A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.

Zusammenfassung

Die Entdeckung und Entwicklung der Immunonkologie (I-O) in den letzten Jahren stellt einen Meilenstein in der Krebsbehandlung dar. Die Behandlungsherausforderungen bestehen jedoch nach wie vor. Robuste und krankheitsrelevante Tiermodelle sind wichtige Ressourcen für die weitere präklinische Forschung und Entwicklung, um eine Reihe zusätzlicher Immun-Checkpoints anzugehen. Hier beschreiben wir eine menschliche periphere mononukleäre Blutzelle (PBMC) – basierend auf humanisiertem Xenograft-Modell. BGB-A317 (Tislelizumab), ein humanisierter Anti-PD-1-Antikörper in der späten klinischen Entwicklung, wird als Beispiel verwendet, um Plattform-Setup, Modellcharakterisierung und Bewertungen der Arzneimittelwirksamkeit zu diskutieren. Diese humanisierten Mäuse unterstützen das Wachstum der meisten getesteten menschlichen Tumoren und ermöglichen so die Beurteilung von I-O-Therapien im Kontext sowohl der menschlichen Immunität als auch menschlicher Krebsarten. Einmal etabliert, ist unser Modell vergleichsweise zeit- und kostengünstig und liefert in der Regel sehr reproduzierbare Ergebnisse. Wir schlagen vor, dass das in diesem Artikel beschriebene Protokoll als allgemeine Richtlinie für die Erstellung von Mausmodellen dienen könnte, die mit humanem PBMC und Tumoren für die I-O-Forschung rekonstituiert wurden.

Einleitung

Die Immunonkologie (I-O) ist ein schnell wachsendes Feld der Krebsbehandlung. Forscher haben vor kurzem begonnen, das therapeutische Potenzial der modulationsfähigen Funktionen des Immunsystems zu schätzen, um Tumore anzugreifen. Immun-Checkpoint-Blockaden haben ermutigende Aktivitäten bei einer Vielzahl von Krebsarten gezeigt, einschließlich Melanom, Nierenzellkarzinom, Kopf und Hals, Lunge, Blase und Prostatakrebs^1,2. Im Gegensatz zu gezielten Therapien, die Krebszellen direkt abtöten, potenzieren I-O-Therapien das Immunsystem des Körpers, um Tumore anzugreifen³.

Bis heute wurden zahlreiche relevante I-O-Tiermodelle etabliert. Dazu gehören: 1) Maustumorzelllinien oder Tumorhomograft bei syngenischen Mäusen; 2) spontane Tumoren, die aus gentechnisch veränderter Maus (GEM) oder karzinogener Induktion stammen; 3) chimäre GEMs mit dem Knock-in von humanen Drogenzielen in einem funktionellen murinen Immunsystem; und 4) Mäuse mit rekonstituierter menschlicher Immunität, transplantiert mit menschlichen Krebszellen oder vom Patienten abgeleiteten Xenografts (PDXs). Jedes dieser Modelle hat offensichtliche Vorteile sowie Einschränkungen, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben und überprüft wurden⁴.

Die Rekonstitution der menschlichen Immunität bei immundefizienten Mäusen wurde zunehmend als klinisch relevanter Ansatz für translationale I-O-Forschung geschätzt. Dies wird in der Regel entweder durch 1) Transplantation von adulten Immunzellen (z. B. periphere mononukleäre Blutzellen (PMBC))^5,6oder 2) Transplantation hämatopoetischer Stammzellen (HSC) aus z. B. Nabelschnurblut oder fetalem Leber^7,8. Diese humanisierten Mäuse könnten das Wachstum menschlicher Tumoren unterstützen und so die Beurteilung von I-O-Therapien im Kontext sowohl der menschlichen Immunität als auch menschlicher Krebsarten ermöglichen. Trotz der Vorteile wurden Anwendungen von humanisierten Mäusen in der I-O-Forschung in der Regel durch mehrere Bedenken behindert, wie lange Modellentwicklungszeit und erheblich hohe Kosten.

Hier beschreiben wir ein menschliches PBMC-basiertes Modell, das für translationale I-O-Studien weit verbreitet sein könnte. Dieses Modell ist vergleichsweise zeit- und kostengünstig mit hoher Reproduzierbarkeit in Wirksamkeitsstudien. Es wurde intern für die Evaluierung mehrerer I-O-Therapeutika verwendet, die sich derzeit in der präklinischen und klinischen Entwicklung befinden. BGB-A317 (Tislelizumab), ein humanisierter Anti-PD-1-Antikörper⁹ , wird als Beispiel verwendet, um Modellentwicklung, Charakterisierung und mögliche Anwendungen für Anti-Tumor-Wirksamkeitsanalysen zu diskutieren.

