% Tween-80 in salina a 125 mg/kg.
      NOTA: diverse concentrazioni di CP sono state preparate per consentire la somministrazione di pari volumi di soluzione farmacologica ai topi che ottengono diverse dosi di CP.
   3. Trattare gli animali con CP (i.p.) e DS (p.o.) una volta al giorno per 2 giorni. Dare DS (p.o.) 2 h dopo ogni dose di CP.
      NOT: DS diminuisce l'urotossicità della CP nei topi, e CP combinato con DS è stato suggerito di avere neutropenia più duratura rispetto agli animali trattati con CP da solo¹⁰ Il regime di dose di CP potrebbe essere necessario pre-determinato prima di studi effettivi e si è scoperto che varia leggermente tra diversi ceppi di topo immunodeficienti.
   4. Raccogliere campioni di sangue dal seno venoso orbitale e trasferire ai tubi rivestiti EDTA-K sul ghiaccio il giorno 0 (1 h prima della dose di 1^st), giorno 2 (24 h dopo la dose 2^nd) e giorno 4 (72 h dopo la dose di 2^nd).
   5. Esaminare l'effetto di mieloablazione dopo il trattamento CP e DS da parte di FACS. Utilizzare ratto anti-topo CD11b (M1/70), ratto anti-topo Ly6C (HK1.4, ) e ratto anti-topo Ly6G (1A8) per gating CD11b^- Ly6G^alto come neutrofili, CD11b^-Ly6C^alto come monociti^11,12.
   6. Registrare il peso corporeo e le condizioni di salute dei topi ogni giorno per una settimana. La dose ottimale di CP e DS è determinata come il regime che si traduce nel massimo esaurimento di neutrofili e monociti senza causare una grave tossicità ai topi.
2. Trapianto di PBMC umano e innesto tumorale: set-up del modello
   1. Isolare i PBMC salvici umani da donatori sani per centricizione del gradiente di densità secondo le istruzioni del produttore.
   2. Pretrattare i topi con CP e DS come indicato al punto 1.1.2 e 1.1.3 per aumentare l'efficienza dei trapianti.
   3. 20 a 24 h dopo la seconda dose di CP e DS, iniettare la linea cellulare tumorale umana come le cellule A431 (ATCC, 2,5 x 10⁶) e 5 x 10⁶ PBMC isolati (mescolato in un totale di 200L -fosfato-buffered saline (PBS) contenente il 50% Matrigel) , o frammenti tumorali (3 x 3 x 3 mm³, in un volume totale di 200 PBS contenenti il 50% di Matrigel) e 200 -L di 5 x 10⁶ PBMC (100 ll'L ciascuno a sinistra e a destra del frammento tumorale innestato) (s.c.) sottocutaneamente nel fianco destro degli animali.
   4. Misurare il volume primario del tumore e registrare due volte a settimana per 4-6 settimane.
      NOT: I topi saranno eutanasia una volta che i loro pesi corporei perdono oltre il 20% o il loro volume tumorale raggiunge 2.000 mm³ o il tumore è ulcerato.
   5. Eutanasia i topi in camere a gas con anidride carbonica. Raccogliere tutti i tessuti tumorali in topi sacrificati con forbici oftalmiche ed elaborarli per l'analisi istologica e immunoistochimica (IHC). Esaminare le espressioni Human CD8, PD-1 e PD-L1 in questi tessuti. Vedere il passaggio 4 del protocollo.

2. Schermo del donatore PBMC

1. Visualizzate lo schermo di un gruppo di donatori PBMC a causa delle variazioni previste derivanti dai PBMC raccolti da individui. Utilizzare le cellule A431 in co-iniettamento con PBMC di donatori diversi secondo le procedure indicate dal punto 1.2.
   NOT: Oltre 50 donatori PBMC sani sono stati sottoposti a screening nello studio per ottenere un numero sufficiente di donatori idonei. I ricercatori che desiderano adottare questo protocollo potrebbero decidere autonomamente quanti donatori pbMC sani devono essere sottoposti a screening, sulla base della progettazione degli studi pianificati.
2. Monitorare il volume del tumore due volte a settimana misurando con una pinza.
   NOT: Il tasso di crescita del tumore può variare con PBMC da diversi donatori.
3. Raccogliere i tessuti tumorali ad un volume medio di 200-500 mm³ e elaborarli per l'analisi istituiologia e immunoistochimica (IHC). Esaminare le espressioni umane CD8, PD-1 e PD-L1. Vedere il passaggio 4 per il protocollo dettagliato.
4. Selezionare i donatori PBMC che provocano una crescita moderata del tumore (volume tumorale > 200 mm³ 14 giorni dopo l'inoculazione) e espressioni PD-1, PD-L1 e CD8 relativamente alte (punteggi iHC significati > 2). Vedere il passaggio 4 per il protocollo di punteggio IHC dettagliato.