Protokoll

Alle Verfahren, die in Studien mit menschlichen Teilnehmern durchgeführt wurden, entsprachen den ethischen Standards von BeiGene und/oder dem nationalen Forschungsausschuß sowie der Erklärung von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards. Von allen einzelnen Teilnehmern, die an der Studie teilnahmen, wurde die informierte Zustimmung eingeholt. Alle Verfahren, die in Studien mit Tieren durchgeführt wurden, wurden vom Internal Review Board bei BeiGene genehmigt. Dieses Protokoll wurde speziell für die Bewertung von BGB-A317 (Tislelizumab) bei humanisierten NOD/SCID-Mäusen angepasst.

1. Etablierung eines menschlichen PBMC-basierten Modells

1. Myeloablation von NOD/SCID-Mäusen mit Cyclophosphamid: Bestimmung optimaler Dosen
   1. Kaufen Sie weibliche NOD/SCID-Mäuse (6-8 Wochen).
      HINWEIS: Alle an dieser Studie beteiligten Mäuse waren weiblich.
   2. Cyclophosphamid (CP) in verschiedenen Dosen (50, 100 und 150 mg/kg) in Derart zubereiten. Disulfiram (DS) in 0,8% Tween-80 in Saline bei 125 mg/kg vorbereiten.
      HINWEIS: Es wurden verschiedene Konzentrationen von CP vorbereitet, um die Verabreichung gleicher Mengen an Arzneimittellösung an Mäuse zu ermöglichen, die unterschiedliche Dosen von CP erhalten.
   3. Behandeln Sie die Tiere einmal täglich für 2 Tage mit CP (i.p.) und DS (p.o.). Geben Sie DS (p.o.) 2 h nach jeder Dosis CP.
      HINWEIS: DS verringert die Urotoxizität von CP bei Mäusen, und CP in Kombination mit DS wurde vorgeschlagen, länger anhaltende Neutropenie als Tiere mit CP allein behandelt haben¹⁰ Das Dosisschema von CP muss möglicherweise vor den tatsächlichen Studien vorbestimmt werden und wurde festgestellt, dass es variieren würde. leicht zwischen verschiedenen immundefizienten Mausstämmen.
   4. Sammeln Sie Blutproben aus der orbitalen venösen Sinus und übertragen Sie auf EDTA-K beschichtete Röhren auf Eis am Tag 0 (1 h vor der^1. Dosis), Tag 2 (24 h nach der 2. Dosis) und Tag 4 (72 h nach der 2. Dosis).
   5. Untersuchen Sie den Myeloablationseffekt nach CP- und DS-Behandlung durch FACS. Verwenden Sie Ratte Anti-Maus CD11b (M1/70), Ratte Anti-Maus Ly6C (HK1.4, ) und Ratte Anti-Maus Ly6G (1A8) für Gating CD11b⁺ Ly6G^hoch als Neutrophile, CD11b⁺Ly6C^hoch als Monozyten^11,12.
   6. Zeichnen Sie das Körpergewicht und die gesundheitlichen Bedingungen der Mäuse täglich für eine Woche auf. Die optimale Dosis von CP und DS wird als das Regime bestimmt, das zu einer maximalen Erschöpfung von Neutrophilen und Monozyten führt, ohne dass Mäuse schwer toxizitätig sind.
2. Humane PBMC-Transplantation und Tumortransplantation: Modellaufbau
   1. Isolieren Sie menschliche PBMCs von gesunden Spendern durch Dichtegradientenzentrifugation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Vorbehandlung der Mäuse mit CP und DS gemäß Schritt 1.1.2 und 1.1.3 zur Steigerung der Transplantationseffizienz.
   3. 20 bis 24 h nach der zweiten Dosis von CP und DS, injizieren menschliche Tumorzelllinie wie A431-Zellen (ATCC, 2,5 x 10⁶) und 5 x 10⁶ isolierte PBMCs (gemischt in insgesamt 200 L phosphatgepufferter Salin (PBS) mit 50% Matrigel) , oder Tumorfragmente (3 x 3 x 3 mm³, in einem Gesamtvolumen von 200 L PBS mit 50% Matrigel) und 200 l von 5 x 10⁶ PBMCs (jeweils 100 l links und rechts des transplantierten Tumorfragments) (s.c.) subkutan in der rechten Flanke der Tiere.
   4. Messen Sie das primäre Tumorvolumen und zeichnen Sie zweimal pro Woche für 4-6 Wochen auf.
      HINWEIS: Die Mäuse werden eingeschläfert, sobald ihre Körpergewichte über 20% verlieren oder ihr Tumorvolumen 2.000 mm³ erreicht oder der Tumor ulzeriert wird.
   5. Euthanisieren Sie die Mäuse in Gaskammern mit Kohlendioxid. Sammeln Sie das gesamte Tumorgewebe in geopferten Mäusen mit einer ophthalmologischen Schere und verarbeiten Sie sie für die Histologie und Immunhistochemie (IHC) Analyse. Untersuchen Sie die menschlichen CD8-, PD-1- und PD-L1-Ausdrücke in diesen Geweben. Siehe Protokollschritt 4.