3. Linea cellulare del cancro umano e schermo PDX

1. Linee cellulari dello schermo e PDX secondo le procedure indicate nel passaggio 1.2, per valutare il tasso di crescita del tumore, espressione umana PD-L1 dei tumori e infiltrazioni di cellule immunitarie.
   NOT: Gli autori hanno esaminato oltre 30 linee cellulari di cancro umano e oltre 20 PDX di diversi tipi di cancro. I dati dei modelli tumorali selezionati sono stati mostrati nella sezione dei risultati.

4. Immunoistochimica (IHC)

1. Raccogliere come indicato dal punto 1.2.5 e fissare i tessuti tumorali immergendosi nella formalina. Disidratare e incorporare tessuti fissi in paraffina. Sezionare i tessuti fissi a 3 m e metterli su vetrini rivestiti in polilisina.
2. Deparaffinizzare negli xileni tre volte 7 min ciascuno. Idratare le sezioni attraverso alcoli graduati: 100% etanolo due volte per 3 min ciascuno, seguito da 90%, 80% e 70% etanolo a sua volta per 3 min ciascuno. Risciacquare da deionizzato H₂O tre volte e rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini.
3. Eseguire il recupero dell'antigene inserendo i vetrini in un contenitore e coprire con 10 mM di tampone di citrati di sodio (pH 6.0) o Tris-EDTA (pH 9.0). Riscaldare il contenitore dei vetrini a microonde per 3 min. Far bollire in un bagno d'acqua a 95 gradi centigradi per 30 minuti e poi raffreddare a temperatura ambiente. Risciacquare da deionizzato H₂O tre volte e aspirare liquido in eccesso dai vetrini.
4. Bloccare le sezioni del 3% di albumina di siero bovino in PBS per 1 h e 0,3% H₂O₂ soluzione in PBS per 10 min. Stain da anticorpi contro l'uomo CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) e PD-L1 (E1L3N) a 4 gradi centigradi, e HRP ha jugated 2^nd antibodies a RT per 1 h. Far cadere il DAB del substrato (3,3'-diaminobenzidina) sui vetrini e controllare il tempo di reazione (secondi a minuti) monitorando il colore marrone dal microscopio.
5. Coprire i vetrini con balsamo neutro dopo aver immerso i vetrini in alcool acido cloridrico dello 0,5% e 0,5% di acqua ammoniaca a sua volta per 5 s ciascuno, quindi in 80%, 90% e 100% etanolo in sequenza per 3 min ciascuno, e infine in xilene utilizzando tre modifiche per 5 min ciascuno. Rilevare gli anticorpi osservando il colore marrone del DAB al microscopio.
   NOT: L'espressione umana CD8 e PD-1 sui leucociti infiltrati da tumori (TIL) è stata valutata assegnando un punteggio di espressione su una scala di 5 punti (punteggio IHC, intervallo 0-4) con un ingrandimento obiettivo elevato (20x, 40x). 0, assente; 1, intensità debole / meno del 20% di cellule; 2, intensità da debole a moderata/ 20%-50% cellule; 3, intensità da moderata a forte/ 50%-80% cellule; 4, forte intensità / più di 80% cellule. La colorazione umana PD-L1 all'interno delle cellule tumorali è stata valutata utilizzando un sistema di punteggio regolato su una scala di 5 punti (punteggio IHC, intervallo 0-4) a causa del suo segnale relativamente diffuso. 0, assente; 1, intensità debole / meno del 10% di cellule; 2, intensità da debole a moderata/10%-30% cellule; 3, moderata/ 30%-50% cellule; 4, forte intensità / più del 50% di cellule.