2. PBMC-Spender-Bildschirm

1. Screen eine Gruppe von PBMC-Spender aufgrund der erwarteten Variationen resultiert aus PBMCs von Einzelpersonen gesammelt. Verwenden Sie A431-Zellen, die mit PBMCs verschiedener Spender nach den in Schritt 1.2 angegebenen Verfahren koinjiziert werden.
   HINWEIS: Über 50 gesunde PBMC-Spender wurden in der Studie untersucht, um genügend geeignete Spender zu erhalten. Forscher, die dieses Protokoll übernehmen möchten, könnten auf der Grundlage des Entwurfs der geplanten Studien selbst entscheiden, wie viele gesunde PBMC-Spender gescreent werden sollen.
2. Überwachen Sie das Tumorvolumen zweimal pro Woche, indem Sie mit einem Bremssattel messen.
   HINWEIS: Tumorwachstumsrate kann mit PBMC von verschiedenen Spendern variieren.
3. Sammeln Sie das Tumorgewebe mit einem durchschnittlichen Volumen von 200-500 mm³ und verarbeiten Sie es für die Histologie und Immunhistochemie (IHC) Analyse. Untersuchen Sie menschliche CD8-, PD-1- und PD-L1-Ausdrücke. Ausführliches Protokoll finden Sie in Schritt 4.
4. Wählen Sie PBMC-Spender aus, die zu einem moderaten Tumorwachstum (Tumorvolumen > 200 mm³ 14 Tage nach der Impfung) und relativ hohen PD-1-, PD-L1- und CD8-Ausdrücken (mittlere IHC-Scores > 2) führen. Siehe Schritt 4 für detaillierte IHC-Scoring-Protokoll.

3. Menschliche Krebs-Zell-Linie und PDX-Bildschirm

1. Screen-Zelllinien und PDXs nach den in Schritt 1.2 genannten Verfahren zur Bewertung der Tumorwachstumsrate, der menschlichen PD-L1-Expression der Tumoren und der Infiltrationen von Immunzellen.
   HINWEIS: Über 30 menschliche Krebszelllinien und über 20 PDX verschiedener Krebsarten wurden von den Autoren untersucht. Die Daten ausgewählter Tumormodelle wurden im Ergebnisbereich angezeigt.

4. Immunhistochemie (IHC)

1. Ernte, wie durch Schritt 1.2.5 angegeben und Tumorgewebe durch Eintauchen in Formalin fixieren. Dehydrieren und einbetten Sie festes Gewebe in Paraffin. Die festen Gewebe auf 3 m abteilen und auf polylysinbeschichtete Dias legen.
2. Deparaffinisieren in Xylolen dreimal 7 min jeder. Hydratisieren Sie die Abschnitte durch abgestufte Alkohole: 100% Ethanol zweimal für je 3 min, gefolgt von 90%, 80% und 70% Ethanol wiederum für 3 min. Spülen Sie durch deionisierte H₂O dreimal und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Dias.
3. Führen Sie den Antigenabruf durch, indem Sie die Dias in einen Behälter legen und mit 10 mM Natriumcitratpuffer (pH 6.0) oder Tris-EDTA (pH 9.0) abdecken. Den Diabehälter mit der Mikrowelle für 3 min erhitzen. In einem Wasserbad bei 95 °C 30 min kochen und dann auf Raumtemperatur abkühlen. Spülen Sie durch deionisierte H₂O dreimal und aspirieren überschüssige Flüssigkeit aus den Dias.
4. Blockieren Sie die Abschnitte durch 3% Rinderserumalbumin in PBS für 1 h und 0,3% H₂O2 Lösung in PBS für 10 min. Stain durch Antikörper gegen humane CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) und PD-L1 (E1L3N) bei 4 °C über Nacht, und HRP konjugierte 2^nd Antikörper bei RT 1 h. Lassen Sie das Substrat DAB (3,3'-Diaminobenzidin) auf die Dias und steuern Sie die Reaktionszeit (Sekunden bis Minuten), indem Sie die braune Farbe vom Mikroskop aus überwachen.
5. Bedecken Sie die Dias mit neutralem Balsam nach dem Eintauchen der Dias in 0,5% Salzsäurealkohol und 0,5% Ammoniakwasser wiederum für je 5 s, dann in 80%, 90% und 100% Ethanol in der Reihenfolge für jeweils 3 min und schließlich in Xylole mit drei Änderungen für je 5 min. Erkennen Sie die Antikörper, indem Sie die braune Farbe von DAB mit Hilfe eines Mikroskops beobachten.
   HINWEIS: Die menschliche CD8- und PD-1-Expression auf tumorinfiltrierenden Leukozyten (TIL) wurde bewertet, indem ein Expressionswert auf einer 5-Punkte-Skala (IHC-Score, Bereich 0-4) bei hoher objektiver Vergrößerung (20x, 40x) zugewiesen wurde. 0, abwesend; 1, schwache Intensität / weniger als 20% Zellen; 2, schwache bis mäßige Intensität / 20%-50% Zellen; 3, moderate bis starke Intensität / 50%-80% Zellen; 4, starke Intensität / mehr als 80% Zellen. Die menschliche PD-L1-Färbung in Tumorzellen wurde aufgrund ihres relativ diffusen Signals mit einem angepassten Bewertungssystem auf einer 5-Punkte-Skala (IHC-Score, Bereich 0-4) bewertet. 0, abwesend; 1, schwache Intensität / weniger als 10% Zellen; 2, schwache bis moderate Intensität/10%-30% Zellen; 3, moderate/ 30%-50% Zellen; 4, starke Intensität / mehr als 50% Zellen.

5. In Vivo Wirksamkeits- und Pharmakodynamikstudien an humanisierten PBMC-NOD/SCID Xenograft-Modellen

1. Vorbehandlung von NOD/SCID-Mäusen gemäß Schritt 1.1.3. Kurz gesagt, behandeln Sie die Mäuse mit 100 mg/kg CP (i.p.) und 125 mg/kg DS (p.o.) einmal täglich für 2 Tage.
2. 20 bis 24 h nach der zweiten Dosis subkutan (s.c.) mit der angegebenen Anzahl menschlicher Krebszellen und 2,5-5 x 10⁶ PBMCs (insgesamt 200 L Zellmischung in 50% Matrigel) in der rechten vorderen Flanke von Tieren injizieren.
   HINWEIS: Die Anzahl der PBMC, die für jede einzelne Maus in einer einzigen Studie verwendet wird, sollte gleich sein. Aufgrund von Schwankungen in der Verfügbarkeit von vollständig isoliertem PBMC zum Zeitpunkt jeder Studie haben sich die Autoren jedoch dafür entschieden, 2,5 x 10⁶, 4 x 10⁶oder 5 x 10⁶ PBMC in verschiedenen Studien zu verwenden. Obwohl dieser zweifache Unterschied in der verabreichten Menge an PBMCs den Grad der Humanisierung beeinflussen könnte, beobachten die Autoren keine signifikanten Unterschiede bei der Bewertung der Anti-Tumor-Effizienz der getesteten Immuntherapien.
3. Für PDXs-Einpfropftierung subkutan Tumorfragmente (3 x 3 x 3 mm³) in die rechte vordere Flanke von Tieren injizieren. Subkutan 200 l von 5 x 10⁶ PBMCs (100 l pro Seite) nach links und rechts des transplantierten Tumorfragments injizieren.
   HINWEIS: PDX-Tumorgewebe wurden in einer Matrigel-Lösung verabreicht, wie für die Zelllinienmodelle beschrieben.
4. Am Tag der Zellimpfung die Tiere nach dem Zufallsprinzip gruppieren und als geplantes Studienprotokoll behandeln.  Bewerten Sie die Anti-Tumor-Aktivität von Kandidatenmedikamenten, BGB-A317 (QW, i.p.) in diesem Fall bei den angegebenen Dosen in verschiedenen Tumormodellen.
   HINWEIS: Die drei menschlichen Krebszelllinien (d.h. A431 (Epidemoidkarzinom), SKOV3 (Eierstockkrebs) und SK-MES-1 (Lungenkrebs)) sowie zwei PDX-Modelle (d.h. BCLU-054 (Lungenkrebs) und BCCO-028 (Darmkrebs)) gelten als gute Tumormodelle für die I-O-Therapie Auswertung in diesem humanisierten Mausmodell.
5. Messen Sie das primäre Tumorvolumen zweimal pro Woche mit einem Bremssattel.
   HINWEIS: Gand Körpergewichte Verlust wurden etwa 4-6 Wochen nach PBMC-Engraftment in unseren Studien beobachtet, so dass ein 1-2 Monate Zeit für therapeutische Wirksamkeit Bewertungen.
6. Für die pharmakodynamische Analyse von tumorinfiltrierten Immunzellen schneiden Sie das Tumorgewebe in kleine Stücke und verdauen Sie sie mit Kollagenase Typ I (1 mg/ml) und DNase I (100 g/ml) in RPMI1640 plus 5% fetalem Rinderserum (FBS) für 30 min bei 37 °C. Übergeben Sie das verdaute Gewebe durch 40 m Zellsiebe, um einzellige Suspensionen zu erhalten.
7. Waschen Sie die Zellen und passen Sie die Zellzahl auf eine Konzentration von 1 x 10⁷ Zellen/ml in eiskaltem FACS-Puffer (PBS, 1% FBS) in 96-gut runden Bodenplatten an. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugieren und blockieren Sie sie, indem Sie 30 min humanes IgG mit 20 g/ml humanem IgG hinzufügen, gefolgt von einer Färbung mit antihumanen CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) und PD-1 (MIH4) Antikörpern bei 4 °C für 30 min. Dann die gefärbten Proben zytometrie nieren und mit guavaSoft 3.1.1 analysieren.