5. In Vivo efficacia e studi di farmacodinamica in modelli umanizzati PBMC-NOD/SCID Xenograft

1. Pre-trattare i topi NOD/SCID come indicato dal punto 1.1.3. In breve, trattare i topi con 100 mg/kg CP (i.p.) e 125 mg/kg DS (p.o.) una volta al giorno per 2 giorni.
2. 20 a 24 h dopo la seconda dose, iniettare sottocutaneamente (s.c.) con il numero indicato di cellule tumorali umane e 2,5-5 x 10⁶ PBMC (un totale di 200 - miscela di cellule L nel 50% Matrigel) nel fianco anteriore destro degli animali.
   NOT: Il numero di PBMC utilizzati per ogni singolo topo in un singolo studio dovrebbe essere lo stesso. Tuttavia, a causa delle variazioni nella disponibilità di PBMC completamente isolato al momento di ogni studio, gli autori hanno scelto di utilizzare 2,5 x 10⁶, 4 x 10⁶o 5 x 10⁶ PBMC in diversi studi. Anche se questa differenza di due volte nella quantità somministrata di PBC potrebbe influenzare il grado di umanizzazione, gli autori non osservano differenze significative nella valutazione degli effetti anti-tumorali delle immunoterapie testate.
3. Per l'innesto di PDX, iniettare frammenti tumoralisottocutaneamente (3 x 3 x 3 mm 3) nel fianco anteriore destro degli animali. Iniettare sottocutaneamente 200 luna di 5 x 10⁶ PBMC (100 gradi l per lato) a sinistra ea destra del frammento tumorale innestato.
   NOT: I tessuti tumorali PDX sono stati somministrati in una soluzione Matrigel, come descritto per i modelli di linea cellulare.
4. Il giorno dell'inoculazione cellulare, raggruppare casualmente gli animali e trattare come il protocollo di studio previsto.  Valutare l'attività anti-tumorale dei farmaci candidati, BGB-A317 (QW, i.p.) in questo caso, alle dosi indicate in vari modelli tumorali.
   NOT: Le tre linee cellulari del cancro umano (ad esempio, A431 (carcinoma epidemoid), SKOV3 (cancro ovarico) e SK-MES-1 (cancro del polmone)), così come due modelli PDX (cioè BCLU-054 (cancro al polmone) e BCCO-028 (cancro del colon)), sono considerati buoni modelli tumorali per la terapia I-O valutazione in questo modello murino umanizzato.
5. Misurare il volume del tumore primario due volte alla settimana, utilizzando una pinza.
   NOT: Perdita di pesi corporei Gand sono stati osservati intorno 4-6 settimane post innesto PBMC nei nostri studi, permettendo una finestra di 1-2 mesi per valutazioni di efficacia terapeutica.
6. Per l'analisi farmacodinamica delle cellule immunitarie infiltrate da tumore, tagliare i tessuti tumorali in piccoli pezzi e digerirli con tipo di collagenae I (1 mg/mL) e DNase I (100 g/mL) in RPMI1640 più il 5% del siero bovino fetale (FBS) per 30 min a 37 . Passare i tessuti digeriti attraverso ceppi cellulari da 40 m per ottenere sospensioni a cella singola.
7. Lavare le cellule e regolare il numero di cellule ad una concentrazione di 1 x 10⁷ celle / mL nel buffer FACS freddo ghiaccio (PBS, 1% FBS) in piastre inferiori rotonde 96-pozzo. Lavare le cellule centrifugiandole e bloccarle aggiungendo 20 G/mL di Ig umano per 30 min, seguito dalla colorazione con anticorpi anti-umani CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) e PD-1 (MIH4) a 4 gradi centigradi per 30 min. Quindi sottomettere i campioni macchiati a flusso di citometria e analizzare utilizzando guavaSoft 3.1.1.

Risultati

Seguendo le procedure qui presentate, è stato stabilito con successo un modello di xenotrapianto umanizzato basato su PBMC. In breve, gli effetti di mieloablazione CP nei topi NOD/SCID sono stati determinati dall'analisi della citometria di flusso delle popolazioni di neutrofili e monociti dopo il trattamento cp e DS (Figura 1). 100 mg/kg CP più 125 mg/kg DS è stato determinato come la dose ottimale e utilizzato negli studi successivi come il regime si traduce nel massimo esaurimento di n...

Discussione

La nostra conoscenza dello sviluppo e della progressione del cancro è progredita in modo significativo negli ultimi anni, con particolare attenzione a una comprensione completa sia delle cellule tumorali che del suo stroma associato. Sfruttare i meccanismi immunitari ospiti potrebbe indurre un maggiore impatto sulle cellule tumorali, rappresentando una promettente strategia di trattamento. I modelli Murine con sistema immunitario murino intatto, come i modelli singenici e GEM, sono stati ampiamente utilizzati per studia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMC separation /cell culture
Histopaque-1077	Sigma	10771	Cell isolation
DMEM	Corning	10-013-CVR	Cell culture
DPBS	Corning	21-031-CVR	Cell culture
FBS	Corning	35-076-CV	Cell culture
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140-163	Cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-114	Cell culture
Matrigel	Corning	356237	CDX inoculation
FACS analysis
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	DN25	Sample preparation
Collagenase Type I	Sigma	C0130	Sample preparation
Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody	BioLegend	101206	FACS
Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody	BioLegend	128008	FACS
Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody	BioLegend	127614	FACS
Anti-human CD8 (OKT8) antibody	Sungene Biotech	H10082-11H	FACS
Anti-human CD279 (MIH4) antibody	eBioscience	12-9969-42	FACS
Anti-human CD3 (HIT3a) antibody	4A Biotech	--	FACS
Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer	Millipore	0500-4008	FACS
Tumor/PDX implantation /dosing / measurement
Cyclophosphamide	J&K	Cat#419656, CAS#6055-19-2	In vivo efficacy
Disulfiram	J&K	Cat#591123, CAS#97-77-8	In vivo efficacy
Syringe	BD	300841	CDX inoculation
Hypodermic needles (14 G)	Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd.	0.7*32 TW SB	PDX inoculation
Vernier Caliper (MarCal)	Mahr	16ER	Tumor measurement
IVC individual ventilated cages	Lingyunboji Ltd.	IVC-128	Animal facility
IHC
Leica ASP200 Vacuum tissue processor	Leica	ASP200	IHC
Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning	Leica	RM2235	IHC
Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module	Leica	EG1150 H	IHC
Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner	Leica	Ariol	IHC
Anti-human CD8 (EP334) antibody	ZSGB-Bio	ZA-0508	IHC
Anti-human PD1 [NAT105] antibody	Abcam	ab52587	IHC
Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody	Cell Signaling Technology	13684S	IHC
Polink-2 plus Polymer HRP Detection System	ZSGB-Bio	PV-9001/9002	IHC