Ergebnisse

Nach den hier vorgestellten Verfahren wurde erfolgreich ein PBMC-basiertes humanisiertes Xenograft-Modell etabliert. Kurz gesagt, die CP-Myeloablationseffekte bei NOD/SCID-Mäusen wurden durch die Durchflusszytometrieanalyse von Neutrophilen- und Monozytenpopulationen nach der CP- und DS-Behandlung bestimmt (Abbildung 1). 100 mg/kg CP plus 125 mg/kg DS wurde als optimale Dosis bestimmt und in späteren Studien verwendet, da das Regime zu einer maximalen Erschöpfung von Neutrophilen und Mono...

Diskussion

Unser Wissen über Krebsentwicklung und -progression hat sich in den letzten Jahren deutlich weiterentwickelt, wobei der Schwerpunkt auf einem umfassenden Verständnis sowohl der Tumorzellen als auch der damit verbundenen Stroma liegt. Die Nutzung der Wirtsimmunmechanismen könnte eine größere Wirkung gegen Krebszellen hervorrufen, was eine vielversprechende Behandlungsstrategie darstellt. Murine Modelle mit intakten Maus-Immunsystem, wie syngene und GEM-Modelle, wurden weit verbreitet verwendet, um Checkpoint-vermitte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMC separation /cell culture
Histopaque-1077	Sigma	10771	Cell isolation
DMEM	Corning	10-013-CVR	Cell culture
DPBS	Corning	21-031-CVR	Cell culture
FBS	Corning	35-076-CV	Cell culture
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140-163	Cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-114	Cell culture
Matrigel	Corning	356237	CDX inoculation
FACS analysis
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	DN25	Sample preparation
Collagenase Type I	Sigma	C0130	Sample preparation
Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody	BioLegend	101206	FACS
Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody	BioLegend	128008	FACS
Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody	BioLegend	127614	FACS
Anti-human CD8 (OKT8) antibody	Sungene Biotech	H10082-11H	FACS
Anti-human CD279 (MIH4) antibody	eBioscience	12-9969-42	FACS
Anti-human CD3 (HIT3a) antibody	4A Biotech	--	FACS
Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer	Millipore	0500-4008	FACS
Tumor/PDX implantation /dosing / measurement
Cyclophosphamide	J&K	Cat#419656, CAS#6055-19-2	In vivo efficacy
Disulfiram	J&K	Cat#591123, CAS#97-77-8	In vivo efficacy
Syringe	BD	300841	CDX inoculation
Hypodermic needles (14 G)	Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd.	0.7*32 TW SB	PDX inoculation
Vernier Caliper (MarCal)	Mahr	16ER	Tumor measurement
IVC individual ventilated cages	Lingyunboji Ltd.	IVC-128	Animal facility
IHC
Leica ASP200 Vacuum tissue processor	Leica	ASP200	IHC
Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning	Leica	RM2235	IHC
Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module	Leica	EG1150 H	IHC
Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner	Leica	Ariol	IHC
Anti-human CD8 (EP334) antibody	ZSGB-Bio	ZA-0508	IHC
Anti-human PD1 [NAT105] antibody	Abcam	ab52587	IHC
Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody	Cell Signaling Technology	13684S	IHC
Polink-2 plus Polymer HRP Detection System	ZSGB-Bio	PV-9001/9002	IHC